蛋白质 分离纯化主要方法

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透析工作图
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半透膜原理
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二 层析技术（chromatography） p148
一、层析技术一般原理
二、层析技术分类及应用
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（一）、层析技术原理
层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析，其系统通 常由互不相溶的两个相组成：一是固定相（固体或吸附在固体 上的液体），一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合 物中各组分理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性 、分子亲和力、溶解度等）的差异，使各组分不同程度地分布 在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度 移动而最终被分离。
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分类： 根据交换剂上吸附的离子交换基团不同，
阳离子交换剂; 阴离子交换剂； 按其解离度的大小， 分为强、中强、弱三种：
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阳
离 子 交 换
离 子 交 换 剂
强酸型 中等酸型 弱酸型
结合磺酸基团（ SO3H） 磷酸基团（ PO3H2）和亚磷酸基团（ PO2H） 结合酚羟基（ OH ）或羧基（ COOH）
3、4. 解吸附阶段：用梯度缓 冲溶液洗脱，先洗下弱吸附 物质，后洗下强吸附物质
原始缓 冲溶液 的反离 子
5.再生阶段： 用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用
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样品溶液
梯度浓度
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应用
制备、纯化生物物质 定量、定性测定混合物中各组分
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液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆
的吸附，溶解，交换等作用。它对层析的效果
起着关键的作用。
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2.流动相： 在层析过程中，推动固定相上待分离的
物质朝着一个方向移动的液体、气体或超 临界体等，都称为流动相。柱层析中一般 称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它 也是层析分离中的重要影响因素之一。
时只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和 糖类等小分子物质的分离。
（六）按pH的连续性不同可分为： 1.连续pH电泳：如纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳； 2.非连续pH电泳：如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳；
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电泳技术分类（按实验装置分类）
纸电泳 薄膜电泳 凝胶电泳
毛细管电泳
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a. 待纯化分子和配体间具有亲和性
+
配体 待纯化分子
b. 活性基质与配体结合产生亲和吸附剂
+
基质
c. 待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离
+
+
杂质
d. 偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子
+
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配体 L
待分离物质 S L-S复合物
基质 M
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电泳的一般原理
电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电 极移动的现象 。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少 取决于分子组成、性质及其所在介质的pH。如果混合物中各 组分的结构组成不同，在某一pH溶液中，各组分所带电荷性 质、电荷数量不同，加之其分子量不同，在同一电场的作用 下，各组分泳动的方向和速度也各异，而达到分离鉴定各组 分的目的。
蛋白质分离纯化主要方法
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蛋白质分离纯化的一般步骤
层析法
电泳法
生物组织→无细胞提取液→粗产品→
→结晶 超离心法
超滤
│←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│
•材料选择与处理 •细胞破碎（机械破 碎、溶涨和自溶、 酶解、化学处理）
•盐析（硫酸铵盐析） •等电点沉淀 •有机溶剂沉淀 •透析
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（三）按支持介质形状不同 1.薄层电泳 ； 2.板电泳 ； 3.柱电泳。 （四）按用途不同可分为： 1.分析电泳； 2.制备电泳； 3.定量免疫电泳；
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（五）按所用电压不同可分为： 1.低压电泳：100V～500V，电泳时间较长，适
于分离蛋白质等生物大分子。 2.高压电泳：1000V～5000V，电泳时间短，有
3、琼脂糖电泳
4、毛细管电泳
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聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
凝胶聚合反应及催化系统 不连续PAGE 可产生的三种效应：
电荷效应、 分子筛 效应、 浓缩效应
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• 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis PAGE ），是以聚丙烯酰胺凝 胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙 烯酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide）和甲叉 双丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N’methylenebisacrylamide）聚合而成，这一聚 合过程需要有自由基催化完成。
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原理p303
凝胶层析是依据分子大小这一物理性质
进行分离纯化的。凝胶层析的固定相是惰性
的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体
网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子
大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个
组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散
程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。
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SDS- PAGE电泳法：测定亚基数 超速离心：成分均一 其它：如, 结晶法……
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一透 析
定义：利用半透膜把大小分子分开的方法。
操作
蛋白质溶液置半透膜袋中，置流动溶剂 （如蒸馏水）中，使小分子杂质（如无机盐、 单糖、双糖、AA、小肽等透出）蛋白质留于 袋中而得到分离。
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层 阴 强碱型
季胺基团（ N(CH3)3），
析 分
离 子
中等碱型叔胺（
N(CH3)2）、仲胺（
NHCH3）、伯胺（-N
类 交 弱碱型
二乙基氨基乙基（DEAE）
换
剂
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交换过程
1
2
3
4
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1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合
2.吸附阶段：样品与反离子进行交换
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亲和层析（affiuity chromatography）
原理
欲分离的大分产物质S和相对应的专一物质L(配体) 以次级键结合，能生成一种可解离的络合物L—S。其 中的L又能与活化的基质M以共价键首先结合，而形 成M—L—S复合物。根据L—S之间能可逆地结合与解 离的原理发展起来的层桥方法称为亲和层析法。
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电泳分类
• （一）按原理分四种
• 1.区带电泳：是当前应用最为广泛的电泳技术。
2.自由界面电泳： 这是瑞典Uppsala大学的著名科学家
Tiselius最早建立的电泳技术，是在Ｕ形管中进行电泳，无
支持介质，因而分离效果差，现已被其他电泳技术所取代。
3.等速电泳：需使用专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各
物质在纸上移动的速度可以用Rf表示： 色斑中心至原点中心的距离
Rf = ────────────── 溶剂前缘至原点中心的距离
载体 ： 纤维素 硅藻土 硅胶
应用：各种生化物质的分离鉴定
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凝胶层析（gel filtration）
又称为凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography）、分子筛层析（molecular sieve chromatography）、 凝胶过滤（gel filtration）、凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）等。
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1、pH梯度的形成 2、蛋白质行为 3、聚焦效应
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流速
移动速率
蛋白质1（pI=7）
蛋白质2（pI=8）
pH梯度溶液的形成示意图
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层析时的聚焦效应示意图
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几种主要层析方法ห้องสมุดไป่ตู้较
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二 、 电泳技术
电泳的一般原理 电泳技术的分类 电泳的影响因素 常用电泳技术
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（三）、层析法分类（按分离原理分类 ）
分配层析 吸附层析 凝胶过滤（分子筛层析） 离子交换层析 亲和层析 聚焦层析
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层析法分类（按装置分类 ）
纸层析 薄膜层析 柱层析
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洗脱液
样品 填充物 玻璃柱
分部收集
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离子交换树脂 、纤维素、
葡聚糖
带配基的sepharose
或sephadex
多缓冲交换剂（与带有多种电
荷基团的配体相偶联的
sepharose 6B）
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吸附层析（absorption chromatography）
原理： 以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流
动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附 的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当 流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度 地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再 吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。
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基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、
sepharose、sephadex
应用 分离纯化酶、 抗原、抗体
分离纯化核酸 研究酶的结构与功能
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聚焦层析（Chromatofocusing） 原理
该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其 分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行 为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过 程叫做聚焦效应。
样品在层析时的移动速度可用迁移率Rf值表示：
样品原点到斑点中心的距离
Rf= ——————————————
样品原点到溶剂前沿的距离
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(二) 层析相关概念
1.固定相：
固定相是层析的一个基质。它可以是固体物
质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可
以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶
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分配层析(p148)
原理：
分配层析是利用混合物(样品)在二种或二种 以上的不同溶剂中的分配系数不同而使物质分离 的方法
分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸 层析中滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机 溶剂为流动相（展开剂）。
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各类层析的原理和载体
类别
分离原理
吸附层析
化学、物理吸附
分配层析
两溶剂相中的溶解效应
凝胶层析
分子筛效应的排阻效应
离子交换层析 离子基团的交换反应
亲和层析 聚焦层析
分离物与配体之间有 特殊亲和力 等电点和离子交换作用
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基质或载体
硅胶、氧化铝 、羟基磷酸
纤维素、硅藻土 、硅胶
sepharose 、sephadex
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pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成) 是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成 pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，蛋 白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的pH处。从此 位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸 附，直到在等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中 ，一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出，并 且有一定的时间进行聚焦，剩余样品还可以加到柱上 ，其聚焦过程都能顺利完成。
电泳区带相随，分成清晰的界面，并以等速向前运动。
4.等电聚焦电泳：由两性电解质在电场中自动形成pH梯
度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH处聚集
成很窄的区带。
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（二）按支持介质的不同可分为： 1.纸电泳 2.醋酸纤维薄膜电泳 3.琼脂凝胶电泳 4.聚丙烯酰胺凝胶电泳 5.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。
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沉淀法
盐析法、有机溶剂沉淀法、重金属盐
沉淀法、生物碱或酸类沉淀法、加热 变性沉淀法
分
离子交换层析 吸附层析
离
层析法
凝胶过滤（分子筛）
纯
亲和层析
化
等电聚集层析
方
电学法
电泳法
法
等电聚焦
离心法
透析
膜分离技术 超滤
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纯度鉴定 分子量测定
层析法：凝胶过滤; 高效液相色谱法(HPLC) 电泳法：PAGE、梯度凝胶电泳、等电聚焦电泳等 免疫化学法：专一的沉淀线
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毛细管电泳
三、影响电泳的因素
（一）带电颗粒的物理性状 （二）支持物介质： （三）缓冲溶液(pH 离子强度) （四）电场强度： （五）电渗现象： （六）焦耳热对电泳的影响
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四、常用电泳技术
1、醋酸纤维薄膜电泳 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE） 3、SDS-PAGE 4、PAGE等电点聚焦
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载体
葡聚糖凝胶（sephadex） 琼脂糖凝胶（sepharose）
应用:
测定分子量 脱盐和浓缩 分离提纯生物 大分子 除去热原物质
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离子交换层析（ion-change chromatography）
原理 离子交换层析是依据各种离子或离子
化合物与离子交换剂的结合力不同而进行 分离纯化的。离子交换层析的固定相是离 子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高 分子聚合物基质通过一定的化学反应共价 结合上某种电荷基团形成的。