全长CDNA克隆方法
新城疫病毒SD强毒株全长cDNA克隆的构建及序列分析
新城疫病毒SD强毒株全长cDNA克隆的构建及序列分析袁小远;杨金兴;张玉霞;孟凯;王友令;艾武【摘要】将新城疫病毒SD强毒株的全基因组cDNA序列进行分段扩增,并将各个片段通过In-Fusion技术连于克隆载体pBR322上,获得了SD毒株的全基因组cDNA克隆.通过分段PCR扩增鉴定及全长测序分析,结果表明,SD毒株的全基因组cDNA克隆构建成功,并且成功引入T7启动子序列,全长基因组序列与亲本毒氨基酸序列的一致性为99.9%.单个序列比对发现,全基因组cDNA克隆中有11处碱基突变,其中只有2处引起氨基酸序列发生改变;整个序列未出现基因的缺失、插入变化,因此全长氨基酸的位数未发生任何变化.SD毒株全长cDNA克隆的成功构建和序列分析为后续的反向遗传操作奠定了关键的技术基础.%The whole genomic cDNA sequence of SD virulent strain of Newcastle disease virus was amplified in sections, and each fragment was attached to the clone vector pBR322 by In-Fusion technology.The whole genomic cDNA clone was obtained.Through the fragmented-PCR amplification and sequencing analysis, the results showed that the whole genomic cDNA clone of SD virulent strain was successfully constructed and the T7 promoter sequence was successfully imported.The identity of amino acid sequence between the whole genomic cDNA clone and parent strain was 99.9%.Single sequence alignment showed that there were 11 base mutations in the whole genomic cDNA clone, and only 2 sites caused the change of amino acid sequence.However, because of no occurrence of deletion and insertion of genes in the whole sequence, the number of full-length amino acids had no change.The successful construction and sequence analysis ofwhole genomic cDNA clone of SD virulent strain laid the key technical foundations for future reverse genetic operation.【期刊名称】《山东农业科学》【年(卷),期】2017(049)007【总页数】4页(P12-15)【关键词】新城疫病毒;基因组全长cDNA;重组质粒;序列分析【作者】袁小远;杨金兴;张玉霞;孟凯;王友令;艾武【作者单位】山东省农业科学院家禽研究所,山东济南 250023;山东省农业科学院家禽研究所,山东济南 250023;山东省农业科学院家禽研究所,山东济南 250023;山东省农业科学院家禽研究所,山东济南 250023;山东省农业科学院家禽研究所,山东济南 250023;山东省农业科学院家禽研究所,山东济南 250023【正文语种】中文【中图分类】S852.65+9.5;Q781新城疫(Newcastle disease，ND)是一种禽类的高度接触性疾病，对全世界养禽业造成巨大经济损失[1,2]。
RACE的简介.
通过PCR的方法获得全长cDNA：
利用胶回收试剂盒回收cDNA。此试剂 盒适合回收2.5kb以下的RACE产物； 对于长的片段，可以通过电洗脱获得好 的结果。如果你选择使用其他的纯化方 法，最后用Tricine－EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。 将全长的cDNA克隆到T/A型的 PCR克 隆载体中。
对于5‘端的RACE产物，我们建议挑取至 少8－10个不同的克隆以获得5‘端的最大 可能性的序列。（反转录并不总是进行到 mRNA模板的5’末端，尤其是长模板。 另外，T4 DNA聚合酶会移走5‘末端的0 －20个碱基。） 一旦鉴定了含有插入片断的克隆，应该获 得多的序列信息。理想的是，可以对整个 开放读码框进行测序。包括5‘和3‘的非翻 译区。
通过PCR的方法获得全长cDNA：
在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。 通常情况下，可以见到一条单一带，如果 这样，利用胶来纯化全长的cDNA。 制备1.2%的TAE buffer制备琼脂糖凝胶。 不使用TBE buffer，TBE的胶很难制备全 长的cDNA。 将剩下的45μl反应物点样，选用适当的 marker。 利用长波紫外观察cDNA（≧300nm）切 下全长的cDNA。注意：应该尽量减少紫 外对cDNA的照射。
谢谢大家！
如果要用重叠片段来检测设计的引物， GSp1和GSp2之间至少是100－200碱基。 只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计 的引物是否正确。 降落PCR可以明显的增加RACE PCR产物 的特异性。在最开始的循环中，退火温度 高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性 条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降 回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循 环。
杜仲肉桂醇脱氢酶基因全长cDNA克隆及序列分析
收 稿 日期 ：０２—０ ２１ ７—０ ； 回 日期 ：０２— ７—２ １修 ２１ ０ ６
基金项 目： 国家 自然科学基金资助 （ ｏ ０６ １６和 Ｎ ．３７ １６ ２ ８ 。 Ｎ ．３６ ０ ４ ｏ ０ １２ ０ ６ ） 作者简介 ： 赵 丹 （９ ３一） 女 ， １８ ， 贵州赤水人 ， 硕士。研究方向 ： 植物生物技术。 通讯作者 ： 赵德刚 ． Ｅ—ｍａ ：ｅａｇｈｏ ａｏ．ｏ ｉ ｄｇｎ ｚａ ＠ｙｈｏ ｃｒ ｌ ｎ
赵 丹 李晓毓 陈 建 赵德 刚 。 ， ， ， ，
５０２ ； ５０５
（． １ 贵州大 学 贵州 省农 业生 物工 程重 点实验 室 ， 贵州 贵 阳
２ 贵州大学 生命科学学院， ． 贵州 贵阳 ５０２ ； ５０５ ３ 黄山学院 生物与环境科学系 ， ． 安徽 黄 山 ２ ２０ ； ． ４ ７０ ４ 江苏省泗洪县农水局 ， 江苏 泗洪 ２３０ ） ２９０
ｃ ｕ ｏ ｌｅ 中 克 隆 出该 基 因 的 全 长 序 ｏ ｍ ｌ ｉ Ｏｉ ） ｍ ＆ｓ ｖ 列， 旨在为 进一 步研究 该基 因的表达 调控 机理 以及 木质 素 的生物合 成 调控机理 奠定 基础 。
素 的一 类大 分子 有机 物质 ， 在增 强植 物 细胞 和 组织 的机 械 强度 、 水分 运输 和抵 抗外 界不 良环境 中起着 重要 的作用 ， 同时 由于木质 素 的不可 溶性 及 多 酚类
作 用 于木 质素 单体 生物合 成 的最后 一 步 Ｊ催 化 对 ，
香 豆醛 转 变为对 香 豆醇 ， 已在 Ｎ Ｂ 上 注册 的 现 ＣＩ Ｃ Ｄ完 整 ｍ Ｎ 序 列 共 １７ 条 。 本 文 拟 用 Ａ Ｒ Ａ ８ ＲＣ Ａ Ｅ技 术 ， 贵 州 特 有 经 济 树 种—— 杜 仲 （ ｕ 从 Ｅ—
cdna克隆
cDNA克隆是以mRNA为原材料，经体外反转录合成互补的DNA(cDNA)，再与载体DNA分子连接引入寄主细胞。
]每一cDNA反映一种mRNA的结构，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。
特点是：①有些生物，如RNA病毒没有DNA，只能用cDNA克隆；②cDNA克隆易筛选，因为cDNA库中不包含非结构基因的克隆，而且每一cDNA克隆只含一个mRNA的信息；③cDNA能在细菌中表达。
cDNA仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。
1.方法：(1)DNA片段的制备：常用以下方法获得DNA片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超声波)取得DNA 随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA反转录产生cDNA。
(2)载体DNA的选择：①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。
在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。
质粒DNA 可通过转化引入寄主菌。
在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松驰型”。
此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。
质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级克隆。
②噬菌体DNA：常用的λ噬菌体的DNA是双链，长约49kb，约含50个基因，其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA 两端。
中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。
λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库。
M13噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有F基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。
M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。
寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体，又能方便地制备单链DNA，用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交。
淇河鲫生长激素(growth hormone)全长cDNA的克隆与序列分析
［ 摘
要 ］ 用 Ｒ －Ｃ 法 和 ３、 ＡＣ （ ａｉ ａ ｐｉｃｔｎｏ Ｄ Ａ ｅｄ） 从 淇 河 鲫 脑 垂 体 ＴＰ Ｒ ５Ｒ Ｅ Ｒ ｐｄ ｍ ｌ ａｏ ｆ Ｎ ｎｓ 法 ｉ ｆ ｉ ｅ
Ｒ Ａ克 隆 出生长 激素 （ ｒ ｔｈｒｏｅＧ ｅ Ｎ 此 ｅＮ Ｎ Ｇｏ ｈ ｏ ｎ，Ｈ） Ｄ Ａ． Ｄ Ａ全 长 １１１ ｔ Ｐｌ Ａ １ ｔ， ５ ｗ ｍ ９ （ ｏ （ ）４ｎ）其 ｎ含 ｙ
草鱼 、 和鲇等 少数 几种 鱼类 ［－］而 对 淇河鲫 的 研究 尚未 见报 道 ． 鲤 ２２ ， １ ５ 淇河 鲫 （ ａ ｓｉｓａｒｕ ｉ ｌ ｆ） 硬 骨 鱼 纲 （ ｓ ｉ ｔ ｅ） 鲤 形 目 （ ｙｒ ｉｒｅ） 鲤 科 Ｃｒ ｓ ｕａ ｓｇ ｅｉ Ｖ／ 属 ａ ｕ ｔ ｂ ｏ ｌ ＇ Ｏｔｅ ｈ ｓ ， ｅｈ ｙ Ｃｐｉｆｍ ｓ ， ｎｏ （ ｙｒ ｉ ｅ ， 属 （ ａ ｓｕ ａ ｃｉ， 自然 三倍 体雌 核发 育鲫 鱼 ， 于河 南省 淇河 ， Ｃｐｉｄ ）鲫 ｎａ Ｃｒ ｓ ｓＪｒ ｋ）是 ａｉ ｏ 产 以生 长快 、 味道美 和 效益高等优点而久负盛名 ， 具有 良好的开发前景 ． 了保护并开发这一奇特的珍贵鱼种 ， 为 河南省人民政
［ 文章编号］ｏｏ９＇ （ｏ８ｏ ．０ １ ６ ｌｏ－ｏ５ ２ｏ ）１０２． ３ ０
淇 河 鲫 生长 激 素 （ｒｗｈｈｒ ｏｅ ｇｏ ｔ ｏｍ ｎ ） 全长 ｃ Ｎ Ｄ Ａ的克 隆与 序 列 分 析
高春 生１ ， ， 范光 丽２杨 国宇 裴 淑丽 王艳玲 ， ２ ， ， ，
（． １河南农 业 大学牧 医工 程 学院 ， 南 郑 州 ４００ ； 河 ５０２ ２ 西北农林 科技 大学动科 学院 ， 西 杨凌 ７２０ ） ． 陕 １１０
RACE技术
引物(根据已知序列设计)和PolyT引物PCR即
可。大多实验者反映一次PCR可以搞定。
SMARTTM 3‘-RACE的原理
5'-RACE ：5'-RACE相对较难，目前流行几种5'RACE。其一为加接头(传统)，根据接头引物和自 己设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩 增。另外，有利用反向PCR技术，连接成环在 PCR。还有，GENE公司一种 smartRACEPCR，利 用反转酶末断加C特点,直接加上多G接头，转换模 板而无需用连接酶加接头。利用mRNA的3‘末端的
验证基因特异性引物的对照
利用两个GSPS进行阳性对照：（只有两个 GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。） 为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利 用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对 照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片 段。如果没有这个片段，应该重复cDNA的合 成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行 cDNA的合成。
SMARTTM 3‘-RACE的原理图
SMARTTM 5'-RACE的原理
先利用mRNA的3‘末端的poly（A）尾巴作为 一个引物结合位点，以Oligo（dT）30MN作 为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转 录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具 有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链 的5’末端时自动加上3-5个（dC）残基，退 火后（dC）残基与含有SMART寡核苷酸序列 Oliogo（dG）通用接头引物配对后，转换为 以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接 头。
反应中涉及到的一些事项
降落PCR可以明显的增加RACE PCR产物的 特异性。在最开始的循环中，退火温度高于 AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的 扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的 温度，可以进行随后的PCR循环。
中国对虾蜕皮抑制激素全长cDNA的克隆及序列分析
遗传学报 Acta G enetica Sinica,February2003,30(2):128～134ISS N0379-4172Molecular Cloning and Sequence Analysis of Full Length cDNA E ncoding Molt2inhibiting H ormone from Fennropenaeus chinensisW ANG Z ai2Zhao,J I AO Chuan2Zhen,ZH ANG X iao2Jun,XI ANGJian2Hai①(K ey Laboratory o f Experimental Marine Biology,Institute o f Oceanology,the Chinese Academy o f Sciences,Qingdao 266071,China)Abstract:M olt2inhibiting horm one(MIH)is a neuropeptide member belonging to the eyestalk CHH family.M olting in shrimp is controlled by MIH and ecdys one.By inhibiting the synthesis of ecdys one in the Y2organ,MIH indirectly suppress the m olting activi2 ty of shrimp.A697bp full2length encoding m olt2inhibiting horm one precurs or cDNA,which has been accepted by G enBank(acces2 sion number:AF469187),was firstly amplified from the total RNA of eyestalk from Fennropenaeus chinensis by the3′and5′rapid amplification of cDNA ends(RACE)method.The697bp full2length cDNA encoding MIH precurs or was assembled with a320bp 3′RACE product and468bp5′RACE product.Results derived from searching by Blast revealed the697bp cDNA had high simi2 larity with MIH gene of crustacean.By using Clustal X program,alignment of the amino acid sequence deduced from the697bp cDNA with amino acid sequences of7MIHs revealed that the deduced amino acid sequence had very high identity with amino acid sequences of MIHs of shrimps.The identities between the deduced amino acid sequence with that of MIH of Mar supenaeus japoni2 cus,Penaeus monodon and Metapenaeus ensis were respectively9511%,8311%and7911%.On the base of all the data,we con2 cluded that the697bp full2length cDNA was the cDNA encoding MIH precurs or of F.chinensis.Sequence analysis of the697bp cDNA revealed a312bp open reading frame,and81bp5′untranslated region,and a302bp3′untranslated region.The deduced 103amino acid polypeptide consisted of a28amino acid region of signal peptide and a75amino acid region of mature peptide.The six cysteine residues were very conserved in the mature peptide.K ey w ords:Fennropenaeus chinensis;m olt2inhibiting horm one;cDNA cloning;sequence analysis中国对虾蜕皮抑制激素全长cDNA的克隆及序列分析王在照,焦传珍,张晓军,相建海①(中国科学院海洋研究所实验海洋生物学重点实验室,青岛 266071)摘 要:对虾的蜕皮活动由蜕皮抑制激素和蜕皮激素调控,蜕皮抑制激素是甲壳动物CHH家族神经肽的成员之一,通过抑制Y器官蜕皮激素的合成而调节蜕皮。
人PPARδ受体cDNA全长序列的克隆及测序
重庆 医科大学学报 ２０ ０ ７年第 ３ ２卷 第 ８期 （ｏ ｒａ ｆ ｏ ｇ ｉｇＭｅ ｉ ｌ ｎｖ ｒｉ ０ ７ Ｖ １ ２Ｎ ．） Ｊ ｕｎ ｌ ｎ ｑｎ ｄｃ ｉ ｓ ｙ２ ０ ． ｏ． ｏ８ ｏ Ｃｈ ａＵ ｅ ｔ ３
ｅ ａ ｙ ｔｃ ｘ ｒ ｓ ｉ ｖ ｃ ｏ ｃ ｒｙｉ ｈ ｕｋ ｒ ｏｉ ｅ ｐ ｅ ｓｏｎ ｅ ｔｒ ａｒ ｎｇ ＰＰＡＲＢ ｅ ｅ．Ｍ ｅｔｏｄｓ： ＰＰ ｇ ｎ ｈ ｈ ＡＲ ｃＤＮＡ ｗａ ｃｏ ｄ ｒ ｍ Ｈｅ ８ ｓ ｌｎｅ ｆｏ ｐＧ２ ｅｌ ｔｔｌ ｃ ｌｓ ｏａ ＲＮＡ ｂｙ ＲＴ—ＰＣＲ． Ｔ Ｐ ｈｅ ＣＲ ｐｒ ｄ ｔｒ ｃｏ ｅｒｄ ｒ ｍ ｇ ｌ ｏ ｕｃ ｅ ｖ ｅ ｆｏ ｅ ｗｅ ｅ ｉ ａｅ ｗｉ ｐＭ Ｄ １ Ｔ ｅ ｔ ｒ ｎｄ ｒ ｎｓｏｒ ｅ ｉ ｏ ｒ ｌｇ ｔ ｄ ｔ ｈ ９－ ｖ ｃ ｏ ａ ｔａ ｆ ｍ ｄ ｎｔ ＤＨ５ｃ ｃ ｍｐｅｅ ｃ ｌ． ｔ ｏ ｔｎｔ ｅ１ ｈ ｉ ｅ ｒｔ ａ Ｔ ｅ ｎｔｇ ｉｙ ｎｄ ｆｄｅｉｙ ｆ ＰＰＡＲＢ ＤＮＡ ｓ ｑｕ ｎｃ ｉ ｓ ｒｅ ｉ Ｔ ｅ ｔ ｒ ｗｅ ｅ ｅ ｆｅ ｂ Ｂａ Ｈ Ｉ ｉ ｌｔ ｏ ｈ ｃ ｅ ｅ ｅ ｎｅｔｄ ｎ ｖ ｃ ｏ ｒ ｖ ｒｉ ｄ ｙ ｉ ｍ ａｎ Ｓ ／ Ｉ ｏ ｌ ｅ ｃ ｓｎ ｄ ｏ ｄ ｕｂ ｅ ｘ ｉｉ ｇ ａ ＤＮＡ ｓ ｑｕ ｎｃｎ ａ ｓ ｙ ．Ｒ ｅ ｕｌｓ： ｅ ｏｓｔ ｅ ｌｎ Ｔ ｃｏ ａ ｍｉ ｃ ｎ ａｎ ｎ ｃ ｒｅ ｔ ｅ ｅ ｅ ｆ ｈ ｎｄ ｅ ｅ ｉｇ ｓ ａ ｓ ｓ ｔ Ｔｈ ｐ ｉｉ ｃｏ ｅ ｖ ｖｅ ｔｒ ｐｌｓ ｄ ｏ ｔ ｉｉ ｇ ｏ ｒ ｃ ｓ ｑｕ ｎｃ ｏ ＰＰＡ ＲＢ ＤＮＡ ｗｅ ｅ ｃ ｒ ｖ ｒｆｅ ｂ ｅ ｚ ｍｅ ｉ ｅ ｔｏ ａ ｗｅ ｌ ｓ ｅ ｅ ｃ ａ ａ ｙ ｉ ａ ｄ ｅ ｉｉｄ ｙ ｎ ｙ ｄ ｇ ｓｉ ｎ ｓ ｌ ａ ｓ ｑｕ ｎ ｅ ｎ ｌ ｓｓ ｎ ｗａ ｎ ｍｅ ａ ｐＭ Ｄ１ ｈＰＰＡＲＢ－Ｔ ｖ ｃ ｏ ． Ｔｈｅ ｅ ｕｅ ｃ ｏ ｓ ａ ｄ ｓ ９－ ｅ ｔｒ ｓ ｑ ｎ ｅ ｆ
race法获得全长cdna序列的过程
race法获得全长cdna序列的过程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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新基因全长cDNA的克隆策略
随着人类基因组计划(H GP)和其它模式生物基因组计划的相继完成, 生命科学 已经进入了后基因组学时代(post genomics)。 在对基因组结构进一步了解的
同时,功能基因组学逐渐成为核心内容. 基因组序列测定的完成仅仅是基因组
计划的第一步, 更大的挑战在于如何确定基因的功能和阐述其调控的机制与 表达规律。 因而,基因功能研究已成为生命科学领域中的重大课题, 它将是21 世纪生命科学研究的重要领域. 那么,对于一个未知的新基因,如何对它制定基 因功能的研究方案从而进行全面和系统的研究是每个基因功能研究者面相 似的基因。
• 如果只知道某个基因的一段碱基序列,可以采用 RACE(cDNA 末端快速扩增)或反向
PCR和锚定 PCR方法克隆该基因的 cDNA全长序列的引物进行序列分析。
• 所有DNA片段；
• 2.连接至载体；
• 3.转化到受体细胞扩增；
• 4.目的序列的筛选鉴别。
• 如果已知一个基因的序列，那么可以通过已知序列设计引物，然后通过PCR技术获 得目标DNA片段。
• 如果一个或多个物种的某种基因已经被分离，可以通过同源性对比找到的保守性
• 转座子是染色体上一段可移动的DNA片段，它可从染色体的一个位置跳
到另一个位置。当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基 因的失活，并诱导产生突变型，而当转座子再次转座或切离这一位点时， 失活基因的功能又可得一恢复。遗传分析可确定某基因的突变是否由转 座子引起。由转座子引起的突变便可部分突变株DNA序 列的克隆，。
• 目前基因功能的基本策略： • 1 .新基因全长 cDNA的克隆策略； • 2 .通过生物信息学预测新基因的功能； • 3 .新基因的表达谱分析；
RACE原理及应用
RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。
近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长 cDNA 提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和 PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
第二 RACE的原理RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定 PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。
3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。
这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。
再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。
三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。
扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。
人肝细胞核因子-1β基因cDNA全长的克隆与表达
验 手册进 行 反 转 录 ， 成 出 ｃ Ｎ 合 Ｄ Ａ第 １链 。 以反 转
１ 。研 究 表 明 Ｈ Ｆ１ Ｂ） Ｎ ．ｐ的 多 态 性 与 胰 岛 素 抵 抗
（ｎｕｉ ｅｉ ａｃ ，Ｒ ） 正 相 关 ¨ 。此 外 ， Ｆ１ ｉｓｌ ｒｓ ｔ ｅ Ｉ 呈 ｎ ｓｎ ＨＮ －ｐ
录产物为模板 ， 加入 ＴｑＤ Ａ聚合酶， ０ 体系 ａ Ｎ 以５ ｌ 进 行 Ｐ Ｒ， 应条 件为 ９ ￣ ． ｎ ６ ￣ ． ｎ Ｃ 反 ４Ｃ １５ｍｉ ，５Ｃ １５ｍｉ ， ７ ｏ ２ｒ ｎ 共 ３ 循 环 。用 Ｐ ｍｅ ｘ ｒｓ 软件 设 ２Ｃ ｉ ， ２个 ａ ｉ ｒ ｒ ｐｅｓ Ｅ 计 针对包 含 ｈ Ｆ１ Ｄ Ａ全 长 的 引 物 （ 游 ： ＨＮ 一Ｂ ｃ Ｎ 上 ５一
酶 、４ Ｎ Ｔ Ｄ Ａ连接酶购 自 ＴＫ Ｒ 公 司。引物合成和 ａａａ
测 序 由上海 生工 生 物 工 程 技术 服 务 有 限公 司 完 成 。 小 鼠抗 人 Ｈ Ｆ１ Ｎ ．Ｂ单克 隆抗 体购 自 ＳｎａＣｕ 公 司 ； ａｔ ｒｚ 羊 抗 鼠辣根 过 氧化物 酶标 记 的二抗 购 自武汉 博 士德 生 物技术 有 限公 司 ； Ｃ Ｅ Ｌ增 强 型发 光 剂 购 自 Ｐｅｃ ｉ ｅ ｒ
步研究 ｈ Ｎ －Ｂ基 因 的结 构 与功能 奠定 基础 。 Ｈ Ｆ１
杆菌 （ ｏ） Ｅ Ｃｌ 中高 效表达 。方 法 提取正 常成 人肝 脏组织 ｉ
的总 Ｒ Ａ， ＴＰ Ｒ后的扩增产物 回收 ， Ｎ Ｒ —Ｃ 构建克 隆载体 ｐ Ｄ Ｍ—
Ｈ Ｆ１ ， Ｎ 一Ｂ 设计带酶切位点 Ｂ ｍ Ｈｎ ｌ ａ Ｈ Ｉ和 ｉｄｎ 的引 物 ，Ｃ Ｐ Ｒ后
细胞 核 因子 ．１（ ｅ ａ ｃｔ ｎ ｃｅｒｆｃ ｒ１ １ ｈｐ ｔ ｙｅ ｕ ｌ ａｔ 一ｐ，ＨＮ － ３ ｏ ａ ｏ Ｆ
鲤耐低温候选基因CcSCD全长cDNA的克隆及功能预测
ｆ ｍ ｏ ｒ ｃｍｍｏ ｒ（ ｙ ｒ ｕ ａ ｉ）Ｃ Ｓ Ｄ） ｒｉ ｏｉｇ ｅ ｅａ ｒ ａ ｈｒｃｅ ｚｄａｄｔｅ ｒ ｓｒ ｔ ｎｅｐｅｓ ｎｐｏ ｌｓ ｏ ｎｃ ｐ Ｃ ｐｉ ｓｃｒ ｏ （ ｃ Ｃ ｂａ ａ ｃ ｌ ｍｐ ｒｔ ｅ ｓ ａ ｔ ｅ ｎ ａ ｃ ｐｉ ｒｓｉ ｒｆｅ ａ ｎ ｐ ｎ ｔｏ ｎ ｔ ｕ ｗ ｃ ａ ｒ ｉ ｈ ｔｎ ｉ ｏ ｘ ｏ ｉ
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全长基因的克隆
全长基因的克隆王闵霞 马欣荣 代富英 谭 红(中国科学院成都生物研究所,成都610041)摘 要:新基因全长cDNA序列、全长DNA序列的获得常常是分子生物学工作者面临的难题。
本文就克隆全长基因的各种技术如文库筛选法、各种PCR技术及新发展起来的电子克隆法等方法作一简单综述。
关键词:全长基因 克隆 文库筛选法 PCR 电子克隆The Cloning of Entire G eneWANG Minxia MA Xinrong DAI Fuying TAN H ong (Chengdu Institute of Biology,Chinese Academy of Sciences,Chengdu610041)Abstract:To obtai n the enti re DN A or cDN A sequence of a new gene is a problem f or researchers.The article described the techniques that are used to clone the enti re gene,f or ex am ple:screeni ng li2 braries,a great variety of PCR techniques and new developed silico cloni ng.K ey w ords:enti re gene,cloni ng,screeni ng libraries,PCR techniques,silico cloni ng 研究一个基因的结构、功能及其表达产物的特性,完整的基因信息是必需的,但是新基因全长cD2 NA序列的获得常常是分子生物学工作者面临的难题。
随着分子生物学技术的飞速发展和广泛应用,对基因进行克隆的技术在原有的基础上也有了许多新的发展,例如差别显示杂交、抑制性差减杂交、RAP2PCR、代表性差异显示、酵母双杂交系统、cD2 NA直接捕捉法等。
全长cDNA文库的构建方法
全长cDNA文库的构建方法全长cDNA文库的构建是基因组学研究中的重要步骤，它能够捕获一个生物体所有的转录本，为基因表达、功能研究和基因组注释提供有用的信息。
下面将介绍一种常用的全长cDNA文库构建方法。
样本准备需要准备含有目标转录本的细胞或组织样本。
这些样本可以是新鲜或冷冻的，只要它们的质量和数量能够满足后续步骤的需求。
对于一些需要特殊处理的样本，如动物组织，需要按照相关法规进行采集和处理。
RNA提取从样本中提取高质量的RNA是构建全长cDNA文库的关键步骤。
常用的RNA提取方法是Trizol法或RNAiso Plus法。
这些方法能够有效地分离出RNA，并且可以去除大部分的蛋白质和基因组DNA。
在提取RNA后，需要对其质量和浓度进行检测，以确保其适用于后续步骤。
反转录将RNA进行反转录，生成cDNA，是构建全长cDNA文库的另一个关键步骤。
常用的反转录方法是 oligo(dT)引物法和随机引物法。
oligo(dT)引物法利用了mRNA特有的poly(A)尾，能够捕获mRNA进行反转录。
随机引物法则利用了引物结合在RNA的任意位置，也能捕获全长的cRNA。
在反转录完成后，需要检测cDNA的浓度和特异性，以确保其适用于后续步骤。
文库构建在得到全长cDNA后，需要将其克隆到载体中，构建成文库。
常用的载体有质粒、噬菌体和BAC等。
这些载体都能够在细菌中进行复制和扩增，使得文库的规模得以扩大。
在构建文库时，需要确保cDNA的插入率和多样性，以避免后续步骤中的误差。
文库质量检测在构建完全长cDNA文库后，需要对其质量进行检测。
随着生物技术的不断发展，基因组学和蛋白质组学研究取得了突破性进展。
在此基础上，研究者们开始mRNA转录本的全长序列，即cDNA。
cDNA文库的构建对于基因表达、功能研究和比较基因组学等领域具有重要意义。
本文将探讨全长cDNA文库的构建方法及其应用研究。
全长cDNA文库构建的关键问题包括如何获取全长的、完整的mRNA转录本，以及如何将这些转录本有效克隆到表达载体中。
拟南芥全长cDNA研究进展
拟南芥全长cDNA研究进展【摘要】全长cDNAs是基因组序列注释和基因及其产物功能分析的基础。
目前共分离了155，144个RIKEN拟南芥全长（RAF）cDNA克隆。
将得到的155，144个RAFL cDNAs进行了3’端表达序列标签聚类成14，668个非冗余cDNA类，其中60%预测到基因。
同时已从14，034个非冗余cDNA类中获得了5’ESTs，并构建成启动子文库。
RAFL cDNAs序列数据库的建立有助于启动子分析、预测出转录本单元的正确注释和基因产物的注释。
而且，全长cDNAs 还为表达谱分析、功能分析和植物蛋白结构分析提供了宝贵的资源。
【关键词】拟南芥；cDNA拟南芥因其具有个体小，世代周期短和转化率高等特点，因此在植物研究中被广泛的作为一种模式生物。
为了将拟南芥的小基因组测序，日本、欧洲和美国的科学家共同合作完成了拟南芥基因组测序工程。
拟南芥5条染色体中的2条（2号和4号染色体，不包括核仁组织区和着丝点区）在1991年进行了测序，其余3条染色体在2000年进行了测序。
2001年5月，大约127，000个拟南芥表达序列标签（ESTs）被提交到EST 数据库（dbEST）。
其中的序列来自法国，美国和日本共同合作的大范围EST工程。
这些工程已从不同的组织、器官、种子和发育阶段的拟南芥中获得EST数据。
然而，这些基于cDNA文库的EST工程中的大部分的插入片段都不是全长的。
ESTs有助于为表达基因提供标签，大圣无法进行基因功能的进一步研究。
因此，全基因组范围的获得表达基因的全长cDNA，对于在功能基因组学领域中分析基因及其产物的表达标签和功能是十分重要的。
1.拟南芥全长cDNA文库的构建目前已应用biotinylated CAP trapper法建立了拟南芥的全长cDNA文库。
最近，研究人员有将trehalose-ther-moactivated反转录酶应用到CAP trapper法中，构建了不同处理的拟南芥全长cDNA文库。
乌克兰鳞鲤丙酮酸激酶基因全长cDNA克隆及组织表达分析
乌克兰鳞鲤丙酮酸激酶基因全长cDNA克隆及组织表达分析方珍珍;段霁航;程镇燕;孙金辉;白东清;乔秀亭【摘要】A full-length c DNA encoding pyruvate kinase(PK)was cloned from liver cells of Ukraine scale carp by RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends(RACE)methods.The analysis on PK gene c DNA sequence(1913 bp)indicated that this gene contained a 1617 bp open readingframe(ORF)and encoded a 538-AA polypeptide.The PK protein had a calculated molecular weight of 58.72 ku and a PI of 6.57,with active site and domain boundaries.The PK of Ukraine scales carp had high conservatism,with identity of as high as 84% ~92% with other fishes,and 68% between Ukraine scales carp and mammals.The tissue distribution of PK mRNA in liver,brain,kidney,heart,muscle and intestine of Ukraine scale carp was an-alyzed by semi-quantitative RT-PCR method using β-actin gene as the internal control.The results showed that in the fish fed low-carbohydrate diet group,PK were expressed in each tissue,highly expressed in liv-er,brain and heart;the fish fed high-carbohydrate diet,PK were highly expressed in liver and brain,and weakly expressed in heart and muscle.%采用 RT-PCR和 RACE方法克隆乌克兰鳞鲤丙铜酸激酶基因全长cDNA 序列,试验结果表明,乌克兰鳞鲤丙酮酸羧激酶基因cDNA全长1913 bp,其中开放阅读框1617 bp,编码538个氨基酸,预测蛋白分子质量为58.72 ku,等电点为6.57,3′非翻译区长154 bp及多聚腺苷酸尾巴,5′非翻译区长143 bp.具有活性位点和结构域边界.乌克兰鳞鲤丙酮酸羧激酶基因保守性较好,与已知的草鱼、斑马鱼和绿河鲀的相似性为84% ~92%,与哺乳类(人类丙酮酸羧激酶)的相似度为68%.以β-actin基因为内标,采用半定量RT-PCR方法对丙酮酸羧激酶基因在肝胰脏、脑、肾脏、心脏、肌肉、肠道等组织的表达进行研究,结果表明,低糖组丙酮酸羧激酶基因在各组织中均有表达,在肝胰脏、脑和心脏中表达较丰富;高糖组丙酮酸羧激酶基因在肝胰脏、脑、肾脏和肠道中有明显表达,其中在肝胰脏和脑中的表达量较丰富,在心脏和肌肉中的表达很微弱.【期刊名称】《水产科学》【年(卷),期】2018(037)002【总页数】6页(P249-254)【关键词】乌克兰鳞鲤;丙铜酸激酶;快速扩增cDNA末端;全长cDNA【作者】方珍珍;段霁航;程镇燕;孙金辉;白东清;乔秀亭【作者单位】天津农学院水产学院,天津市水产生态及养殖重点实验室,天津300384;天津农学院水产学院,天津市水产生态及养殖重点实验室,天津300384;天津农学院水产学院,天津市水产生态及养殖重点实验室,天津300384;天津农学院水产学院,天津市水产生态及养殖重点实验室,天津300384;天津农学院水产学院,天津市水产生态及养殖重点实验室,天津300384;天津农学院水产学院,天津市水产生态及养殖重点实验室,天津300384【正文语种】中文【中图分类】Q785丙酮酸羧激酶(PK)属于丙酮酸激酶超家族的一员，它是糖酵解过程中第三个限速酶，即催化糖酵解最后一步的关键酶：在钾离子和镁离子参与下，丙酮酸激酶催化磷酸烯醇式丙酮酸和二磷酸腺苷转化成丙酮酸和三磷酸腺苷。
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全长CDNA克隆方法
以MITF基因为例,简述全长CDNA克隆的方法.
方法分三步: 1.克隆中间片段 2.克隆3’片段 3. 克隆5’片段,然后再将3者重复序列删除,拼接起来.
1.中间序列克隆
提取锦鲤的皮肤组织的mRNA,然后跑胶检测。
如果有2根带,则显示mRNA 提取成功. 然后反转录成CDNA，检测B-actin。
首先在NCBI上查找mitf基因,获取该基因的序列,CDS区,基因编号.并且保存,以备以后比对序列用.选取斑马鱼的mitf a 为模板.
引物合成:用Primer 5设计
a.引物长度:长度一般在18-30个碱基。
一般都是18-24个左右。
b.GC含量：一般引物GC含量为40%-60%，一对引物的GC含量和TM值要协调。
如果引物存在严重的GC或者AT倾向，可以在引物最后加适当A.T.C.G尾巴c.退火温度：退火温度需要比解链温度低5度。
适当提高引物退火温度可以使
PCR的特异性增加。
一般设计一对引物的TM值应该要比较接近，一般在0-4度以内，不会影响PCR的产率。
温度在55-75度之间。
d.避免扩增模板的二级结构区域，一对引物之间不应该存在4个连续碱基的同
源性或者互补性。
选取时尽量选取分高的组合。
设计引物时，尽量增加克隆的中间片段长度，为避免5‘和3’克隆出现长片段。
引物设计好以后，根据引物的TM值，首先设计温度，做梯度PCR. 比如TM为65度，设计梯度时可以设计63,64,65,66. 4个梯度。
然后根据跑胶结果确定大体系的TM值，如有目的带，直接胶回收。
然后进行链接，转化。
送公司测序。
测序结果出来后，用Chmas软件打开，并将其转化为TXT格式的碱基序列。
用Jellyfish里面，找特异性的正向，反向引物。
找完正向后，将序列反过来再找反向引物。
只有都能找到2个引物的序列才能算测序成功。
将特异性引物两端的序列全部删除，（那是对应载体的序列）。
保存克隆的中间序列，然后跟斑马鱼的序列对比，一般重复性在90%以上。
若有几组序列满足要求，用着几组进行对比突变的地方按照重复多的碱基最为标准。
尽量选2组以上序列。
2. 3‘克隆
克隆3‘的时候要重新用mRNA做反转录，在做反转录的时候要加上3‘接头。
（接头由自己合成）。
设计引物：正向的外侧引物和内侧引物
反向的UPM和NUP
一般设计特异性引物的TM值为接近60度，最后60度以上。
首先用外侧引物和UPM做10ul体系的下体系。
然后用其PCR产物模板稀释10-40倍。
用作内侧引物+NUP的PCR反应模板。
做大系统检测最适合TM值。
找到以后直接进行胶回收，链接转化，测序。
第一轮的TM值需要摸索，第一轮以后通常是弥散的条带。
如果多次尝试还是不
行，可以更换引物。
测序结果出来后，找特异性内侧引物和NUP，找得到才能用于分析。
去掉内侧引物和NUP外侧的序列，并且去掉NUP
然后和中间序列对比，去掉重复的序列。
3. 5‘克隆
用专门的5’反转录试剂盒得到5‘CDA。
这个步骤很重要。
然后检测B-antin 设计引物：
正向的NUP和UPM
反向的内侧和外侧特异性引物。
5‘的特异性引物TM值最好要在68度以上。
特异性才好。
用正向UPM和反向外侧引物做pcr，第一轮稀释10-40倍。
用作第二轮的模板，第二轮NUP+反向内侧引物。
做大体系后胶回收，链接转化。
送测序。
去掉NUP后比对中间序列，去掉重负的序列，链接起来。