蛋白质在细胞和生物体的生命活动过程中

蛋白质在细胞和生物体的生命活动过程中，起着十分重要的作用。生物的结构和性质都与蛋白质有关。蛋白质还参与基因表达的调节，以及细胞中氧化还原、电子传递、神经传递乃至学习和记忆等多种生命活动过程。在细胞和生物体内各种生物化学反应中起催化作用的酶主要也是蛋白质。因此，蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。我们针对近年来有关蛋白质的分离纯化技术所取得的进展进行了综述，为今后的理论和应用研究提供依据。

1蛋白质分离纯化技术

1．1根据蛋白质带电性质不同的分离技术

1．1．1离子交换层析

以离子交换剂作为柱填充物，在中性条件下，根据由于蛋白质和多肽的带电性不同而引起的离子交换亲和力的不同而得到分离。其可分为阳离子柱和阴离子柱两大类，还有一些新型树脂，如大孔型树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶树脂等。Wu等[1]利用IEXC法，探讨分离牛碳酸酐酶异构体和牛血清白蛋白、鸡血清白蛋白酶的提取条件，获得了有价值的数据。赵荣乐等[2]以DEAE—C52离子交换层析和SephadexG50凝胶过滤成功地从盐源山蛭(Haemendipsa yunlyuanensis)头部分离纯化了抗凝血多肽，获得了蛋白质质量浓度为1．17mg／mL，抗凝血酶比活性为152．78U·mg的抗凝血多肽。

1．1．2电泳法

电泳为带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。蛋白质混合样品经过电泳后，被分离的各蛋白质组分的电泳迁移率互不相同，由各蛋白质组分所带的静电荷以及分子大小和形状的不同而达到分离。常用SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳，毛细管电泳在纯化蛋白的方面也得到了很好的应用[3]。翁瑜等[4]用双向凝胶电泳比较3种常用蛋白质提取方法可以看出双向凝胶电泳的效果更好。

1．2根据蛋白质溶解度不同的分离技术

1．2．1蛋白质的盐析

蛋白质在低盐浓度下的溶解度随着盐溶液浓度升高而增加，此称盐溶；当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出，此称盐析，从而达到分离纯化的效果。一般粗抽提物常用该法进行粗分。

1．2．2有机溶剂沉淀法

有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中便沉淀析出。利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法即为有

机溶剂沉淀法。常用于蛋白质和酶的提纯中。

1．2．3等电点沉淀法

利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质具有不同的等电点的特点进行分离的方法。用于提取后去除杂蛋白，通过变动提取液的pH使某些与待提纯的蛋白质等电点相距较大的杂蛋白从溶液中沉出。但此法很少单独使用，可与盐析法结合使用。

1．3根据蛋白质分子大小不同的分离技术

1．3．1超滤

超滤法是利用压力或离心力，使用一种特制的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。因此根据蛋白质分子大小的不同，选择不同规格的滤膜进行超滤，从而使蛋白质得到分离。樊晶等应用萃取一超滤两步法从过期人血中提取人血红蛋白[5]。

1．3．2凝胶层析

混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离，在洗脱过程中，分子质量最大的物质因不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，致使最后流出柱外。它是一种快速而简便的分离分析技术，由于设备简单，操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，因此被生物化学、分子生物学、生物工程以及医药学等领域广泛应用[6]。王海英等[7]，以大菱鲆肠道为材料，DEAE—SepharoseFastFlow离子交换层析、SephadexG一100凝胶过滤层析分离纯化，获得大菱鲆肠蛋白酶I的电泳纯制品。董转年等[8]，对天麻初提液两次超滤(3kDa和1kDa超滤膜)，凝胶过滤和快速蛋白液相色谱(FPLC)分离纯化，得到天麻多肽，此肽具有良好的亲水性。

1．4根据配体特异性的分离技术——亲和层析

利用生物大分子与某些相对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离生物大分子的色谱方法。只需要一步处理即可使某种待分离的蛋白质从复杂的蛋白质混合物中分离出来，达到千倍以上的纯化，并保持较高的活性。目前亲和层析技术被广泛地应用在蛋白质研究和制备领域，是分离纯化以及分析生物大分子尤其是蛋白质的有力工具。利用该法从粗提液中经过一次简单的处理便可得到所需的高浓度活性物质[9]。Reddy等[10]应用CibacronBlue亲和层析的方法从心肌网状组织中提取了Ca+-腺苷三磷酸酶。

1．5根据选择性吸附的分离技术

1．5．1羟磷灰石层析

吸附剂羟磷灰石可用于分离蛋白质和核酸。蛋白质中带负电基团与羟磷灰石晶体表面的钙离子结合，而带正电基团与磷酸基相互作用，羟磷灰石对蛋白质的吸附容量比较大。因此，根据蛋白质分子与吸附剂羟磷灰石之问的吸附能力和解吸性质的不同而达到分离的目的。

1．5．2疏水作用层析

根据蛋白质表面的疏水性差别发展起来的一种纯化技术。其中，连接在支持介质上的疏水基团与蛋白质表面上暴露的疏水基团结合。但是疏水层析的某些洗脱条件可能导致蛋白质的变性，而且还存在不可预测性，对某些蛋白质分离效果很好，对另一些则不好。因此，近年来发展的新方法，常用硫酸铵沉淀、离子交换和亲和层析之后，进行疏水层析的样品不需要透析、凝胶过滤等方式脱盐。

1．6高效液相色谱层析(HPLC)

HPLC是一个高效快速分离化合物的方法，由于其分辨率高，速度快，重复性好，适用面广，灵活性强，灵敏度高等特点，使它在近年生物大分子的分离和纯化方面占据了极其重要的地位。因此，它能有效地分离各种多肽混合物，特别适用于分子质量不大的蛋白质和多肽物质的分离、纯化和鉴定，在蛋白质及多肽研究中已得到了广泛的应用。其中反相高效液相色谱(RPLC)被广泛应用于分子质量不大的蛋白质分离、纯化和鉴定上，所使用的RPLC 约95％是C18反相硅胶HPLC[11]。Haught等[12]用RPLC对抗菌肽进行分离纯化；Nakagomi 等[13]用RPLC纯化了血管紧张素I转换酶抑制肽；Bonetto等[14]用RPLC纯化了钙结合蛋白D9K；李医明等[15]用RPLC纯化了蝎毒素多肽BmK4112。

1．7大孔吸附树脂法

一类薪型非离子型具有大孔结构的高分子化合物，具有吸附和筛选性能，容易再生，所以在分离纯化蛋白质时具有条件温和，设备简单和操作方便的特点[16]。

2结论

目前，除上述技术外，如移动界面电泳，各种形式的区带电泳，特别是圆盘凝胶电泳、毛细管电泳以及等电聚焦点用等均具有很高的分辨率，可用于蛋白质的分离纯化。纤维素离子交换剂和Sephadex离子交换剂的离子交换层析，HPLC和亲和层析法都是有效的分离纯化方法。分离蛋白质混合物的方法有很多，需根据具体的实验要求和设计选择最适合的纯化方法才能达到最优的纯化效果。

[1] Wu D，Walters prefects of stationary phase lig and density on high performance iron-exchange chromatography of protein [J]．J Chromatogr，1992．