荧光假单胞菌工程菌株的构建

荧光假单胞菌工程菌株的构建

摘要:采用基因工程的方法,将含有2,4DAPG基因的质粒pMON5122导入到野生型荧光假单胞菌株中,探索了不同热激时间、不同CaCl2浓度和荧光假单胞菌的不同生长时期对转化子形成的影响;结果表明,荧光假单胞菌生长到OD约0.53时,用0.025mol/L CaCl2处理细胞,热激3～4min,转化频率最高;

关键词:荧光假单胞菌;工程菌株;代谢产物;生物农药

荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)是植物根围和土壤中常见的一种有益细菌,分布广泛,易于繁殖。对植物病害,尤其是土传病害如猝倒病[1]、根腐病[2]、枯萎病[3]等均有很好的防治作用,是重要的有益微生物,在农业生产上具有非常重要的意义。

利用荧光假单胞菌防治植物病害的机制包括竞争铁元素和其他营养物质、生态位排斥作用(Nicheexclusion)、诱导植物产生系统抗性,以及产生拮抗微生物的代谢产物等。抗生作用一直以来都被认为是假单胞菌类生防作用的重要方面。2,4DAPG是荧光假单胞菌产生的一种具有抗真菌、抗细菌作用的酚类代谢产物,在抑制多种土传植物病害中占有重要地位,如它对防治由小麦全蚀病菌引起的小麦全蚀病起着重要作用。

为提高生防效果,扩大生防范围,更加有效地防治蔬菜等某些土传病害,我们进行了荧光假单胞菌工程菌株的构建。试图通过增加DAPG合成基因拷贝数的途径,来提高菌株的生防效果。工程菌株对黄瓜枯萎病的防治效果超过了野生菌株,为进一步研究一种新型、高效

的生物农药奠定了基础。

一．材料和方法

1.培养基

LB培养基:蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl10g,蒸馏水1000mL,pH7.5。选择培养基:在LB培养基中加入四环素至终浓度25μg/mL。沙-玉米粉培养基:沙98份,玉米粉2份,水少许。

2.质粒的提取、纯化和检测

采用碱裂解法提取质粒,并进行琼脂糖凝胶电泳检测。

3.荧光假单胞菌感受态细胞的制备

将荧光假单胞菌接种于LB液体培养基中,于28℃振荡培养过夜,以1%的接种量转接于10mL新鲜的LB培养液中,于28℃,240r/min振荡培养至OD约0.53,冰浴30min,离心收集菌体,加入5mL预冷的0.025mol/L CaCl2处理2h,离心,菌体用1mL预冷的0.025mol/L的CaCl2悬浮备用。

二．转化反应

将1～2μL(约1μg)pMON5122质粒DNA与200μL感受态细胞混匀,冰浴放置30min,42℃热激3min,冰浴中放置5min,加入800μL LB液体培养基,振荡培养1h,按每皿100μL涂布于含四环素的平板上,28℃培养约40h,挑取抗性菌落进行纯培养。

三．转化条件研究

在以上方法的基础上,分别改变CaCl2浓度、热激时间和荧光假单胞菌生长时期研究不同条件对转化子形成的影响。

四．结果与分析

工程菌的构建及鉴定

工程菌株的构建策略，将pMON5122质粒通过转化方法克隆入荧光假单胞菌感受态细胞中,根据克隆子的四环素抗性筛选出在四环素平板上生长的转化子。提取阳性重组子中的质粒pMON5122,用Hind Ⅲ和EcoRⅠ进行双酶切后,产生2个片断,大小分别为1015kb(与载体pRK415大小相同)和6.5kb,其中的小片段为DAPG合成基因表明DAPG 合成基因已经导入荧光假单胞菌野生菌株中。

CaCl2浓度对转化频率的影响

Ca2+在低温时可以使细胞壁的通透性及细胞表面的正电荷增加,这些改变有利于DNA的吸附和吸收。本试验用不同浓度的CaCl2即0.020,0.025,0.030和0.040mol/L处理荧光假单胞菌细胞,结果表明,用0.025mol/L CaCl2处理荧光假单胞菌细胞转化频率最高,0.040mol/L CaCl2处理转化频率最低,随着CaCl2浓度的提高,转化频率呈现升高—降低的变化趋势,浓度超过0.025mol/L时,转化频率急速下降。

热激时间对转化频率的影响

本试验在42℃时分别处理1,2,3,4min,目的在于促进荧光假单胞菌对DNA的吸收,热激时间直接影响转化子的形成,结果表明,处理1,2min时,没有转化子形成,处理3,4min时,转化频率较高.

生长时期对转化频率的影响

细菌的生长时期直接影响感受态细胞的建立。取不同生长时期的荧光假单胞菌,用0.025mol/LCaCl2处理进行转化,结果表明,在OD约0.53时,转化频率最高,OD大于或小于0.53时,转化频率均表现为下降趋势。

五、讨论

大多数细菌转化方法都依据Mandel和Higa在1970年的发现[9],首先用冰预冷的CaCl2溶液处理细菌然后作短暂的热处理,该处理方法改变了细胞膜的结构,在受体细胞中诱导了一种短暂的“感受态”,使质粒DNA能够穿过细菌细胞膜进入细胞,因此,CaCl2的浓度和热处理时间对质粒的转化至关重要。用质粒转化大肠杆菌时,通常CaCl2浓度为011mol/L,42℃热激90s。但在本试验中,当CaCl2浓度为0.025mol/L,42℃热激3min时,转化频率最高。

微生物对病原菌具有抑制作用的重要机制之一就是产生抗菌活性物质。假单胞菌能够产生酚嗪酸、硝吡硌菌素、藤黄绿脓菌素和2,42二乙酰藤黄酚等多种抗生物质。目前假单胞菌已成功应用于生产并且商品化。通过遗传改良提高荧光假单胞菌的活性已有成功的报道。