细胞增殖、凋亡、粘附的测定方法.

细胞增殖的检测方法：

四甲基偶氮唑盐法(MTT)

MTT 商品名为噻唑蓝，是一种黄色的染料。1983 年Mosmann 建立MTT比色法，用于检测细胞存活和增殖。其原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为不溶于水的蓝紫色结晶-甲瓒(formazan)并沉积在细胞中，而死亡的细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫分析仪测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数量范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。此方法已广泛用于各种细胞增殖的检测、肿瘤细胞的生长、生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定[4-8]等。此方法简便、灵敏且无放射性。

MTT 溶液需要放置在4℃避光保存，最好是现用现配。由于MTT 经还原所产生的产物甲瓒不溶于水，无法直接测定吸光度，需要被溶解之后才能检测。这不仅使工作量增加，而且MTT 溶液具有致癌性。需要注意的是，MTT 法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞的绝对数。另外，有研究发现过氧化物会降低MTT 测定的准确度，抑制将近95%的MTT 与O2－的反应，MTT 溶解产物甲瓒会吸附在纳米纤维上，而致使检测的结果呈现假阴性。

内盐法(MTS)

MTS 是一种新型的MTT 类似物。MTS 在偶联剂PMS 存在的条件下，可被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成水溶性的有色甲瓒产物，其颜色深浅与活细胞数量在一定范围内呈高度相关，可用酶标仪检测。它的优点在于无放射性、快速、安全、方便、灵活及特异性强，同时又克服了MTT、XTT 的缺点。此方法已应用于细胞增殖的检测、药物敏感性试验、细胞毒性的检测等，且比MTT 法更加准确。

此方法在一定程度上也存在缺陷。最新研究表明在96 孔板试验中，靠外的孔液体易蒸发，对检测结果有一定影响[24]，且不适合于猪淋巴细胞促有丝分裂反应的检测.

细胞粘附能力测定：

蛋白染料染色法测细胞粘附

本法是以蛋白染色剂如氨基黑10B来问接测定96孔板中的细胞数目，该法迅速可靠，还可用怍细胞形态学观察和染色细胞的照像。Schulz 等对入角化细胞株

HaCaT 受其亚克隆细胞株、鼠成纤维细胞林3T，，骨髓瘤细胞株x63一Ag8．653作过这方面的研究。即用甲醛或戊二醛固定粘附细胞，吹打去除未牯附的细胞而粘附的细胞用pH3，5的氨基黑染色，先用pH3．5～5的盐酸洗去附着的染料，结合的蛋白染料可用NaOH 溶解，然后在酶标仪上读取620rim／405或750rim处的OD值。若用该法反映未牯附和半粘附的细胞数量，可在染色前先离心t然后固定。该法测量表明，氨基黑的染色吸光度值与细胞数、DNA含量呈良好的线性关系，直线的回归斜率对不同的细胞而有所不同。另外、该法可用来测定某些药物的细胞毒作用、LAK细胞的杀伤作用以及杂交瘤抗体对细胞扩增的生物效应。E r]tt 曾用氟基黑染色法来问接反映24孔板上培养的细胞数，但其操作过程比较繁琐，如细胞固定，染色细胞蛋白质沉淀，多次温育、冲洗、离心、溶解变性强白，最后转移至比色杯中进行常规比色。而本法只需在96孔板上即可进行。实验结果重复性好，敏感性高，时间短，试剂便宜。但在测定某种细胞的粘附性时，必须先建立其细胞数与光密度值之问的回归曲线。因为某一特定细胞的直线回归斜率与该种细胞的太小及其蛋白质的含量有关。氨基黑染色法不能区分死亡细胞与活的细胞，但是粘附生长的细胞一旦死亡。即可自行脱离吸附的介质，被吸出洗去。因此，需要用cr标记和其他物质拆记靶细胞测定粘附的试验太多可用该法代替。值得注意的是，死亡后仍能附着的细胞不能用氨基黑染色法测定粘附性这时可以选用中性红、MTT以及其他台适的染色方法。Joni 曾用氨基黑染色法测定细胞弱粘附特性-即最小切应力粘附测定(Minima[Sheariorce adhesion assay，MSFA)，其步骤与常规的粘附测定方法基本一致。不同之处是去除未粘附细胞时，在液体中用轻柔的切应力去除未粘附的细胞，这样强粘附与弱粘附的细胞可同时被测定。MSFA法去除非粘附细胞的操作方法如下：将孵育后台粘附细胞的96孔板扳孔朝上以一定角度浸入盛有0，85 Nacl盐液的容器中(容器中含液量约为2.5 升)然后在液体中轻轻反转培养板．避免板孔中形成气泡，使板孔向下板底向上，这时可使培养板从液体中升至液面，容器中的盐液用40ram 长的转子．以300rPm 的转速室温下搅动7分钟．这样板孔中未桔附的细胞可技去际96孔板从NaC[盐液容器中取出时，要重新翻转板孔向上，然后浸入含100 甲醇的容器中，在甲醇溶液中上下左右转动96孔板．使盐波和甲醇充分混台．切勿使细胞暴露于空气中，每过5分钟重复以上动作，60分钟后从甲醇液体中取出96孔板一去掉甲醇，染色细胞，酶标仪上读取570nm OD值一牯附率的计算用以下公式：

OD570粘附细胞

粘附率％＝————————————×100％

OD570孔中加入的总细胞

用该法测得的牯附率高于常规方法的2．5-3倍，而基础的非特异性粘附率不变。结晶紫染色：他是细胞核染色常用的，用来显示染色体的中心体，并可染淀粉、纤维蛋白、神经胶质等。凡是用番红和苏木精或其他染料染细胞核不能成功时，用它能得到良好的结果。用番红和结晶紫作染色体的二重染色，染色体染成红色，纺锤丝染成紫色，所以也是一种显示细胞分裂的优良染色剂。用结晶紫染纤毛，效果也很好。用结晶紫染色的切片，缺点是不易长久保存。

苏木精是淡黄色到锈紫色的结晶体，易溶于酒精，微溶于水和甘油，易溶于热水和热乙醇，溶于碱、氨和硼砂的溶液。它是染细胞核的优良材料，他能把细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色。分化时组织所染的颜色因处理的情况而异，用酸性溶液（如盐酸—酒精）分化后呈红色，水洗后仍恢复青蓝色，用碱性溶液（如氨水）分化后呈蓝色，水洗后呈蓝黑色。遇光变红。

Giemsa染色法：嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。

PH对细胞染色有影响。细胞各种成分均为蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下正电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正经片必须清洁，无酸碱污染。配制瑞特液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。

MTT

(l)接种细胞:用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞,用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制成单个细胞悬液,以每孔103一104个细胞接种于%孔板中(本实验所接种的细胞数是每孔2x103个细胞),每孔体积200ul,各组每个时相6孔,测量时取6孔OD 平均值。同时设不加细胞只加培养液的空白对照孔。(2)培养细胞:将培养板放入COZ孵箱,在37℃、5%COZ及饱和湿度条件下培养(培养时间取决于实验目的和要