免疫荧光细胞化学技术

二 荧光素
能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光素；
必须具备：吸收激发光的光能并发射荧光。
1 具备用于标记抗体的荧光素条件
(1) 应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易离解，而未
结合的色素及其降解产物易排除。 (2) (3) (4) (5) (6) 荧光效率高，与蛋白质结合后荧光素质量下降不多。 标记后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。 结合方法简便而快速，并且较稳定。 荧光素容易溶解，溶解后不会和其他物质发生化学反应。 荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。
免疫荧光细胞化学技术
包括荧光抗体法和荧光抗原法
荧光抗体法：
用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法。 较常用
荧光抗原法：
用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法。
荧光抗体法+荧光抗原法=免疫荧光细胞（组织）技术
免疫荧光细胞化学方法：
直接法、间接法
免疫荧光染色标本制备：
涂片、印片、细胞单层培养物、组织切 片…… 经适当固定后染色，或不固定直接染色。


七、非特异性染色的产生
产生的原因：
（1）部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物. （2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与
组织成分结合。
（3）组织中还可能存在类属抗原与相应抗体结合。 （4）制备的免疫血清中混杂抗其他组织成分的抗体。 （5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，过量标记的抗体分子带 过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。
阴性对照：采用正常血清染色，结果为阴性。
2 间接法
（1）基本原理 先用未标记特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此 抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞 抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。 优点：只需制备一种荧光抗体可检出多种抗原，敏感性较高，能解决一 些不易制备动物免疫血清的病原体（麻疹）等的研究和检查，广泛应用于自 身抗体和感染病人血清的检验。 缺点：非特异性着色机会较多，染色时间长。
最大吸收光谱：490～495nm， 最大发射光谱：520～530nm。 分子量：389.4KD

(2)四乙基罗达明(RB200)
褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。呈 明亮橙红色荧光。RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯，在碱性 条件下易与蛋白质的赖氨酸一氨基反应结合而标记在蛋白分子上。
主要内容
一、荧光的特征
二、荧光素
三、荧光素标记抗体的方法 四、荧光抗体的质量鉴定 五、免疫荧光组化染色方法 六、荧光显微镜
七、非特异性荧光的消除方法
八、免疫荧光细胞化学的对照染色
一、荧光的特征
分子都含有电子，电子在不停地运动着。根据量子理论，运 动着的电子可以处于一系列不连续的能量状态中，电子遵守一定的规则， 要以从一个能级向另一能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能量 的吸收或释放。
BA475
儿茶酚胺观察
芥子喹吖因；染色体 硫磺素S：淋巴细胞 吖淀黄素：核酸
B
DM500
BP450-480 BP470-490
BP420-480
BA515
异硫氰酸荧光素：荧光抗体观察 吖啶橙：DNA，RNA
金胺结核杆菌
IB
DM505
PB460-490 BP470-490
BA515IF
G
DM570
BP510-550
激发: 当电子吸收能量跃迁到较高能 级，这个过程叫激发。
发射: 以辐射方式跃迁时，能量转化 成相应波长的光，这个过程叫发射。

荧光 (fluorescence)
跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重 激发态以辐射方式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短， 发射持续的时间也很短，这种发射光，叫荧光。 即指一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引起发光，停止能量供 给，发光也瞬时停止(一般持续lO-7～lO-8s)。
阴性对照：用正常血清代替一抗，其余步骤同上。
结果 荧光处即阳性细胞分布部位。
4 双重免疫荧光染色法
适用：在同一细胞组织标本上需要同时显示两种抗原。 方法：如A抗原的抗体--- FITC 标记， B抗原的抗体--- RB200标记。 (1)一步双染法 将两种标记抗体按适当比例混合（A+B)； 直接法进行染色反应。 (2)二步双染法 先用RB200标记的B抗体,不必洗去； 再用FITC标记的A抗体染色； 按间接法进行。


应避免数次点燃光源；
(5)标本染色后应立即观察。
4 荧光图像的记录方法

荧光图像：具有形态学特征、荧光的颜色和亮度 荧光显微镜摄影： 基本同普通显微镜摄影技术 高速感光胶片如ASA200以上或24 ℃以上 半自动或全自动显微摄影系统装置，或CCD与计 算机联接， 将图像存在软盘上 缺点：紫外光对荧光猝灭作用大（如FITC标记物，紫外光照 射30s，荧光亮度降低50%），曝光速度要求高。
（1）光源 光源的亮度应根据荧光素的类型选择。小功率汞灯可满足激励 一般荧光染料的要求。 （2）滤板系统：包括激发滤片，阻断滤片、隔热滤片，分光镜 和其他中性滤片。是荧光显微镜的重要组成部分，是获得特定 波长光，清晰的荧光影像和发挥显微镜最佳性能之关键。了解 滤片性能，正确地选择滤片是观察荧光效应的前提和必要条件。
原
标本染色，结果无明显阳性荧光。 4 F/P比值的测定方法
F（荧光素）和P（抗体蛋白）的克分子比值反映荧光抗体的特异 性染色质量， F/P=1-2，
过高------非特异染色增强； 过低------荧光很弱，降低敏感性。
荧光抗体的保存

0-4℃或-20℃低温保存，防止抗体活性降低和蛋白变性； 小量分装； 真空干燥后更易长期保存。
BP530-550 BP480-550
BA590
罗丹明
四甲基罗丹明异硫氰酸盐：荧光抗体观察 碘化丙啶：DNA
IG
DM565
BP520-550
BA580IF
DM600
BP545-580
BA610IF
德克萨斯红：荧光抗体观察

3 使用荧光显微镜注意事项
(1)应在暗室中进行检查。汞灯点燃5-15min，光源稳定后观察； (2)防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜； (3)检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯强度逐 渐下降，荧光减弱；标本在紫外线照射3-5min后，荧光减弱；最 多不超2-3h; (4)荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间， 保护光源。光源关闭后必须在30min后才能再启动光源，一天中
结果： A抗原呈黄绿色荧光； B抗原呈桔红色荧光。
5 膜抗原荧光抗体染色方法


原理和步骤：直接法或间接法； 适用：可对活细胞在试管内进行染色，常用于T和B细胞、细 胞培养物、瘤细胞抗原、受体等。 结果：阳性荧光主要在细胞膜上。

六、荧光显微镜检查方法
1 荧光显微镜 超高压光源、滤板系统(包括激发和压制滤板)、光学系统和 摄影系统等主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发 射荧光。
五、荧光抗体染色方法 适用标本：涂片、印片、细胞单层培养物或组织切片， 经适当固定或不固定； 方法：直接法、间接法
1 直接法 （1）基本原理 用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧 光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显 微镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。 特点：适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质 抗原如肾、皮肤的检查和研究。但一种荧光抗体只能检查一种 抗原，敏感性较低
荧光显微镜的滤片系统
激励法
U
分光镜
DM400
激发滤光片
BP330-385 BP360-370
截止滤光片
BA420
用途
自动荧光观察法，DAPI(联脒基吲哚)：DNA Hoechest 33358,33342染色体
V
BV
DM455
DM455
BP400-410
BP400-440 BP4百度文库0-440
BA455
2 阴性对照
(1)空白细胞对照
(2)抑制实验 用未标记荧光素的抗体与标本内相应靶抗原反应，然后再 加入用荧光素标记的相同抗体进行染色反应，结果应为阴性。
(3)抗原对照
用确知不存在某相应抗原的标本染色。
3 自发荧光对照
标本只加PBS或不加PBS。
结 束
第四章
免疫荧光细胞化学技术
免疫荧光细胞化学技术
(immunofluorescence cytochemistry)
采用荧光素标记的已知抗体或抗原作为探针， 检测待测细胞或组织内的靶抗原或抗体，形成带有荧 光素的抗原抗体复合物。利用荧光显微镜观察标本， 根据组织细胞中荧光物质的存在，确定抗原或抗体的 性质并定位，以及利用定量技术测定含量。
(4) (5) (6) (7)
4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）---蓝色荧光 得克萨斯红（Texas red） 藻红素R 花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）…

四、荧光抗体的质量控制
主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。 1 特异性染色效价测定--与相应抗原标本染色
2 非特异性染色测定--与相类似抗原标本染色 3 吸收试验---在荧光抗体中加入过量抗原，吸收后再用相应抗
（6）荧光素不纯，标本固定不当等。
八、 免疫荧光细胞化学的对照染色
为了排除某些非特异性染色，保证免疫荧光细胞化学 染色的准确性，必须在初次试验时进行以上对照试验， 从而检测抗原与抗体的结合是否是特异的。常用对照如 下： 阳性对照 阴性对照 自发荧光对照
1 阳性对照
用已知存在某相应抗原组织标本染色，结果为阳性
最大吸收光谱:570nm 最大发射光谱:596～600nm 分子量：580KD
(3)四甲基异硫氰酸罗达明(TMRITC)
紫红色粉末，罗达明的衍生物，易溶于水，性质较稳定。呈橙红色荧 光，与FITC的黄绿色荧光对比清晰，与蛋白质结合方式同FITC。它可 用于双标记示踪研究。
最大吸收光谱:550nm
最大发射光谱:620nm
2 荧光素的种类：
(1)异硫氰酸荧光素(FITC)
呈黄色、橙黄或褐黄色粉末或结晶，性质稳定，在室温下能保存2年以 上，在低温中可保存多年。易溶于水和酒精。呈现黄绿色荧光。 在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨 基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键,成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。 一个IgG分子最多能标记15-20个FITC分子