细胞增殖、凋亡、粘附的测定方法.
细胞增殖检测方法
细胞增殖检测方法
细胞增殖是细胞数量的增加和分裂的过程，对于检测细胞增殖的方法有很多种。
以下是一些常见的细胞增殖检测方法：
1. 细胞计数：通过显微镜观察和手工计数细胞数量，或使用自动化细胞计数仪进行细胞计数。
2. 细胞增殖染料：使用细胞增殖染料，如溴化乙锭（BrdU）或五溴乙酰胺（EdU），将其添加到培养基中，然后检测细胞摄取或转化这些染料的程度，以评估细胞增殖。
3. MTT试验：MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基-2H-四唑酮）试验通过测量细胞的代谢活力来评估细胞增殖。
MTT试剂会被活细胞还原为紫色的甲基噻唑咪唑离子，可以使用分光光度计测量产生的紫色产物的吸光度来确定细胞的增殖能力。
4. 细胞周期分析：通过流式细胞术检测细胞的DNA含量，可以确定细胞处于哪个细胞周期阶段，并评估细胞的增殖能力。
5. 细胞增殖标记：通过使用荧光标记物或融合蛋白来标记增殖细胞。
例如，使用荧光标记的抗体来检测细胞核内的增殖相关标记物，如Ki-67。
6. 实时细胞分析：使用实时细胞分析系统，如X-Celligence系统，可以通过记录电极传感器阻抗的变化来监测细胞的生长和扩张情况，从而评估细胞增殖。
这些方法可以单独或结合使用，以获得更全面和准确的细胞增殖信息。
细胞增殖、凋亡、粘附的测定方法
细胞增殖的检测方法：四甲基偶氮唑盐法(MTT)MTT 商品名为噻唑蓝，是一种黄色的染料。
1983 年Mosmann 建立MTT比色法，用于检测细胞存活和增殖。
其原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为不溶于水的蓝紫色结晶-甲瓒(formazan)并沉积在细胞中，而死亡的细胞无此功能。
二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫分析仪测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数量范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
此方法已广泛用于各种细胞增殖的检测、肿瘤细胞的生长、生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定[4-8]等。
此方法简便、灵敏且无放射性。
MTT 溶液需要放置在4℃避光保存，最好是现用现配。
由于MTT 经还原所产生的产物甲瓒不溶于水，无法直接测定吸光度，需要被溶解之后才能检测。
这不仅使工作量增加，而且MTT 溶液具有致癌性。
需要注意的是，MTT 法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞的绝对数。
另外，有研究发现过氧化物会降低MTT 测定的准确度，抑制将近95%的MTT 与O2－的反应，MTT 溶解产物甲瓒会吸附在纳米纤维上，而致使检测的结果呈现假阴性。
内盐法(MTS)MTS 是一种新型的MTT 类似物。
MTS 在偶联剂PMS 存在的条件下，可被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成水溶性的有色甲瓒产物，其颜色深浅与活细胞数量在一定范围内呈高度相关，可用酶标仪检测。
它的优点在于无放射性、快速、安全、方便、灵活及特异性强，同时又克服了MTT、XTT 的缺点。
此方法已应用于细胞增殖的检测、药物敏感性试验、细胞毒性的检测等，且比MTT法更加准确。
此方法在一定程度上也存在缺陷。
最新研究表明在96 孔板试验中，靠外的孔液体易蒸发，对检测结果有一定影响[24]，且不适合于猪淋巴细胞促有丝分裂反应的检测.细胞粘附能力测定：蛋白染料染色法测细胞粘附本法是以蛋白染色剂如氨基黑10B来问接测定96孔板中的细胞数目，该法迅速可靠，还可用怍细胞形态学观察和染色细胞的照像。
细胞活力研究检测指标
细胞活力研究检测指标细胞活力研究通常涉及多种检测指标，以评估细胞的生理状态、代谢活性和功能。
以下是一些常见的检测指标：1. 细胞增殖能力：1)MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物）试验：通过测量活细胞中线粒体脱氢酶的活性来评估细胞增殖。
2)CCK-8（Cell Counting Kit-8）试验：类似于MTT，但使用水溶性四唑盐WST-8，减少了实验步骤。
3)BrdU（5-溴脱氧尿苷）掺入试验：通过检测BrdU在DNA合成期的掺入来评估细胞增殖。
2. 细胞存活率：1)细胞计数：直接使用血球计数板或自动细胞计数器计算活细胞数量。
2)台盼蓝染色：排除法，活细胞不会吸收台盼蓝，死细胞会被染成蓝色。
3. 细胞凋亡检测：1)Annexin V/PI染色：通过流式细胞仪检测细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻和细胞膜完整性来识别早期和晚期凋亡细胞。
2)TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记）试验：检测DNA断裂，是细胞凋亡的标志。
4. 细胞周期分析：流式细胞仪：使用PI或Hoechst染料对DNA进行染色，分析细胞周期分布。
5. 细胞代谢活性：1)ATP含量测定：ATP是细胞能量代谢的重要指标。
2)乳酸脱氢酶（LDH）释放：衡量细胞膜完整性和细胞损伤程度。
6. 氧化应激指标：1)ROS（活性氧物种）检测：使用荧光探针如DCFH-DA进行检测。
2)抗氧化酶活性：如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等。
7. 蛋白质和基因表达：1)Western blot：检测特定蛋白质的表达水平。
2)qPCR（实时定量聚合酶链反应）：检测特定基因的mRNA表达水平。
8. 细胞信号通路活性：磷酸化蛋白检测：通过Western blot检测特定蛋白的磷酸化状态来评估信号通路的激活。
9. 细胞粘附和迁移能力：1)划痕试验：评估细胞迁移能力。
2)侵袭和迁移试验：使用Transwell小室评估细胞的侵袭和迁移能力。
细胞功能检测
细胞功能检测细胞功能检测是指对生物样品中的细胞进行测试和分析，以评估其功能状态和活性水平。
这种检测可以用于研究细胞生理学、疾病诊断和治疗等领域。
下面介绍几种常见的细胞功能检测方法。
1. 细胞生存和增殖检测：这种检测方法可以评估细胞的生存能力和增殖速度。
常见的方法包括细胞计数、细胞活力和增殖指标的测定。
细胞计数可以用显微镜观察和细胞计数仪进行，细胞活力可以通过测定细胞色素c释放量、ATP产量等指标来评估，增殖指标包括细胞周期、有丝分裂指数等的测定。
2. 细胞凋亡检测：细胞凋亡是正常的细胞死亡过程，对维持组织结构和功能起着重要作用。
细胞凋亡的检测可以使用多种方法，如细胞凋亡标记物的染色、DNA片段化检测和细胞凋亡相关蛋白的测定等。
常用的染色方法有TUNEL法、AnnexinV染色法等，可以直接或间接地检测细胞凋亡的存在和程度。
3. 细胞分化检测：细胞分化是未分化细胞向特定细胞类型发育和成熟的过程。
细胞分化的检测可以通过测定特定分化标记物的表达来评估。
例如，神经细胞的分化可以通过检测神经元特异性标记物如神经元特异性聚糖、神经元特异性酶等的表达来判断。
4. 细胞迁移和侵袭检测：细胞迁移和侵袭是细胞在体内的基本生理过程，在肿瘤的发生和转移中具有重要的作用。
细胞迁移和侵袭能力的检测可以使用Transwell迁移实验、划痕愈合实验等方法，通过观察细胞通过细胞孔隙和划痕进入下一层细胞的能力来评估。
5. 细胞代谢功能检测：细胞代谢是维持细胞生命活动所必需的重要过程之一，包括能量代谢、蛋白质合成和降解、核酸代谢等。
细胞代谢功能的检测可以通过测定细胞中某些代谢产物的含量、酶活性的测定、氧化还原能力的测定等来评估。
细胞功能检测是实验生物学研究和临床医学诊断的重要手段之一。
通过细胞功能检测，人们可以了解细胞在不同条件下的功能状态和活性水平，从而更好地研究细胞生理学机制、发现新的疾病标记物和药物靶点，为疾病的诊断和治疗提供新的线索和方法。
细胞免疫学实验研究方法
细胞免疫学实验研究方法细胞免疫学是研究免疫系统中各种免疫细胞的发育、功能和相互作用的学科。
在细胞免疫学的研究中，科学家们使用各种实验方法来探索免疫细胞的特性和功能。
本文将介绍几种常见的细胞免疫学实验研究方法。
1. 流式细胞仪（Flow Cytometry）流式细胞仪是一种用于分析和计数细胞的仪器，可以检测细胞的表面标记物、细胞大小和形态等特征。
在流式细胞仪实验中，研究人员会将细胞样本与荧光标记的抗体一起孵育，然后通过仪器将细胞逐个通过激光束，测量细胞上荧光信号的强度。
通过分析细胞的荧光信号，可以确定不同细胞亚群的比例和特征。
2. 免疫组化（Immunohistochemistry）免疫组化是一种用于检测组织中特定抗原的方法。
在免疫组化实验中，研究人员会使用特异性抗体与组织切片中的抗原结合，然后通过染色或荧光标记来可视化抗原-抗体结合物。
这种方法可以用于检测免疫细胞在组织中的定位和数量，从而了解它们在免疫反应中的作用。
3. 细胞培养（Cell Culture）细胞培养是一种在体外人工培养细胞的方法，可以提供大量的细胞用于实验研究。
在细胞培养实验中，研究人员会将细胞样本放置在含有适当培养基的培养皿中，并提供适当的生长条件（温度、湿度、营养物等）。
通过细胞培养，可以研究免疫细胞的生长、增殖和分化过程，以及它们对各种刺激和药物的反应。
4. 免疫沉淀（Immunoprecipitation）免疫沉淀是一种用于分离和富集特定蛋白质的方法。
在免疫沉淀实验中，研究人员会使用特异性抗体与目标蛋白质结合，并通过沉淀抗体-蛋白质复合物来分离目标蛋白质。
通过免疫沉淀，可以研究免疫细胞中特定蛋白质的相互作用、修饰和功能。
5. 细胞增殖和凋亡检测（Cell Proliferation and Apoptosis Assays）细胞增殖和凋亡是免疫细胞的重要生理过程。
研究人员可以使用细胞增殖和凋亡检测试剂盒来评估细胞的增殖和凋亡情况。
细胞增殖 检测方法
细胞增殖检测方法细胞增殖是指细胞在生物体内不断分裂和繁殖的过程，是生物体生长和发育的基础。
检测细胞增殖的方法有很多种，以下将详细介绍几种常见的细胞增殖检测方法。
首先，细胞计数法是最常用的细胞增殖检测方法之一。
细胞计数法主要通过显微镜观察和数数的方式，计算细胞的数量来反映细胞增殖的情况。
可以通过细胞染色或细胞标记技术使细胞在显微镜下更易于观察和区分。
细胞计数法通常需要使用专业的细胞计数仪或显微相机来帮助实施，具有操作简单、结果准确等特点。
其次，MTT法是一种在体外细胞培养中常用的细胞增殖检测方法。
MTT法基于细胞中还原剂细胞线粒体呼吸将黄色硫代唑盐（MTT）还原为紫色的可溶性产物，最后通过比色法测定细胞数目和细胞活力。
MTT法操作简单、结果稳定可靠，广泛应用于药物筛选和细胞增殖研究中。
另外，细胞增殖标记法是通过标记DNA合成阶段的细胞来检测细胞增殖的方法。
常见的细胞增殖标记法有Brdu法和EDU法。
这两种方法都是通过标记新合成的DNA分子来反映细胞增殖情况，Brdu法利用抗体检测Brdu标记的DNA，而EDU法则利用稳定的EDU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）分子和荧光染料的结合来检测标记的DNA。
由于这两种方法都需要使用荧光染料或抗体检测，因此需要显微镜或流式细胞仪等设备来进行检测。
此外，细胞增殖检测还可以通过测定细胞凋亡（细胞死亡）来间接反映细胞增殖情况。
细胞凋亡是细胞自身程序性死亡的一种形式，常使用TUNEL（DNA末端标记术）法或Annexin V/PI双染法来检测细胞凋亡。
这些方法通过标记DNA 断裂或细胞膜破损来区分凋亡细胞和正常细胞，并通过荧光染料或抗体检测来反映细胞凋亡的程度。
细胞凋亡的明显增加往往意味着细胞增殖的受抑制。
总的来说，细胞增殖检测方法的选择应根据具体实验的目的、条件和资源来决定。
不同的方法各有优势和局限性，需要结合实际情况进行选择。
在细胞增殖检测中，细胞计数法是最常用的方法，MTT法和细胞增殖标记法是常见的体外检测方法，而通过检测细胞凋亡来间接反映细胞增殖情况也是一种有效的方法。
细胞凋亡的几种检测方法
细胞凋亡的几种检测方法本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March细胞凋亡的几种检测方法1、形态学观察方法（1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。
（2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。
凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
（3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。
如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。
此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
（4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。
2、 DNA凝胶电泳细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。
但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。
核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。
检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；2、在微定量板上吸附组蛋白体’3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’4、加酶的底物，测光吸收制。
如何在组织中检测细胞增殖,分化和凋亡
在组织中检测细胞增殖、分化与凋亡得方法一、检测细胞增殖得方法(1)直接方法:通过直接测定进行分裂得细胞来评价细胞得增殖能力1、胸腺嘧啶核苷(3H-ＴｄR)渗入法胸腺嘧啶核苷(TdR)就是ＤNA特有得碱基,也就是DＮＡ合成得必需物质、用同位素３H 标记TdＲ即3H—TdR作为ＤNA合成得前体能掺入DAN合成代谢过程,通过测定细胞得放射性强度,可以反映细胞DＡN得代谢及细胞增殖情况。
但就是具有放射性、2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CＦＳE)检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(ＣFＳE)就是一种可穿透细胞膜得荧光染料,具有与细胞特异性结合得琥珀酰亚胺脂基团与具有非酶促水解作用得羟基荧光素二醋酸盐基团,使ＣFＳE成为一种良好得细胞标记物。
ＣFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内得氨基结合偶联到细胞蛋白质上。
当细胞分裂时,CＦsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度就是亲代细胞得一半。
这样,在一个增殖得细胞群中,各连续代细胞得荧光强度呈对递减,利用流式细胞仪在48８nm激发光与荧光检测通道可对其进行分析、3、Ｂｒdu检测法Brｄｕ中文全名５—溴脱氧尿嘧啶核苷,为胸腺嘧啶得衍生物,可代替胸腺嘧啶在DＮＡ合成期(S期),活体注射或细胞培养加入,而后利用抗Brdu单克隆抗体,IＣＣ染色,显示增殖细胞。
同时结合其它细胞标记物,双重染色,可判断增殖细胞得种类,增殖速度,对研究细胞动力学有重要意义４、增殖标志检测有些抗原只存在于增殖细胞中,而非增值细胞缺乏这些抗原,您也可以通过特异性得单抗来对细胞增殖进行检测、例如,在人体细胞中,Ki—６7抗体识别同名蛋白,在细胞周期S期、G2期与M期表达,而在Ｇ0期与Ｇ1 期(非增殖期)不表达、用针对Ki-６7蛋白得单抗就可以检测细胞得增值情况、由于需要组织切片,这种方法无法进行高通量分析。
不过这一方法颇受癌症研究者们得青睐,因为它能够用来检测体内肿瘤细胞得增殖。
细胞凋亡与增殖的原位检测
荧光染料Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜， 使其染上低蓝色，而凋亡细胞的膜通透性增强，因 此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞 的多，荧光强度要比正常细胞中要高，此外，凋亡 细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染 料能更有效地与DNA结合，并且凋亡细胞膜上的 p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等都使 凋亡细胞的蓝色荧光增强。
结果观察
细胞体积缩小及变形；核浓染及丧失亚形态结 构，可见核染色质呈新月形，或核碎裂成大小 不等核碎片；在组织学切片中可见巨噬细胞或 邻近的上皮细胞吞噬凋亡细胞或凋亡小体的现 象。
凋亡小 体
Hoechst 33342染色
一．期细胞核呈波纹状 （rippled）或呈折缝样 （creased），部分染色质 出现浓缩状态；
原位测定细胞增生活性所测的结果都可 定量表示，大大避免了主观因素的影响， 成为定量病理学的重要组成部分。
PART ONE
各种方法相关性的比较研究表明核分裂 像计数、Ki67 LI、PCNA LI及AgNORs 计数等之间均有明显的相关性。
如果您的实验室暂时尚不具备现代实验条 件．只要有显微镜，只要您能准确识别核 分裂像，只要能避免那些影响重复性的因 素，在创新思想的设计下，即便使用最简 单的方法，也可取得有意义的结果。
（2）染色方法
可采用常规的组织学染色方法，如苏木素-伊红染 色，特殊染色如甲基绿-派诺宁染色、 Giemsa染 色。
二．采用荧光染料 Hoechst33342和Hoechst33358 DAPI （4’，6’—diamidino-2-
henylindole） PI （propidium iodide）
如何在组织中检测细胞增殖分化和凋亡
如何在组织中检测细胞增殖分化和凋亡在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡是研究细胞生物学、组织学和疾病发展的重要课题。
本文将介绍一些常用的方法和技术来检测这些细胞生理过程，包括免疫组化、细胞增殖标记、细胞凋亡检测和分化指标。
一、免疫组化方法免疫组化是一种常用的方法，可用于检测特定蛋白在组织中的表达。
该方法通过对细胞或组织片进行抗体染色，来检测目标蛋白的存在和定位。
在细胞增殖方面，可以使用细胞增殖标记抗体，如Ki-67和PCNA等，来标记正在活跃增殖的细胞。
对于分化指标，可以使用特定抗体来检测目标蛋白在细胞中的表达程度。
细胞凋亡方面，可通过检测凋亡标志蛋白，如Caspase家族成员和Bcl-2家族成员等，来确定凋亡的发生。
二、细胞增殖标记细胞增殖标记是一种直接或间接标记增殖细胞的方法。
直接标记方法包括DNA染料（如荧光素-丙酮酸乙酯和乙溴脱氧尿嘧啶等）、核素标记（如3H-thymidine）和基于蛋白的标记（如30-ku小鼠脾球蛋白）。
间接标记方法则是通过检测增殖相关蛋白，如PCNA等，来获得增殖细胞的信息。
这些方法可以通过显微镜、流式细胞术和放射自显影等技术来检测增殖细胞的数量和活性。
三、细胞凋亡检测方法细胞凋亡检测是评估细胞凋亡程度和机制的关键方法。
一种常用的方法是荧光染料双染色，如使用荧光素-乙酸酯（FITC）标记的 Annexin V和 PI（碘化孟松多聚物）。
Annexin V 能够结合磷脂酰丝氨酸（PS），这是凋亡时胞膜翻转的产物，而PI则用于区分凋亡和坏死细胞。
通过流式细胞术或荧光显微镜观察染色的细胞，可以准确检测到凋亡细胞的存在。
四、分化指标检测细胞分化的评估可以使用特定的抗体或染料来检测分化标志物在细胞中的表达。
例如，对于神经元的分化，可以使用抗神经元特异性抗体，如βIII-Tubulin、Neurofilament和MAP2等。
对于其他类型的细胞，也可以使用相应的特异性抗体或染料来检测。
13 细胞增殖和细胞凋亡检测技术
（二）荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况 常用的DNA特异性染料有：Hoechst 33342, Hoechst 33258, DAPI。 三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A‐T 碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的 细胞核呈波纹状（rippled i l d）或呈折缝样（creased d），部分染 ） 部分染 色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化； Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
BrdU 与EdU 检测原理示意图
BrdU 与EdU 检测优缺点比较
4 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂 4. (CFSE)检测法
羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细 胞膜的荧光染料 具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团 胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团 和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成 为 种良好的细胞标记物。 为一种良好的细胞标记物 CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细 细胞后 以不 与细胞内的氨 结 偶联到细 胞蛋白质上。当细胞分裂时，CFSE标记荧光可平均分配至两个 子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样，在一 个增殖的细胞群中 各连续代细胞的荧光强度呈对递减 利用 个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用 流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。
CNE-2细胞增殖、凋亡检测方法.
CNE-2细胞增殖、凋亡检测方法1. 目的2. 技术路线3. 试剂、溶液、耗材、仪器、实验材料4. 操作步骤：1). MTT法检测CNE-2细胞增殖步骤：(贴壁细胞法)1. Fen细胞培养于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，在25cm2培养瓶中生长到接近汇合。
用含0.05%胰蛋白酶，0.02% EDTA的PBS消化细胞5分钟，洗涤后，用细胞培养液将细胞配成1×105/ml。
2. 取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml细胞悬液，在37℃5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24小时，让细胞帖壁。
每孔加0.1ml效应细胞悬液，效靶比10：1到50：1，继续培养4小时，让效应细胞发挥杀伤效应。
实验中，设立只有靶细胞的无杀伤对照和只有效应细胞的阴性对照，每种处理设3各复孔。
3. 用含2%小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤各孔3次，洗去不粘附的细胞。
每孔加0.1ml 含2%小牛血清的RPMI-1640培养液和10μl 5mg/ml的MTT染液，继续培养3小时。
4. 用PBS洗涤2次，每孔加0.1ml含0.04mol/L HCl的异丙醇，室温30分钟，溶解形成的结晶。
在570nm波长处，用酶联检测仪检测各孔的光吸收值(OD)。
杀伤活性(%)=(OD实验孔-OD阴性对照) /OD无杀伤对照×100。
MTT法应注意事项：1.选择适当的细胞接种浓度。
一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。
但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT 试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。
这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。
否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
2.药物浓度的设定。
一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。
根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。
细胞增殖凋亡检测方法汇总
细胞增殖、凋亡-检测方法汇总
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二. 细胞增殖一旦过度，就有可能形成肿瘤。
为了维持机体的健康，细胞走向凋亡。
现将细胞凋亡的检测方法介绍给大家
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综上，细胞凋亡分析总体原则：
凋亡是多因素、多通路参与的过程，不能根据单一指标来判断细胞凋亡；需多指标同时检测。
凋亡细胞不同时间出现的凋亡事件不同，而每个指征维持一段时间，则需要在不同的时间点进行采样，以保证检测结果的准确性。
实验需设定阳性＆阴性对照，避免出现假阳性或假阴性。
细胞增殖凋亡检验方法汇总
细胞增殖、凋亡-检测方法汇总1.直接计数法面单粗暴、傻瓜式的检查方法！利用计数板或计数仪得出细该数目•然后对数目逬行比较。
方法需要对不同时间原的细胞分别固定•而后在光疑下计数,可绘制出细胞生长曲线。
而具不足之处在于无法区分壇蓿细胞与非增殖抵胞，下适合样品奴星參和评估特定亚群的情况。
2「H・TdR渗入法OH腺龜碇核百(TdR )是DNA持有的滅基「也是DNA合成的必需物氐用同位素中标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体渗入DNA合成代谢过程,通过液体闪烁计数器可迴走细胞的放射性强虐，间接放映出细胞增殖情况。
该方法优点在于敏感性高”客观性强,盍每性好.但是爲要一走设备集件，也存在放时性核素污染问题。
3、Brdu/EdU检测法Brdu&EdU均是胸腺嚅睫的衍生物r均可代替胸腺嚅噪在DNA合成期掺入细胞中。
不同的是J Brdu检测法可利用B「du专性抗体和具他細胞标记物对细'进行双重染色,可判断増殖细胞的种类及増殖速度，不仅适用于体外实验也能用于活体实验。
这个方法最大的缺点需要变性DNA才能与抗体结合,破坏了DNA双链结构r导致染色弥散、准确性降低等问题。
EdU检测法则基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性r适用于细胞増殖、细胞标记示踪筈方IEI的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。
EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500,®田胞内很容易就扩散,无需DNA变性。
rdU与EdU检测优缺点综合比较BrdU EdU 检测分子大很小检测方式免疫反应化学反应影响其他标记是否DNA变性需要不需要实验时间过夜 2.5小时检测灵敏度一般灵敏4、WITT检测法&CCK8检测法MTT检测法反映细胞的能臺代谢「是检测细胞増殖活力的一种简便准确方法°其原理是在活纟田胞生长和增殖过程中,线粒体内的脱氢酶可将黄色的MTT分解为蓝紫色的水不溶性的甲瓒(Formazan ),并沉积在细胞中(死细胞无此功能。
细胞增殖 检测方法
细胞增殖检测方法
细胞增殖是指细胞数量的增加。
检测细胞增殖可以通过多种方法，其中常用的方法包括：
1. 细胞计数：使用显微镜观察细胞培养物中的细胞数量，并通过计数来得出细胞增殖情况。
2. 晶紫染色法：晶紫染色可以染色细胞核，通过观察染色后细胞数量的增加来判断细胞增殖情况。
染色后的细胞可以在显微镜下观察，并可以使用图像处理软件进行图像分析。
3. DNA含量分析：细胞增殖时DNA含量也会增加，可以通过荧光染料如荧光素琥珀酰胺（Propidium Iodide）染色，使用流式细胞仪来分析DNA含量。
4. 噻吩蓝染色法（MTT法）：MTT法使用噻吩蓝（MTT）染料可以评估细胞活性和增殖能力。
活细胞将MTT染料转化为紫色的内盐，通过溶解细胞并测量溶液的吸光度来确定细胞增殖情况。
5. 细胞增殖标记物：细胞增殖标记物如脱氧尿苷（BrdU）或5-乙酰基-2'-脱氧尿苷（EdU）可以被细胞吸收并集成到新合成的DNA中。
这样，在染色时可以使用抗-BrdU或抗-EdU抗体染色，并通过观察标记物阳性细胞的数量来评估细胞增殖情况。
以上方法都可以用于检测细胞增殖情况，选择适合实验需求的方法进行研究。
需要注意的是，不同的方法可能具有不同的准确性和敏感性，因此在实验设计和数据分析过程中需要谨慎操作。
细胞增殖凋亡检验方法
细胞增殖凋亡检验方法细胞增殖和凋亡是细胞生物学中两个重要的过程，对于细胞生长、发育和疾病发展起着关键作用。
因此，研究细胞增殖和凋亡的检验方法对于揭示相关生物学过程以及发现新的治疗靶点具有重要意义。
本文将介绍几种常用的细胞增殖和凋亡检验方法。
一、细胞增殖检验方法1.MTT法MTT法（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四氮唑溴化物）是一种常见的细胞增殖检验法。
MTT可以在活细胞内还原生成紫色的福尔马因酸化物，通过测定细胞活性来评估细胞增殖情况。
该方法的优点是简便、快速、应用广泛，但只能评估细胞整体增殖情况。
2. Bromodeoxyuridine（BrdU）标记法BrdU标记法是一种侵入法，可以评估细胞的DNA合成和增殖。
细胞在培养基中加入BrdU，细胞会将其代入新合成的DNA链中。
然后，可以使用抗BrdU抗体来检测BrdU标记的细胞。
该方法对于细胞周期和增殖动力学的研究非常有用。
标记法EdU标记法是一种新兴的细胞增殖检验方法。
与BrdU类似，EdU也是一种DNA合成的标记物，但是与BrdU相比，EdU标记更加简单快速。
EdU可以通过与荧光染料的偶联来进行检测，对于多通道染色非常适用。
1. Annexin V-FITC/PI染色法Annexin V-FITC/PI染色法是一种常用的细胞凋亡检验方法。
Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂酰丝氨酸的结合蛋白，在凋亡过程中会在细胞表面表达。
PI是一种DNA染料，用于区分凋亡和坏死细胞。
该方法可以通过流式细胞术或荧光显微镜来评估细胞的凋亡程度。
2. DNA Laddering检测法DNA Laddering检测法是一种检测凋亡的传统方法。
在细胞凋亡过程中，核酸会被酶切为200-300bp的碎片，形成明显的DNA阶梯状图案。
该方法通过DNA琼脂糖凝胶电泳来检测DNA断裂情况。
3.TUNEL法TUNEL法（dUTP尾部标记法）是一种直接检测DNA断裂的方法。
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细胞增殖的检测方法：四甲基偶氮唑盐法(MTT)MTT 商品名为噻唑蓝，是一种黄色的染料。
1983 年Mosmann 建立MTT比色法，用于检测细胞存活和增殖。
其原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为不溶于水的蓝紫色结晶-甲瓒(formazan)并沉积在细胞中，而死亡的细胞无此功能。
二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫分析仪测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数量范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
此方法已广泛用于各种细胞增殖的检测、肿瘤细胞的生长、生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定[4-8]等。
此方法简便、灵敏且无放射性。
MTT 溶液需要放置在4℃避光保存，最好是现用现配。
由于MTT 经还原所产生的产物甲瓒不溶于水，无法直接测定吸光度，需要被溶解之后才能检测。
这不仅使工作量增加，而且MTT 溶液具有致癌性。
需要注意的是，MTT 法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞的绝对数。
另外，有研究发现过氧化物会降低MTT 测定的准确度，抑制将近95%的MTT 与O2－的反应，MTT 溶解产物甲瓒会吸附在纳米纤维上，而致使检测的结果呈现假阴性。
内盐法(MTS)MTS 是一种新型的MTT 类似物。
MTS 在偶联剂PMS 存在的条件下，可被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原成水溶性的有色甲瓒产物，其颜色深浅与活细胞数量在一定范围内呈高度相关，可用酶标仪检测。
它的优点在于无放射性、快速、安全、方便、灵活及特异性强，同时又克服了MTT、XTT 的缺点。
此方法已应用于细胞增殖的检测、药物敏感性试验、细胞毒性的检测等，且比MTT 法更加准确。
此方法在一定程度上也存在缺陷。
最新研究表明在96 孔板试验中，靠外的孔液体易蒸发，对检测结果有一定影响[24]，且不适合于猪淋巴细胞促有丝分裂反应的检测.细胞粘附能力测定：蛋白染料染色法测细胞粘附本法是以蛋白染色剂如氨基黑10B来问接测定96孔板中的细胞数目，该法迅速可靠，还可用怍细胞形态学观察和染色细胞的照像。
Schulz 等对入角化细胞株HaCaT 受其亚克隆细胞株、鼠成纤维细胞林3T，，骨髓瘤细胞株x63一Ag8．653作过这方面的研究。
即用甲醛或戊二醛固定粘附细胞，吹打去除未牯附的细胞而粘附的细胞用pH3，5的氨基黑染色，先用pH3．5～5的盐酸洗去附着的染料，结合的蛋白染料可用NaOH 溶解，然后在酶标仪上读取620rim／405或750rim处的OD值。
若用该法反映未牯附和半粘附的细胞数量，可在染色前先离心t然后固定。
该法测量表明，氨基黑的染色吸光度值与细胞数、DNA含量呈良好的线性关系，直线的回归斜率对不同的细胞而有所不同。
另外、该法可用来测定某些药物的细胞毒作用、LAK细胞的杀伤作用以及杂交瘤抗体对细胞扩增的生物效应。
E r]tt 曾用氟基黑染色法来问接反映24孔板上培养的细胞数，但其操作过程比较繁琐，如细胞固定，染色细胞蛋白质沉淀，多次温育、冲洗、离心、溶解变性强白，最后转移至比色杯中进行常规比色。
而本法只需在96孔板上即可进行。
实验结果重复性好，敏感性高，时间短，试剂便宜。
但在测定某种细胞的粘附性时，必须先建立其细胞数与光密度值之问的回归曲线。
因为某一特定细胞的直线回归斜率与该种细胞的太小及其蛋白质的含量有关。
氨基黑染色法不能区分死亡细胞与活的细胞，但是粘附生长的细胞一旦死亡。
即可自行脱离吸附的介质，被吸出洗去。
因此，需要用cr标记和其他物质拆记靶细胞测定粘附的试验太多可用该法代替。
值得注意的是，死亡后仍能附着的细胞不能用氨基黑染色法测定粘附性这时可以选用中性红、MTT以及其他台适的染色方法。
Joni 曾用氨基黑染色法测定细胞弱粘附特性-即最小切应力粘附测定(Minima[Sheariorce adhesion assay，MSFA)，其步骤与常规的粘附测定方法基本一致。
不同之处是去除未粘附细胞时，在液体中用轻柔的切应力去除未粘附的细胞，这样强粘附与弱粘附的细胞可同时被测定。
MSFA法去除非粘附细胞的操作方法如下：将孵育后台粘附细胞的96孔板扳孔朝上以一定角度浸入盛有0，85 Nacl盐液的容器中(容器中含液量约为2.5 升)然后在液体中轻轻反转培养板．避免板孔中形成气泡，使板孔向下板底向上，这时可使培养板从液体中升至液面，容器中的盐液用40ram 长的转子．以300rPm 的转速室温下搅动7分钟．这样板孔中未桔附的细胞可技去际96孔板从NaC[盐液容器中取出时，要重新翻转板孔向上，然后浸入含100 甲醇的容器中，在甲醇溶液中上下左右转动96孔板．使盐波和甲醇充分混台．切勿使细胞暴露于空气中，每过5分钟重复以上动作，60分钟后从甲醇液体中取出96孔板一去掉甲醇，染色细胞，酶标仪上读取570nm OD值一牯附率的计算用以下公式：OD570粘附细胞粘附率％＝————————————×100％OD570孔中加入的总细胞用该法测得的牯附率高于常规方法的2．5-3倍，而基础的非特异性粘附率不变。
结晶紫染色：他是细胞核染色常用的，用来显示染色体的中心体，并可染淀粉、纤维蛋白、神经胶质等。
凡是用番红和苏木精或其他染料染细胞核不能成功时，用它能得到良好的结果。
用番红和结晶紫作染色体的二重染色，染色体染成红色，纺锤丝染成紫色，所以也是一种显示细胞分裂的优良染色剂。
用结晶紫染纤毛，效果也很好。
用结晶紫染色的切片，缺点是不易长久保存。
苏木精是淡黄色到锈紫色的结晶体，易溶于酒精，微溶于水和甘油，易溶于热水和热乙醇，溶于碱、氨和硼砂的溶液。
它是染细胞核的优良材料，他能把细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色。
分化时组织所染的颜色因处理的情况而异，用酸性溶液（如盐酸—酒精）分化后呈红色，水洗后仍恢复青蓝色，用碱性溶液（如氨水）分化后呈蓝色，水洗后呈蓝黑色。
遇光变红。
Giemsa染色法：嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。
PH对细胞染色有影响。
细胞各种成分均为蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下正电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。
因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正经片必须清洁，无酸碱污染。
配制瑞特液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。
MTT(l)接种细胞:用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞,用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制成单个细胞悬液,以每孔103一104个细胞接种于%孔板中(本实验所接种的细胞数是每孔2x103个细胞),每孔体积200ul,各组每个时相6孔,测量时取6孔OD 平均值。
同时设不加细胞只加培养液的空白对照孔。
(2)培养细胞:将培养板放入COZ孵箱,在37℃、5%COZ及饱和湿度条件下培养(培养时间取决于实验目的和要求)。
(3)呈色:分别于1天、2天、3天、4天和5天,在待测孔中每孔加入MTT溶液(smg/ml)20ul,37℃继续孵育4一6h,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,每孔加入150ulDMSO,振荡10min,使其充分溶解。
(4)比色:选择490nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(OD值),一记录结果。
(5)以培养时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。
2.1细胞培养2.1.1细胞的复苏(l)细胞培养室的常规消毒(2)无菌操作配置好IOml完全细胞培养液并放入37℃恒温水浴箱中预温至37℃并转入无菌细胞培养瓶内备用。
(3)从液氮中待复苏的细胞,立即放入37℃很稳水浴箱中轻轻来回旋转,确保细胞冻存液在1分值之内解冻。
(4)待细胞解冻,立即用滴管吸取解冻的细胞悬液放入装有预温的完全细胞培养液的细胞培养瓶内,置37℃、5%C02恒温恒湿细胞培养箱中培养,次日换液。
2.1.2培养细胞换液(l)细胞培养室的常规消毒。
(2)按常规操作配制好完全细胞培养液并放入37℃恒温水浴箱中预温备用。
(3)从细胞培养箱中取出前一日复苏的装有细胞的细胞培养瓶,置倒置显微镜下观察细胞生长情况。
(4)在无菌操作台内用直头吸管轻轻吸出旧的培养液至废液缸,弃吸管。
(5)取新吸管,加入无血清的不完全培养液,轻轻转动培养瓶,把残存的旧培养液冲掉。
(6)弃去无血清的不完全培养液,加入事先已预温的完全细胞培养液。
(7)盖好培养瓶的瓶盖(稍松),置37℃、5%C02恒温培养箱继续培养。
(8)清走所有吸管、玻璃用品等,擦拭工作台。
2.1.3细胞的冻存(l)细胞培养室的常规消毒。
(2)按常规操作无菌配制好1.Oml细胞冻存液。
(3)从细胞培养箱中取出装有细胞的细胞培养瓶,拧紧瓶盖,置倒置显微镜下观察细胞生长情况。
当细胞处于对数生长期时(长满细胞培养瓶底部70一80%面积时),此时即可冻存。
(4)冻存细胞24小时前给细胞换液。
(5)用胰酶消化收集细胞,重悬在含有完全培养基中,1000印n订min离心5分全中。
(6)去除胰酶及旧的培养液,留细胞沉渣。
加入预先配制好的细胞冻存液(含无血清的不完全培养液7份,纯血清2份,DMS01份)。
(7)用吸管轻轻吹打使细胞均匀,分装入无菌冻存管中,每只冻存管内加液lml。
旋紧冻存管瓶盖,做好标记,用封口膜封住冻存管瓶身及瓶盖。
(8)将装有细胞的冻存管依次4℃60分钟一一20℃60分钟一一80℃过夜一液氮内长期冻存。
2.1.4细胞的传代(1)吸除或倒掉培养瓶内旧培养液。
(2)用无血清的培养液洗细胞1次。
(3)向瓶内加入lml胰蛋白酶消化液,轻轻摇动培养瓶,使消化液流遍所有细胞表面,然后吸掉或倒掉消化液后再加lml新的消化液,轻轻摇动后再倒掉大部分消化液,仅留少许进行消化。
或者不采用上述步骤,直接加1一Zml消化液进行消化,但要注意尽量减少消化液的剩余量。
(4)在37℃或室温25℃以上环境进行消化,消化2一5分钟后把培养瓶放置于倒置显微镜下进行观察,发现细胞胞质回缩、细胞间隙增大后,应立即终止消化。
(5)小心倒掉残余消化液(不含EDTA)或直接加入含血清的培养液,终止消化。
(6)用弯头吸管,吸取瓶内培养液,反复吹打瓶壁细胞,吹打过程要顺序进行,从培养瓶底部一边开始到另一边结束,以确保所有底部都被吹到。
吹打时动作要轻柔,不要用力过猛,同时尽可能不要出现泡沫,以免对细胞有损伤。
细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。
流式细胞仪检测细胞凋亡基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几方面：1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。