离心原理PPT
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一、步骤 1. 在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。 2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank‘s液或RPMI1640 充分混
匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清 楚的界面，水平离心2000rpm×20分钟。 3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank‘s液，下层 主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上 、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄 带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含 有血小板。
事
项
15
第三节 常用离心方法及应用
制备离心技术
制备离心技术：是以分离纯化生化物 质、细胞、亚细胞粒子为目的离心技术。
一般制备离心技术 制备超速离心技术
差速沉降离心 差速区带离心 密等度密梯度度区区带带离离心心16
密度梯度离心法
概念：简称区带离心法，是将样品加在 惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡， 在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某 些特定位置上，形成不同区带的分离方法。
透明度：玻璃管和聚碳酸酯是透明的，而聚丙烯管为半透 明
能否刺穿：以刺穿法收集样品，纤维素乙酸管和聚丙烯管 适合
管帽：大多数角式及垂直管式转子要求离心管有管帽，用 以防止使用过程中样品漏出并在离心过程中支撑离心管
离 心 机 的 使
使用前在无负荷的情况下，开动离心机以便检查其 转动是否平稳；检查套管内是否有橡皮软垫。
检查合格后,将用天平平衡好的装有样品的离心管 放入离心套管内，位置要对称。
盖上离心机盖子，接通电源，缓慢加速到所需速度。
用 离心完毕，待转速缓慢逐步调回零位，任其自动停 及 稳后，方可打开盖子取出离心管，切勿用手助停。
注 离心过程中如发现声音不正常，机身不稳，应立即
意 切断电源，待检查排除故障后方能使用。
12
离 心 管
用于速度较低的离心，具有管壁 玻璃离心管 光滑、透明和易清洁等优点，但易
破碎，故不能用于高速离心。
超速离心时，离心管需要封口。由于 塑料离心管 制造离心管的塑料材料很多，如聚丙
烯、聚乙烯、硝化纤维素、尼龙等， 其各有自己的理化特性和对各种实验 试剂的化学稳定性。
不锈钢离心管 强度大，刚性好，通常对碱的 耐受较好，抗酸性较差。使用时 配对使用。
20%S或分子量相差3倍
差速区带离心 不同颗粒存在着一
定的沉降速度差
等密度区带离心
不同颗粒存在着一定浮力密度差
17
密度梯度离心原理
不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离 心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在 密度梯度不同区域上形成区带的方法。
介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小 于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗糖、甘 油；
第五章 离心技术
1
第一节 离心技术的基本原理
离心技术：是利用旋转运动产生的离心 力,根据物质的沉降系数或浮力密度的差 别进行物质的分析、分离、浓缩和提纯的 一种技术。
Ø 分离、纯化样品; Ø 对已纯化的样品进行结构和性质的分析。
2
一、离心的一般原理
颗 粒
颗粒的密度、形状、大小
运 动
液体介质的密度、粘度和重力场
的 的强度 方
向 和
悬浮颗粒在液体介质的扩散运动
速 度
颗粒越小，则沉降越慢，
扩散现象越严重。
3
1、离心力和相对离心力 离心力(centrifugal force，F)
指悬浮颗粒在离心过程中 所受的离开旋转中心轴的作 用力，由下式计算：
F = m w2 r
¡相对离心力( relative centrifugal force， RCF) ：在离心场中颗粒所受的离心力相 当于它受到的地球重力的倍数（×g ）。
密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管 口到管底逐步升高的密度梯度。
18
密度梯度离心法应用
利用密度梯度离心的原理，用ficoll液或precoll液分离和纯化人或动物 外周血单个核细胞（PBMC）。
目前比较常用ficoll密度梯度法。
19
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞（PBMC）的实验方法
的某物质沉降系数为多少个S，即指此单位。
5
S 的数值受颗粒的相对分子质量和形状
等特性的影响。
†预计沉降时间；
†测定物质相对分子质量。
6
3、沉降速度（sedimentation velocity, v）
沉降速度是指在离心力作用下，单位 时间内颗粒沉降的距离。
7
4 、沉降时间（t）和相对分子质量（Mr）
选用离心管时应考虑的因素：
容量：由样品的体积决定。高速离心时离心管必装满
形状：收集沉淀用圆锥形管底的离心管较好；而进行密度 梯度离心时圆底离心管更有用
最大离心力：标准的玻璃管仅用于低速离心（小于2000g） 耐腐蚀性：详细信息可参考厂家的说明书
灭菌：一次性塑料离心管出厂时通常是消过毒的。玻璃管 及聚丙烯管可重复灭菌使用。
20
4. 用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另 一离心管中，加入５倍以上体积的Hank‘s液或 RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。
5. 末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的 RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％ 台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格 内的细胞总数。
沉降时间决定于颗粒的沉降速度和沉 降距离。
t
Байду номын сангаас
w 2d 2 (
)
ln
R max R min
t
1 S
[
ln
R
max ln
w2
R
min
]
用于差速离心实验 8
第二节 离心设备
离心机的分类
按转速分为低速、高速和超速三种； 按用途分为实验型和工业型两种，前者
分为分析型和制备型两种； 按使用温度分为常温和冷冻两种； 按驱动方式分为手摇式、油涡轮式、气
4
2 、沉降系数(sedimentation coefficient, S)
沉降系数是指在单位离心力作用下，待 分离颗粒的沉降速度 。
¡ S的单位为秒，为了纪念离心技术早期的奠基人
Svedberg，而把10-13秒称为一个Svedberg单位
(S)，即 l S = 10-13秒。在生物学各种论文中常见
动式、电动式和磁悬式等。
9
离心机的构造
†转头 †驱动装置 †速度控制系统 †冷却装置 †真空装置 †光学检测系统
preparative ultracentrifuge
10
离 心 转 头
a 水平转头
b 角式转头 c 垂直转头
角度在14-40℃ 之间
11
实验中常用的是普通离心机（转速一 般不高于4000rpm），用于分离血清 和沉淀细胞、大的沉淀物等。
匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清 楚的界面，水平离心2000rpm×20分钟。 3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank‘s液，下层 主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上 、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄 带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含 有血小板。
事
项
15
第三节 常用离心方法及应用
制备离心技术
制备离心技术：是以分离纯化生化物 质、细胞、亚细胞粒子为目的离心技术。
一般制备离心技术 制备超速离心技术
差速沉降离心 差速区带离心 密等度密梯度度区区带带离离心心16
密度梯度离心法
概念：简称区带离心法，是将样品加在 惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡， 在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某 些特定位置上，形成不同区带的分离方法。
透明度：玻璃管和聚碳酸酯是透明的，而聚丙烯管为半透 明
能否刺穿：以刺穿法收集样品，纤维素乙酸管和聚丙烯管 适合
管帽：大多数角式及垂直管式转子要求离心管有管帽，用 以防止使用过程中样品漏出并在离心过程中支撑离心管
离 心 机 的 使
使用前在无负荷的情况下，开动离心机以便检查其 转动是否平稳；检查套管内是否有橡皮软垫。
检查合格后,将用天平平衡好的装有样品的离心管 放入离心套管内，位置要对称。
盖上离心机盖子，接通电源，缓慢加速到所需速度。
用 离心完毕，待转速缓慢逐步调回零位，任其自动停 及 稳后，方可打开盖子取出离心管，切勿用手助停。
注 离心过程中如发现声音不正常，机身不稳，应立即
意 切断电源，待检查排除故障后方能使用。
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离 心 管
用于速度较低的离心，具有管壁 玻璃离心管 光滑、透明和易清洁等优点，但易
破碎，故不能用于高速离心。
超速离心时，离心管需要封口。由于 塑料离心管 制造离心管的塑料材料很多，如聚丙
烯、聚乙烯、硝化纤维素、尼龙等， 其各有自己的理化特性和对各种实验 试剂的化学稳定性。
不锈钢离心管 强度大，刚性好，通常对碱的 耐受较好，抗酸性较差。使用时 配对使用。
20%S或分子量相差3倍
差速区带离心 不同颗粒存在着一
定的沉降速度差
等密度区带离心
不同颗粒存在着一定浮力密度差
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密度梯度离心原理
不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离 心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在 密度梯度不同区域上形成区带的方法。
介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小 于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗糖、甘 油；
第五章 离心技术
1
第一节 离心技术的基本原理
离心技术：是利用旋转运动产生的离心 力,根据物质的沉降系数或浮力密度的差 别进行物质的分析、分离、浓缩和提纯的 一种技术。
Ø 分离、纯化样品; Ø 对已纯化的样品进行结构和性质的分析。
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一、离心的一般原理
颗 粒
颗粒的密度、形状、大小
运 动
液体介质的密度、粘度和重力场
的 的强度 方
向 和
悬浮颗粒在液体介质的扩散运动
速 度
颗粒越小，则沉降越慢，
扩散现象越严重。
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1、离心力和相对离心力 离心力(centrifugal force，F)
指悬浮颗粒在离心过程中 所受的离开旋转中心轴的作 用力，由下式计算：
F = m w2 r
¡相对离心力( relative centrifugal force， RCF) ：在离心场中颗粒所受的离心力相 当于它受到的地球重力的倍数（×g ）。
密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管 口到管底逐步升高的密度梯度。
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密度梯度离心法应用
利用密度梯度离心的原理，用ficoll液或precoll液分离和纯化人或动物 外周血单个核细胞（PBMC）。
目前比较常用ficoll密度梯度法。
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Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞（PBMC）的实验方法
的某物质沉降系数为多少个S，即指此单位。
5
S 的数值受颗粒的相对分子质量和形状
等特性的影响。
†预计沉降时间；
†测定物质相对分子质量。
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3、沉降速度（sedimentation velocity, v）
沉降速度是指在离心力作用下，单位 时间内颗粒沉降的距离。
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4 、沉降时间（t）和相对分子质量（Mr）
选用离心管时应考虑的因素：
容量：由样品的体积决定。高速离心时离心管必装满
形状：收集沉淀用圆锥形管底的离心管较好；而进行密度 梯度离心时圆底离心管更有用
最大离心力：标准的玻璃管仅用于低速离心（小于2000g） 耐腐蚀性：详细信息可参考厂家的说明书
灭菌：一次性塑料离心管出厂时通常是消过毒的。玻璃管 及聚丙烯管可重复灭菌使用。
20
4. 用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另 一离心管中，加入５倍以上体积的Hank‘s液或 RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。
5. 末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的 RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％ 台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格 内的细胞总数。
沉降时间决定于颗粒的沉降速度和沉 降距离。
t
Байду номын сангаас
w 2d 2 (
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ln
R max R min
t
1 S
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ln
R
max ln
w2
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用于差速离心实验 8
第二节 离心设备
离心机的分类
按转速分为低速、高速和超速三种； 按用途分为实验型和工业型两种，前者
分为分析型和制备型两种； 按使用温度分为常温和冷冻两种； 按驱动方式分为手摇式、油涡轮式、气
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2 、沉降系数(sedimentation coefficient, S)
沉降系数是指在单位离心力作用下，待 分离颗粒的沉降速度 。
¡ S的单位为秒，为了纪念离心技术早期的奠基人
Svedberg，而把10-13秒称为一个Svedberg单位
(S)，即 l S = 10-13秒。在生物学各种论文中常见
动式、电动式和磁悬式等。
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离心机的构造
†转头 †驱动装置 †速度控制系统 †冷却装置 †真空装置 †光学检测系统
preparative ultracentrifuge
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离 心 转 头
a 水平转头
b 角式转头 c 垂直转头
角度在14-40℃ 之间
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实验中常用的是普通离心机（转速一 般不高于4000rpm），用于分离血清 和沉淀细胞、大的沉淀物等。