PCR引物设计及测序结果分析

PCR结果。1－2、PCR产物（3ul样品）
PCR常见问题
1. 无扩增产物
模板:含有抑制物，含量低
Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 退火温度太高
2. 非特异性扩增
引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 退火温度偏低 循环次数过多
3. 拖尾
引物（primers)

引物是人工合成的两段寡
核苷酸序列，一个引物与
感兴趣区域一端的一条 DNA模板链互补，另一个 引物与感兴趣区域另一端 的另一条DNA模板链互补
5’ 3’
Sense primer
5’
→
Antisense primer
←
3’
。(上游引物与DNA序列一
致,下游引物要反相互补.)
引物的重要性
PCR引物设计及测序结 果分析
Content

聚合酶链式反应（PCR） 的技术 原理及结果分析

PCR引物设计原理及相关软件的使 用（ Primer Premier 5.0 ）

测序结果分析
一 . PCR的技术原理及结果分析

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR) ，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法 ，故又称为基因的体外扩增法。
94˚C
Tm
从结合在特定 DNA模板上的 引物为出发点 ，按5’→3’的 方向沿着模板 顺序合成新的 DNA链
72˚C
PCR出现的问题：

引物是否合 适?
PCR扩增未得到目的条带？ 扩增出目的条带之外的多条带（非特异性 ）？ 扩增的目的条带很弱？
引物设计是PCR 技术中至关重要的一环

Fra Baidu bibliotek
PCR结果分析
PCR的应用
1、目的基因的克隆： PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基
因片段提供了简便快速的方法。
2、基因的体外突变：
可以随意设计引物在体外对目的基因片段
进行嵌和、缺失、点突变等改造。
3、DNA和RNA的微量分析：
PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很低 ，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。实际工作中， 一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检 测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。
Northern Blot
TaqDNA聚合酶
模板DNA dNTP 引物 Buffer
模板DNA
预变性
dNTP
引物
94oC
5’
Buffer
循 环 仪
94℃
55 ℃
72 ℃
PCR技术的基本过程
变性
退火
延伸
在加热或碱性 条件下可使DNA 双螺旋的氢键 断裂，形成单 链DNA
模板与引物的 复性,引物是与 模板某区序列 互补的一小段 DNA片段。

M
1
2
模板不纯或降解 Buffer不合适


退火温度偏低
酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多
产物在凝胶上呈Smear状态
4. 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)
交叉污染 对策 操作时防止将靶序列吸入加样枪内或 溅出离心管外； 除不能耐高温的物质外，所有试剂器 材均高压消毒。离心管及枪头等一次 性使用。 各种试剂先进行分装，低温贮存。 设置阳性和阴性对照，重复实验

2. 引物的GC%含量：一般为40%-60%。上 下游引物的GC含量不能相差太大。
3. 引物序列在模板内应当没有相似性较高， 尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易 导致错配。 4. 引物3’端的末位碱基避开密码子的第3位， 且最好不选择A 5. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
6.
引物无回文对称结构，否则会形成发夹 结构；引物自身不能配对，否则易形成约 两个引物长度的引物二聚体；
正义链
反义链
基本分子生物学研究手段
PCR PCR反应液体的成分: PCR循环的程序:
PCR原理：
基本分子生物学研究手段
RT-PCR
反转录PCR
mRNA---cDNA-----PCR
基本分子生物学研究手段
Cutting by enzymes
基本分子生物学研究手段
Southern Blot
基本分子生物学研究手段
引物二聚体
发夹结构
7. 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基 ，在5’端引入一段非模板依赖性序列。
5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位
点5’端加上适当数量的保护碱基）。
5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物
中引入该位点的点突变以作研究。

PCR不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分 析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调 控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊 断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。
PCR技术原理
以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与 模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引 物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机 制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这 一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。


引物的内部稳定性
引物的保守性与特异性
扩增区域的二级结构
基本原则：

引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体
或发夹结构

引物不能在模板的非目的位点引发DNA
聚合反应(即错配)。
一般原则：
1. 引物的长度：配对引物的长度一般在1530bp之间比较合适。

尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过 5℃） Tm值的计算：一般的公式：Tm = 4 (G+C) + 2(A+T)
4、基因转录水平检测
RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平.
5、基因突变分析：
利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突 变检测的敏感性。
二. PCR引物设计原理及相关软件的使用 （ Primer Premier 5.0 ）

引物 引物的重要性 引物设计的原则 引物同源性分析 引物设计软件 如何使用Primer Premier 5.0 酶切位点及保护碱基的添加
在整个PCR体系中,
引物占有十分重要的
地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA
特异结合，不与其他非目的DNA结合，
PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物
进行有效的延伸，可见引物设计好坏与
PCR结果密切相关。
引物设计原则

引物长度


碱基分布的均衡性
Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端