免疫荧光细胞化学技术
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤细胞免疫荧光实验步骤简单实验步骤如下:1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时.2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟3.PBS洗净:3min＊34.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS5.PBS洗净:2＊5min6.羊血清封闭：３７度，２０分钟７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时８.４度PBS洗净，３min＊５次９.二抗３７度小于一小时１０.３７度PBS洗净，３＊５min凉干封片（封闭液ＰＨ８.５）活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备（一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清↓4℃ 30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min↓弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇↓4℃ 30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min↓加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液)↓FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)（二）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（三）注意事项1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
免疫荧光细胞化学技术
免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术就像是细胞世界里的一场绚丽灯光秀。
想象一下，细胞们不再是那些只能在显微镜下灰扑扑地被观察的小不点，而是摇身一变成为舞台上闪耀的明星。
这个技术就像是给细胞们穿上了五彩斑斓的荧光衣裳。
那些抗体就如同超级精确的裁缝，专门为细胞量身定制“荧光服饰”。
它们能精准地找到细胞上特定的蛋白质分子，就像最厉害的寻宝猎人，在细胞这个大迷宫里一下子就能锁定目标。
如果把细胞比作一个装满各种小物件的大盒子，免疫荧光细胞化学技术就是那盏超级亮的手电筒，一下子就能照出我们想要找到的特定小物件（也就是特定的蛋白）。
而且这个“手电筒”还特别炫酷，发出的是五颜六色的荧光。
它的检测过程就像是一场神秘的魔法仪式。
各种试剂在细胞周围穿梭，就像一群忙碌的小精灵，在为细胞打造独特的荧光效果。
有时候感觉那些荧光标记就像是细胞的秘密纹身，只不过这个纹身是为了让科学家们更好地了解细胞的秘密。
当我们在显微镜下看到被标记后的细胞时，那简直就像是看到了一个微观的梦幻星球。
那些发着荧光的细胞结构就像星球上独特的地貌，有明亮的山脉（可能是细胞膜），有闪烁的湖泊（或许是细胞质中的某些结构）。
这个技术还特别爱搞“微观cosplay”呢。
它能把细胞模仿成我们想要研究的各种状态，通过荧光标记的变化，就像细胞在说：“看，我现在是生病的状态啦”或者“我现在正在努力分裂繁殖呢”。
要是细胞会说话，它们肯定会对免疫荧光细胞化学技术又爱又恨。
爱的是它们可以借此展示自己独特的魅力，恨的是自己的小秘密都被这个技术暴露无遗。
在科学研究的大舞台上，免疫荧光细胞化学技术就像一个多才多艺的明星。
它既可以在基础医学研究里当主角，帮我们弄清楚细胞的正常生理机能；又能在疾病研究中大展身手，就像一个超级侦探，追踪那些病变细胞的蛛丝马迹。
不过这个技术有时候也有点小脾气。
如果操作不当，就像一个被打乱节奏的乐队，整个荧光标记就会乱套，给研究者们带来一堆头疼的问题。
免疫荧光法(免疫细胞化学)
免疫荧光法(免疫细胞化学)免疫荧光法（免疫细胞化学）免疫荧光法，也称为免疫细胞化学，是一种用于检测和定位特定分子在细胞或组织中的分布的技术。
该方法利用荧光标记的抗体与目标分子结合，通过显微镜观察荧光信号的发射来确定其位置。
本文将介绍免疫荧光法的基本原理，实验步骤和应用领域。
一、基本原理免疫荧光法依赖于抗原与抗体的特异性结合。
在免疫细胞化学中，荧光标记的抗体与靶分子结合后，可以通过激发荧光，从而使得靶分子在细胞或组织中可见。
这种荧光标记可以通过直接结合或间接结合实现。
直接结合法是将荧光染料直接与抗体结合，制备成荧光标记的抗体。
这种方法操作简单，适合用于单一标记物的检测，但可能导致染色反应无法控制甚至给靶分子造成损伤。
间接结合法则是利用第二抗体与一抗体结合，然后再将第二抗体与荧光标记结合。
这种方法可以使用多个不同的抗体，并能将多个目标同时检测，具有高度特异性和灵敏度。
但是，操作过程相对繁琐，需要较长时间。
二、实验步骤1. 样本制备：取得所需检测的细胞或组织样本，处理好固定和预处理的步骤。
例如，细胞需经过固定、渗透、洗涤等操作，组织则需进行切片和脱水等步骤。
预处理的目的是为了提高抗体的结合效率和信号强度。
2. 抗体染色：将标记了荧光的一抗体或一抗体与标记物结合的复合物加到预处理好的样本上，充分孵育，以实现抗原和抗体结合。
3. 清洗：将标本进行适当的冲洗，使未结合的抗体、标记物等被去除。
4. 结果观察：将标本放置在荧光显微镜下观察，通过不同波长的光源激发和发射荧光信号。
5. 形态学观察：根据样本的特点、形态学特征及标记染色的荧光信号，判断目标分子的定位和表达情况。
三、应用领域免疫荧光法在生物医学和生命科学领域中得到了广泛应用。
以下是其主要应用领域的一些例子：1. 免疫细胞凝集试验：用于检测抗原与抗体间的反应，如血型鉴定等。
2. 免疫组织化学：通过检测和定位特定分子在组织中的分布，来研究疾病的发生和发展机制，如肿瘤标记物的检测等。
免疫细胞化学实验技能总结概要
透明
置换组织内的脱水剂，为下一步的浸蜡起到桥梁作用； 二甲苯：是现在应用最广的一种透明剂，价格较便宜，不能 和水混合，遇水则变成乳白色浑浊，因此必完全脱水后才
能使用；易溶于酒精又能溶解石蜡，透明力强；
其最大的缺点是容易使组织收缩变硬变脆，所以组织不能在 其停留过久，透明时间视组织块的大小、性质而定；有的 组织如肌肉、肌腱、软骨、骨、皮肤、头皮及眼球等，不 宜用二甲苯透明，因组织过硬不易切片；长时间接触，对
粘膜有刺激作用。
浸蜡
（1）浸蜡的目的 置换组织中的透明剂，为包埋做准备。 （2）注意事项 温箱中的温度必须严格控制在60℃的范围，不能 超过60℃；浸蜡时间不宜过长。 浸蜡温度过高或时间过长使组织收缩过度收缩和脆 变。
价格昂 贵；有 毒
混合固定剂 （1）Bouin氏固定液：为常用的良好的固定剂，穿透速度快， 组织收缩性较小，固定均匀，固定后组织有适当的硬度， 对于切片和染色均有良好的效果。一般固定12~24小时，
固定后入70%酒精洗去苦味酸的黄色，在脱水时经各浓度
酒精也可洗去黄色。 （2）Carnoy液：渗透力强，特别适宜于固定染色体、肝糖、 粘液等一些较为细微的结构。显示DNA、RNA效果良好。 （3）改良Bouin氏固定液：此液对一般组织固定效果都很好， 固定时间为4~18小时，固定后直接放70%乙醇脱水，固定 时间较长对组织亦无损害。
(horseradish peroxidase)等。
标记同位素的称为 放射免疫法 ，常用的同位素有 3H 、
14C、32S和31P等。
讲解提纲
一、石蜡切片/冰冻切片
二、免疫酶/免疫荧光 三、酶联免疫吸附试验
（1）石蜡切片的制作
取材、固定 洗涤 酒精脱水
免疫荧光(单标和双标)注意事项及具体方法
免疫荧光（单标和双标）注意事项及具体方法一、技术简介免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
二、实验流程免疫荧光单标记方法免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。
但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。
具体染色方法如下。
1. 所需材料与试剂：a. 培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%-70%的细胞。
b. 一抗、FITC或TRITC标记的二抗。
c. 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃预冷20 min)。
d. 封闭液。
e. 0.01mol／LPBS缓冲液。
2. 染色方法：a. 取出培养有细胞的盖玻片或glass-bottom培养皿，用0.01MPBS洗2-3遍。
b. 加入0.3%的Tritonx-100，37℃，30 rain。
c. 加入4%多聚甲醛试问固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。
d. 正常阻断血清1:20封闭试问20-30 min，抑制IgG的非特异性结合。
阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
e. 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃过夜。
抗体以0.01mo/LPBS稀释（理想的抗体浓度需经试验而定）。
f. 用0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5min，0.01 M PBS洗5 rain。
PCR、Western blot、免疫组化(实验原理)
PCR实验原理：聚合酶链式反应简称PCR（Polymerase Chain Reaction）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性—低温退火—引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA 片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。
相比于细胞内复杂的DNA复制，PCR的反应体系相对较简单。
其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
反应体系包括cDNA模板、引物、dNTP、PCR缓冲液、Taq聚合酶等。
PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板—引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性—退火—延伸这三个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。
免疫荧光染色原理
免疫荧光染色原理免疫荧光染色是一种常用的细胞和组织免疫组化技术，利用特异性抗体与待检测的抗原结合，然后通过荧光标记的二抗或荧光标记的抗体来检测抗原的位置和分布。
免疫荧光染色技术具有高灵敏度、高特异性和高分辨率的优点，被广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
免疫荧光染色的原理主要包括抗原-抗体反应和荧光标记两个方面。
首先，抗原-抗体反应是免疫荧光染色的基础。
当抗原与特异性抗体结合时，会形成抗原-抗体复合物。
这种特异性结合是免疫荧光染色能够准确检测抗原位置和分布的关键。
在免疫组织化学中，通常会使用一抗与待检测的抗原结合，然后再使用荧光标记的二抗或荧光标记的抗体来检测抗原的位置和分布。
这种特异性的抗原-抗体反应使得免疫荧光染色能够在细胞和组织水平上准确地检测特定的抗原。
其次，荧光标记是免疫荧光染色的关键步骤。
荧光标记的二抗或荧光标记的抗体能够与抗原-抗体复合物结合，并产生荧光信号。
这种荧光信号可以通过荧光显微镜或荧光成像系统来观察和记录。
荧光标记的二抗通常会选择与一抗的宿主动物种不同的二抗，以避免交叉反应。
荧光标记的抗体通常会选择与待检测抗原特异结合的荧光标记物。
荧光标记的二抗或荧光标记的抗体的选择和使用对于免疫荧光染色的结果具有重要影响，需要根据具体的实验要求进行合理选择。
免疫荧光染色技术在生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用。
在细胞生物学中，免疫荧光染色可以用于检测细胞器的位置和分布，研究细胞信号转导通路和细胞功能。
在病理学中，免疫荧光染色可以用于诊断肿瘤、免疫性疾病和感染性疾病，为临床诊断提供重要的辅助信息。
总之，免疫荧光染色技术是一种重要的细胞和组织免疫组化技术，具有高灵敏度、高特异性和高分辨率的优点。
免疫荧光染色的原理包括抗原-抗体反应和荧光标记两个方面，通过特异性抗体与抗原的结合和荧光标记的二抗或荧光标记的抗体的使用，能够准确检测抗原的位置和分布。
免疫荧光染色技术在生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用前景，为科研和临床工作提供了重要的技术支持。
免疫荧光技术课件PPT课件
蛋白质相互作用研究
总结词
免疫荧光技术可用于研究蛋白质之间的 相互作用，揭示生命活动的分子机制。
VS
详细描述
利用两种不同颜色的荧光标记抗体分别与 两种蛋白质结合，通过荧光共振能量转移 等技术，可以观察到两种蛋白质在空间上 的接近程度，从而推断它们之间的相互作 用。
药物筛选与开发
总结词
免疫荧光技术可用于药物筛选和开发过程中，评估药物对细胞或组织的影响。
多模态成像融合
将免疫荧光技术与光声成像、光学相干成像等其他成像技 术融合，实现多模态、多维度的生物分子成像，将有助于 更全面地了解生物样本的结构和功能。
临床应用转化
加强免疫荧光技术的临床应用研究，将其应用于疾病的早 期诊断、疗效评估和预后判断等领域，提高临床诊疗水平。
THANKS
感谢观看
研究和发展新的抗体和荧光标记技术，提高免疫荧光技术的灵敏度 和特异性，降低假阳性结果。
多标记检测
实现多标记免疫荧光技术，能够在同一样品上同时检测多种目标分 子，提高实验的信息量。
05
免疫荧光技术的应用实例
细胞内抗原定位
总结词
通过免疫荧光技术，可以精确定位细胞内的抗原，有助于研究细胞结构和功能。
详细描述
抗体
结合方式
荧光物质通过化学键与抗体结合，形 成荧光抗体，这种荧光抗体可以特异 性地结合抗原，形成抗原-抗体-荧光 抗体的复合物。
抗体是免疫系统产生的一种蛋白质， 能够特异性地结合抗原，形成抗原-抗 体复合物。
荧光信号的激发与检测
激发方式
荧光信号的激发通常采用特定波 长的光，如紫外光或蓝紫光，这 些光能够激发荧光物质发出可见
光。
检测设备
检测设备通常采用荧光显微镜， 能够检测到荧光信号并对其进行
免疫荧光组织(细胞)化学染色方法
免疫荧光组织（细胞）化学染色方法免疫荧光组织（细胞）化学染色方法：直接法基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸H37℃温箱等。
试验步骤1、滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持肯定湿度。
2、滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全掩盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温肯定时间（参考：30min）。
3、取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按挨次过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4、取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片掩盖。
5、马上用荧光显微镜观看。
观看标本的特异性荧光强度，一般可用"+'表示：（-）无荧光；（）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清晰可见；（++）荧光光明；（+++ --++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达"++'以上，而各种对比显示为（）或（-），即可判定为阳性。
留意事项1、对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有肯定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观看。
2、染色的温度和时间需要依据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。
免疫荧光法(免疫细胞化学)
免疫荧光法(免疫细胞化学)免疫荧光法，又称免疫细胞化学，是一种常用于检测生物组织或细胞中特定抗原的方法。
该方法基于抗体和抗原的特异性结合，通过标记荧光物质使抗原在显微镜下可见，从而实现对抗原的定位和分析。
免疫荧光法在医学诊断、生物研究和疾病治疗方面具有广泛的应用。
免疫荧光法主要有间接免疫荧光法和直接免疫荧光法两种常用的技术路线。
在间接免疫荧光法中，首先与待检测物质结合的主抗体通过蛋白A或其他特异性标记物结合于抗体上，然后将荧光染料标记的二抗与主抗体结合。
而在直接免疫荧光法中，待检测物质直接与荧光染料标记的主抗体结合。
免疫荧光法具有以下特点和优势。
首先，该方法可以实现高度特异性的抗原-抗体结合，提供了对生物组织或细胞中特定分子的具体定位。
其次，免疫荧光法能够同时检测多个抗原，通过使用不同的荧光染料标记不同的抗体。
这种多重染色技术为研究者提供了同时观察多种分子相互作用和定位的能力，有助于深入了解生物进程。
此外，免疫荧光法对样本的要求较低，可以应用于多种类型的样本，包括细胞培养、组织切片和体液等。
免疫荧光法在多个领域中发挥重要作用。
在医学诊断中，它常用于检测感染病原体、肿瘤标志物和自身免疫性疾病等。
例如，通过特定抗体的荧光染色，医生可以确定细菌或病毒是否存在，并根据染色的位置和强度进行病理诊断。
在生物研究中，免疫荧光法广泛应用于蛋白质定位、细胞信号传导和分子相互作用的研究。
此外，免疫荧光法还常被用于疫苗研发和疾病治疗中，通过精确定位抗原和荧光下标记药物，为新药的研发打下基础。
总之，免疫荧光法作为一种重要的实验技术，凭借其高度特异性、多重染色和样本适应性等优势，为生物学研究、医学诊断和药物开发提供了强有力的工具。
不断的技术创新和方法改进将进一步推动免疫荧光法在各个领域的应用，并为深入理解生物系统和疾病机理提供重要支持。
免疫荧光组织(细胞)化学技术：如何设置对照(直接法、间接法和
免疫荧光组织（细胞）化学技术：如何设置对照（直接法、间接法和
为了保证免疫荧光组织化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，
必须在初次试验时设置对照：
1、直接法
（1）标本自发荧光对照
标本只加PBS或缓冲甘油封片，荧光显微镜观察组织内如果有荧光，称
为自发荧光。
（2）抑制试验
可分为一步方法和二步方法。
一步抑制方法：先将荧光抗体与过量未标记特异性抗体作等量混合，
再加在标本上染色，结果应为阴性。
二步抑制方法：标本先加未标记的特异性抗体，水洗后再加标记荧光
抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。
（3）阳性对照
用已知阳性标本做直接法免疫荧光组织化学染色，结果应呈阳性荧光。
如对照1和2无荧光或弱荧光，3待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。
2、间接法
（1）自发荧光对照：同直接法。
（2）荧光抗体对照：标本只加间接荧光抗体染色，结果阴性。
（3）抑制试验：同直接法。
（4）阳性对照：同直接法。
结果：如对照（1）、（2）、（3）均呈阴性，阳性对照和待检标本呈阳性荧光则为特异性荧光。
3、补体法
（1）自发荧光对照
（2）荧光抗体对照
（3）抑制试验
（4）补体对照：取新鲜豚鼠血清1:10稀释，先作用于标本，洗后再用抗补体荧光抗体染色，结果阴性。
（5）抑制试验：标本加灭活的第一抗体，再加1:10稀释的新鲜豚鼠血清孵育后，再加未标记的抗补体血清与抗补体荧光抗体等量混合稀释
液，结果应为阴性。
（6）阳性对照。
（1）~（5）结果阴性，（6）待检标本阳性时，则为特异性荧光。
免疫荧光实验原理及其步骤
免疫荧光实验原理及其步骤免疫荧光实验是一种常用的生物学实验技术，用于检测和定位细胞或组织中特定的抗原或抗体。
其原理是利用荧光染料与抗原或抗体结合形成复合物，然后通过荧光显微镜观察荧光信号的强度和位置，从而确定目标物的存在和分布情况。
下面将详细介绍免疫荧光实验的步骤及其原理。
免疫荧光实验的步骤一般分为样品处理、抗体处理、荧光染色和观察四个主要步骤。
第一步是样品处理。
首先需要选择合适的样品，可以是细胞培养物、组织切片或动物体内的器官等。
样品处理的目的是使样品适应实验条件并提取目标物，一般包括固定、脱水和透明化等步骤。
固定可以采用乙醛或甲醛等化学物质，使细胞或组织保持形态结构。
脱水和透明化则是为了去除样品中的水分，并使其透明以便于观察。
第二步是抗体处理。
根据实验的需要，可以选择针对目标物的一抗或二抗进行处理。
一抗是指对目标物抗原的特异性抗体，二抗是指对一抗特异性结合的抗体。
抗体处理的目的是使抗体与目标物结合形成复合物，一般需要在适当的温度和时间下进行孵育。
在进行抗体处理之前，需要对样品进行预处理，如孵育样品以降低非特异性结合等。
第三步是荧光染色。
荧光染色是利用荧光染料标记抗体，以便于荧光显微镜观察。
常用的荧光染料有荧光素（fluorescein）和罗丹明（rhodamine）等。
荧光染色的原理是荧光染料与抗体结合后发射荧光信号，通过荧光显微镜可以观察到目标物的荧光信号。
荧光染色的过程包括将荧光染料溶液加入样品中，与抗体发生特异性结合，并进行洗涤以去除未结合的荧光染料。
最后一步是观察。
观察是通过荧光显微镜观察样品中的荧光信号，从而确定目标物的存在和分布情况。
观察时需要选择适当的荧光滤光片和荧光显微镜参数，以便于观察到荧光信号的强度和位置。
观察结果可以通过摄影或记录视频等方式保存下来，以便进一步分析和研究。
免疫荧光实验的原理基于抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够诱导机体产生免疫应答的物质，可以是细菌、病毒、细胞表面的蛋白质等。
细胞免疫荧光原理
细胞免疫荧光原理细胞免疫荧光技术是一种基于抗体与标记物相互作用的技术。
它通过特异性的抗体与细胞表面或细胞内分子结合，再通过标记物在荧光显微镜下进行观察。
这种技术被广泛应用于生命科学领域中的各种研究，如分子生物学、细胞生物学、免疫学等。
细胞免疫荧光原理主要是指在细胞或组织环境下，利用抗体与特定抗原相互作用的原理进行荧光素标记物的可视化检测。
细胞免疫荧光标记物主要包括荧光素、有机染料和荧光蛋白等，其中荧光蛋白标记肿瘤生物标志物是一种较为常见的应用方式。
细胞免疫荧光技术的基本原理是将含有特异性抗体的荧光素标记物与样品中含有的目标抗原结合。
在细胞免疫荧光实验中，有两种重要类型的抗体，一种是初级抗体，另一种则是次生抗体。
初级抗体可以识别目标抗原，而次生抗体则与初级抗体结合，并标记上荧光素。
次生抗体的荧光素通常比初级抗体标记的要大、更鲜艳，用荧光显微镜观察时易于检测。
细胞免疫荧光技术的应用有很多，其中最常见的是免疫细胞化学和免疫组织化学。
对于细胞免疫荧光技术的应用，研究人员通常需要选择适当的抗体和荧光素标记物。
在实验过程中，可以利用冷光源或者荧光染色物的光激发器来激发标记物，从而进行肿瘤生物标志物荧光标记。
细胞免疫荧光技术是一项非常灵敏的技术。
在肿瘤标志物研究方面，单细胞免疫荧光技术可用于检测很低浓度的癌症细胞。
这种技术仍然需要解决许多问题，如荧光染料的稳定性和特异性等问题。
细胞免疫荧光技术在医学、生物学、免疫学等领域中被广泛应用，为疾病诊断和治疗提供了重要的帮助。
在免疫学研究中，细胞免疫荧光技术可用于分析各种样品中的抗体特异性和亚型。
利用荧光素标记的次生抗体，可以观察抗体结合到细胞的表面或细胞内分子。
该技术还可用于检测新型病原体感染，利用抗体标记技术检测新型冠状病毒和流感病毒的感染情况。
在细胞生物学研究中，细胞免疫荧光技术常用于研究细胞内分子的分布和运动。
研究人员可以利用细胞荧光蛋白标记技术，观察特定蛋白在细胞内的分布和运动，以研究蛋白质功能。
ifa免疫荧光原理
ifa免疫荧光原理IFA免疫荧光技术是一种荧光成像诊断技术，被广泛用于医学领域、生物化学领域和生物学领域。
IFA技术是在细胞水平发挥作用的，该技术利用荧光抗体与特定蛋白结合，以显微镜观察其荧光分布，从而检测出不同种类的病原体或分子。
IFA免疫荧光技术分为直接免疫荧光和间接免疫荧光两种方法。
直接IFA是在细胞表面中直接检测抗原，而间接IFA则是在细胞表面结合抗原的抗体上检测荧光标记的辅助抗体。
该技术有许多优点，包括高灵敏度、高特异性和低荧光干扰。
IFA适用于不同类型的标本，如细胞、组织和体液，并可应用于多种疾病的诊断，如感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤等。
IFA技术的原理是将荧光标记的抗体与特定蛋白或病原体结合，然后通过荧光显微镜直接观察标本中的荧光信号。
该技术适用于分子、细胞和组织中各种蛋白的检测，并可以检测出有机分子中的特定化合物。
在IFA中，常用的荧光标记有荧光素（FITC）、罗丹明、乳蛋白标记荧光素（FLP）和内源性荧光素。
抗原结合到荧光标记的抗体上后，产生的荧光信号可以被荧光显微镜所观察到。
在直接IFA中，特定抗体与荧光标记结合，直接与样品中的抗原结合。
在间接IFA中，第一抗体被用来结合样品中的目标抗原，然后荧光标记的第二抗体与第一抗体结合。
IFA技术的应用广泛，如在医学领域用于病原体的检测和诊断、病毒感染的检测、自身免疫性疾病的检测和监测等。
在环境科学中也可以用IFA技术检测污染物质、生物毒素及其他有机分子。
在生物学、细胞学和分子生物学领域中，IFA可以用于特定分子的定位和定量。
IFA免疫荧光技术是一种非常有用的分析方法，广泛用于研究和诊断生物和化学问题。
它的原理简单，应用范围广泛，在未来可能会被更广泛地应用于各种生物医学领域中。
IFA技术是细胞和分子生物学中应用最广泛的一种标记技术，也是目前从事免疫学研究和临床诊断的必备技能之一。
在细胞学和分子生物学中，IFA技术被用于分析蛋白质的分子结构和生物学功能，如鉴定细胞膜上的特定受体，鉴定蛋白质的亚细胞定位，检测蛋白质相互作用等。
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免疫荧光细胞化学技术
免疫荧光细胞化学技术
(immunofluorescence cytochemistry)
采用荧光素标记的已知抗体或抗原作为探针， 检测待测细胞或组织内的靶抗原或抗体，形成带有荧 光素的抗原抗体复合物。利用荧光显微镜观察标本， 根据组织细胞中荧光物质的存在，确定抗原或抗体的 性质并定位，以及利用定量技术测定含量。
最大吸收光谱：490～495nm， 最大发射光谱：520～530nm。 分子量：389.4KD
(2)四乙基罗达明(RB200)
褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。呈 明亮橙红色荧光。RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯，在碱性 条件下易与蛋白质的赖氨酸一氨基反应结合而标记在蛋白分子上。
二 荧光素
能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光素；
必须具备：吸收激发光的光能并发射荧光。
1 具备用于标记抗体的荧光素条件
(1) 应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易离解，而未
结合的色素及其降解产物易排除。 (2) (3) (4) (5) (6) 荧光效率高，与蛋白质结合后荧光素质量下降不多。 标记后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。 结合方法简便而快速，并且较稳定。 荧光素容易溶解，溶解后不会和其他物质发生化学反应。 荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。
(4) (5) (6) (7)
4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）---蓝色荧光 得克萨斯红（Texas red） 藻红素R 花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）…
四、荧光抗体的质量控制
主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。 1 特异性染色效价测定--与相应抗原标本染色
2 非特异性染色测定--与相类似抗原标本染色 3 吸收试验---在荧光抗体中加入过量抗原，吸收后再用相应抗
BP530-550 BP480-550
BA590
罗丹明
四甲基罗丹明异硫氰酸盐：荧光抗体观察 碘化丙啶：DNA
IG
DM565
BP520-550
BA580IF
DM600
BP545-580
BA610IF
德克萨斯红：荧光抗体观察
3 使用荧光显微镜注意事项
(1)应在暗室中进行检查。汞灯点燃5-15min，光源稳定后观察； (2)防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜； (3)检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯强度逐 渐下降，荧光减弱；标本在紫外线照射3-5min后，荧光减弱；最 多不超2-3h; (4)荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间， 保护光源。光源关闭后必须在30min后才能再启动光源，一天中
（6）荧光素不纯，标本固定不当等。
八、 免疫荧光细胞化学的对照染色
为了排除某些非特异性染色，保证免疫荧光细胞化学 染色的准确性，必须在初次试验时进行以上对照试验， 从而检测抗原与抗体的结合是否是特异的。常用对照如 下： 阳性对照 阴性对照 自发荧光对照
1 阳性对照
用已知存在某相应抗原组织标本染色，结果为阳性
阴性对照：用正常血清代替一抗，其余步骤同上。
结果 荧光处即阳性细胞分布部位。
4 双重免疫荧光染色法
适用：在同一细胞组织标本上需要同时显示两种抗原。 方法：如A抗原的抗体--- FITC 标记， B抗原的抗体--- RB200标记。 (1)一步双染法 将两种标记抗体按适当比例混合（A+B)； 直接法进行染色反应。 (2)二步双染法 先用RB200标记的B抗体,不必洗去； 再用FITC标记的A抗体染色； 按间接法进行。
主要内容
一、荧光的特征
二、荧光素
三、荧光素标记抗体的方法 四、荧光抗体的质量鉴定 五、免疫荧光组化染色方法 六、荧光显微镜
七、非特异性荧光的消除方法
八、免疫荧光细胞化学的对照染色
一、荧光的特征
分子都含有电子，电子在不停地运动着。根据量子理论，运 动着的电子可以处于一系列不连续的能量状态中，电子遵守一定的规则， 要以从一个能级向另一能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能量 的吸收或释放。
最大吸收光谱:570nm 最大发射光谱:596～600nm 分子量：580KD
(3)四甲基异硫氰酸罗达明(TMRITC)
紫红色粉末，罗达明的衍生物，易溶于水，性质较稳定。呈橙红色荧 光，与FITC的黄绿色荧光对比清晰，与蛋白质结合方式同FITC。它可 用于双标记示踪研究。
最大吸收光谱:550nm
最大发射光谱:620nm
阴性对照：采用正常血清染色，结果为阴性。
2 间接法
（1）基本原理 先用未标记特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此 抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞 抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。 优点：只需制备一种荧光抗体可检出多种抗原，敏感性较高，能解决一 些不易制备动物免疫血清的病原体（麻疹）等的研究和检查，广泛应用于自 身抗体和感染病人血清的检验。 缺点：非特异性着色机会较多，染色时间长。
激发: 当电子吸收能量跃迁到较高能 级，这个过程叫激发。
发射: 以辐射方式跃迁时，能量转化 成相应波长的光，这个过程叫发射。
荧光 (fluorescence)
跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重 激发态以辐射方式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短， 发射持续的时间也很短，这种发射光，叫荧光。 即指一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引起发光，停止能量供 给，发光也瞬时停止(一般持续lO-7～lO-8s)。
应避免数次点燃光源；
(5)标本染色后应立即观察。
4 荧光图像的记录方法
荧光图像：具有形态学特征、荧光的颜色和亮度 荧光显微镜摄影： 基本同普通显微镜摄影技术 高速感光胶片如ASA200以上或24 ℃以上 半自动或全自动显微摄影系统装置，或CCD与计 算机联接， 将图像存在软盘上 缺点：紫外光对荧光猝灭作用大（如FITC标记物，紫外光照 射30s，荧光亮度降低50%），曝光速度要求高。
BA475
儿茶酚胺观察
芥子喹吖因；染色体 硫磺素S：淋巴细胞 吖淀黄素：核酸
B
DM500
BP450-480 BP470-490
BP420-480
BA515
异硫氰酸荧光素：荧光抗体观察 吖啶橙：DNA，RNA
金胺结核杆菌
IB
DM505
PB460-490 BP470-490
BA515IF
G
DM570
BP510-550
五、荧光抗体染色方法 适用标本：涂片、印片、细胞单层培养物或组织切片， 经适当固定或不固定； 方法：直接法、间接法
1 直接法 （1）基本原理 用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧 光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显 微镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。 特点：适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质 抗原如肾、皮肤的检查和研究。但一种荧光抗体只能检查一种 抗原，敏感性较低
2 阴性对照
(1)空白细胞对照
(2)抑制实验 用未标记荧光素的抗体与标本内相应靶抗原反应，然后再 加入用荧光素标记的相同抗体进行染色反应，结果应为阴性。
(3)抗原对照
用确知不存在某相应抗原的标本染色。
3 自发荧光对照
标本只加PBS或不加PBS。
结 束
原
标本染色，结果无明显阳性荧光。 4 F/P比值的测定方法
F（荧光素）和P（抗体蛋白）的克分子比值反映荧光抗体的特异 性染色质量， F/P=1-2，
过高------非特异染色增强； 过低------荧光很弱，降低敏感性。
荧光抗体的保存
0-4℃或-20℃低温保存，防止抗体活性降低和蛋白变性； 小量分装； 真空干燥后更易长期保存。
（1）光源 光源的亮度应根据荧光素的类型选择。小功率汞灯可满足激励 一般荧光染料的要求。 （2）滤板系统：包括激发滤片，阻断滤片、隔热滤片，分光镜 和其他中性滤片。是荧光显微镜的重要组成部分，是获得特定 波长光，清晰的荧光影像和发挥显微镜最佳性能之关键。了解 滤片性能，正确地选择滤片是观察荧光效应的前提和必要条件。
结果： A抗原呈黄绿色荧光； B抗原呈桔红色荧光。
5 膜抗原荧光抗体染色方法
原理和步骤：直接法或间接法； 适用：可对活细胞在试管内进行染色，常用于T和B细胞、细 胞培养物、瘤细胞抗原、受体等。 结果：阳性荧光主要在细胞膜上。
六、荧光显微镜检查方法
1 荧光显微镜 超高压光源、滤板系统(包括激发和压制滤板)、光学系统和 摄影系统等主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发 射荧光。
2 荧光素的种类：
(1)异硫氰酸荧光素(FITC)
呈黄色、橙黄或褐黄色粉末或结晶，性质稳定，在室温下能保存2年以 上，在低温中可保存多年。易溶于水和酒精。呈现黄绿色荧光。 在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨 基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键,成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。 一个IgG分子最多能标记15-20个FITC分子
七、非特异性染色的产生
产生的原因：
（1）部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物. （2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与
组织成分结合。
（3）组织中还可能存在类属抗原与相应抗体结合。 （4）制备的免疫血清中混杂抗其他组织成分的抗体。 （5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，过量标记的抗体分子带 过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。
荧光显微镜的滤片系统
激励法
U
分光镜
DM400
激发滤光片
BP330-385 BP360-370