基因编辑技术在花卉育种中应用的研究进展

基因编辑技术在花卉育种中应用的研究进展作者：阚婷婷汪冲郑志仁张辉来源：《上海师范大学学报·自然科学版》2021年第01期摘要：相较传统育种，基因编辑育种能够更精准、高效地改变植物的性状，获得优良的品种. 目前应用基因编辑技术于花卉育种研究的报道相对较少. 该文综述了基因编辑技术，特别是规律成簇的间隔短回文重复/CRISPR-关联核酸内切酶9（CRISPR/Cas 9）在花卉中的研究进展及其局限性，同时还就花卉基因编辑育种的发展方向进行了讨论，希望为将基因编辑更好地应用于花卉育种提供参考.关键词：花卉; 基因编辑; 规律成簇的间隔短回文重复/CRISPR-关联核酸内切酶9（CRISPR/Cas 9）; 育种中图分类号： Q 812 文献标志码： A 文章编号： 1000-5137（2021）01-0050-07Abstract： Gene editing breeding technology can change the plant traits and obtain excellent varieties more accurately and efficiently than the traditional breeding. There are few reported researches on ornamental plant breeding by using gene editing technology.In this review，we mainly summarize the progress on gene editing technology and its limitations，especially clustered regularly interspersed short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 （CRISPR/Cas 9） in ornamental plant breeding.The future research directions of gene editing in breeding of ornamental plants were discussed as well，which can provide some reference for its further application.Key words： ornamental plant; gene editing; clustered regularly interspersed short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 （CRISPR/Cas 9）; breeding0 引言隨着人们生活水平的提高，花卉作为装扮环境的主要因素之一，也越来越受到人们的喜爱.为了满足花卉市场需求，培育更多优质花卉品种是花卉育种工作者的共同目标.传统的花卉育种方法主要有杂交育种和突变育种[1]，虽然目前已经培育出了大量花卉品种，但是它们可变化的性状数量有限，且培育过程耗时费力.转基因技术是将影响重要性状的功能基因转入目标花卉品种中，可以快速获得新性状的花卉品种.目前通过该技术已经获得了很多优良的花卉新品种，如蓝色玫瑰和微小型菊花等[2].然而，由于各国对于转基因植物政策的限制，目前只有少数转基因花卉品种获得监管部门的批准并进入市场.以规律成簇的间隔短回文重复/CRISPR-关联核酸内切酶9（CRISPR/Cas 9）为代表的新一代基因编辑技术，是近年来生命科学领域中发展起来的革命性技术，可以通过对植物自身基因的快速、定点改变，实现对植物性状的精准改良，为农业技术革命提供了新契机.自2013年首次应用于植物的基因组编辑以来，CRISPR/Cas 9系统已在许多物种中得到应用：单子叶植物，如水稻、小麦、高粱、玉米等;双子叶植物，如拟南芥、烟草、大豆、番茄等.并获得了许多性状优良的新种质，如抗白粉病的小麦[3]及抗氧化的马铃薯[4]等.基因编辑技术同样可以提高花卉育种的效率，缩短育种的周期，改良更多花卉的性状等，弥补传统花卉育种的不足.目前已经有一些关于花卉基因编辑的研究报道，但涉及的品种还较少，技术也不够成熟.本文作者对目前已有的花卉基因编辑技术研究进行了综述，并对其应用在花卉育种中的局限性及今后的发展趋势进行了讨论.1 基因编辑原理及在作物育种中的应用基因编辑的原理是通过特异的引导序列对目标基因DNA双链进行切割，形成DNA双链断裂（DSB），机体通过自身的修复机制对DSB进行不精准修复时，会造成修复位点碱基的缺失或插入，从而导致基因功能的缺失[5].目前基因编辑系统主要有锌指核酸酶（ZFN）[6]、转录激活物样效应器核酸酶（TALEN）[7]和CRISPR/Cas 9系统[8].CRISPR/Cas 9系统有3个主要组成部分：Cas 9蛋白、CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）.Cas9是一个核酸内切酶，负责切割DNA序列.在工程化的CRISPR/Cas 9系统中，tracrRNA与crRNA 连接在一起，变成一条单链向导RNA（sgRNA）.sgRNA指导Cas 9实现DNA序列特异性的切割.自2012年CRISPR/Cas 9系统被用于体外DNA序列的切割，特别是2013年被用于哺乳动物体内特定DNA序列的编辑后，由于其操作简便、成本低和用途广泛等特点，在短短几年内被广泛应用，并被认为是生命科学研究领域的颠覆性技术之一，也是目前应用最为广泛的基因编辑工具[9].近年来，利用基因编辑技术改良作物性状的研究已经取得了一系列的成果.如在水稻中，对香味基因OsBADH2[10]、白叶枯病感病基因OsSWEET14 [11]、直链淀粉含量基因OsWaxy [12]等进行编辑，分别获得了具有香味、抗白叶枯病及糯性等特性的新种质，大大缩短了育种时间，提高了育种效率.在六倍体小麦中对MLO基因进行靶向敲除，产生了抗白粉病的小麦[3].在玉米中敲除Waxy1基因，使籽粒中的支链淀粉含量显著提高[13].在大豆中定向敲除脂肪酸去饱和酶2（FAD 2）基因，从而降低了亚油酸和α-亚麻酸的相对含量，同时增加了油酸的积累，提高了大豆油的食用品质[14].基因编辑技术已经在一些主要农作物育种中展现了巨大的潜力，这为将该技术应用于更多物种的性状改良中奠定了基础.2 花卉基因编辑研究进展基因编辑技术已成功用于矮牵牛、牵牛花、菊花、百合、蝴蝶兰和夏堇等花卉基因的编辑（表1），在有些物种中成功获得了性状改良的株系.2.1 矮牵牛的基因编辑研究矮牵牛（Petunia hybrida）作为花卉研究的一种模式植物，被广泛用于花色和花序发育研究.2016年，ZHANG等[15]在二倍体矮牵牛中，通过农杆菌介导法转化叶片，靶向八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因，在获得的阳性再生植株中，白化表型的株系占55.6%～87.5%.同年，SUBBURAJ等[16]通过核糖核蛋白复合物（RNPs）方法，在矮牵牛原生质体系统中，直接导入纯化的Cas9蛋白和sgRNA，成功对硝酸还原酶（NR）基因进行了靶向编辑.NAING等[17]通过农杆菌介导法转化叶片，用CRISPR/Cas9系统编辑矮牵牛的乙烯生物合成酶1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶1（ACO1）基因.在T0代株系中，检测到31.5%的靶位点突变频率，其中纯合株系、杂合株系和嵌合株系分别占2.5%，15.0%和82.5%.基因編辑株系中乙烯生成量减少，花期显著延长.该工作为通过基因编辑技术，利用植物乙烯生物合成基因延长花卉的花期提供了实验参考.野生矮牵牛（Petunia inflata）自交不亲和性是由多态性S位点调控的，S位点包含多个花粉特异性S位点F盒（SLF）基因和一个雌蕊特异性S-RNase基因.花粉中的每一个SLF蛋白都被组装成一个SCF（Skp1-Cullin1-F-box）E3泛素连接酶复合物.SUN等[18]通过CRISPR/Cas9系统靶向矮牵牛SCFSLF复合物中的Skp1亚基（SSK1）基因，对矮牵牛自交不亲和机制进行研究，在获得的3个再生植株中有1株的靶基因被成功编辑.2.2 日本牵牛花的基因编辑研究WATANABE等[19]首次报道了在日本牵牛花（Ipomoea nil）中针对花色的基因编辑，他们以花青素生物合成酶二氢黄酮醇-4-还原酶-B（DFR-B）基因为靶标，通过农杆菌介导法转化种子胚.在32株转基因株系中，有24株（75%）在靶位点产生突变，产生了花青素含量减少的白色花.这也是第一个将基因编辑技术用于改变高等植物花色的报道.日本牵牛花有多种花色品系，但是缺少黄色花，说明日本牵牛花花瓣中只有微量类胡萝卜素的积累.WATANABE等[20]研究类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCD），调控类胡萝卜素在花瓣中的积累.通过生物信息学分析，在牵牛花基因组中鉴定出7个CCD基因.测序和表达分析表明，CCD4可能参与花瓣类胡萝卜素的降解.他们利用CRISPR/Cas 9系统敲除了白花品种I.nil cv.AK77中的CCD4基因，使得白色的花瓣变成淡黄色.在日本牵牛花中，NAC（NAM/ATAF1，2/CUC2）类转录因子EPHEMERAL1（EPH1）是花瓣衰老的关键调控因子.SHIBUYA等[21]构建同时靶向EPH1基因中3个不同位置的CRISPR/Cas 9载体，并转化日本牵牛花，在获得的8株阳性转基因植物中都检测到了靶位点的突变.在T1代获得了靶位点纯合突变的株系，也成功获得一些不含T-DNA（Transfer DNA）插入的纯合株系，这些突变植株表现出明显的花瓣衰老延迟.2.3 菊花的基因编辑研究菊花是一种重要的观赏植物，但它是六倍体，基因组庞大，缺乏全基因组信息，这为菊花遗传改良带来了困难.KISHI-KABOSHI等[22]为了优化菊花中CRISPR/Cas 9基因编辑系统，首先创制了表达YGFP（yellowish-green fluorescent protein）基因的转基因菊花植株，再通过CRISPR/Cas 9系统对转基因植株中的YGFP基因进行编辑.在比较了CaMV 35S启动子和PcUbi启动子在菊花愈伤组织中的活性后发现，PcUbi启动子对菊花愈伤组织的基因编辑更有效.进一步利用PcUbi启动子表达Cas 9蛋白，并针对YGFP的两个位点设计了不同sgRNA，获得了YGFP突变的菊花植株，基因编辑效率为0～33%.这是利用CRISPR/Cas 9系统对菊花进行基因编辑的首次报道，为该技术用于菊花遗传改良提供了参考.2.4 夏堇的基因编辑研究夏堇（Torenia fournieri L.）属于木玄参科蝴蝶草属植物，是花卉研究中常用的模式植物.NISHIHARA等[23]利用CRISPR/Cas 9系统突变夏堇中参与类黄酮生物合成的关键基因黄烷酮3-羟化酶（F3'H），来改造夏堇花的颜色.在获得的基因编辑株系中，80%的植株表现出花色的变化，靶序列测序结果表明所有花色改变的株系，F3'H基因均发生了突变，突变类型包括碱基替换、插入或缺失等，这说明获得的花色变化表型是由F3'H基因的突变导致的.2.5 百合的基因编辑研究百合是常见的鲜切花之一，分布于世界各地.YAN等[24]首先在山丹百合（Lilium pumilum DC.Fisch.）和麝香百合（Lilium longiflorum White Heaven）中，分别通过体细胞胚和再生不定芽建立了稳定遗传转化体系，转化效率分别达到29.17%和4.00%.进一步，该工作通过CRISPR/Cas 9系统对2个百合属植物的PDS基因进行了敲除，在获得的再生植株中观察到完全白化、淡黄色和白绿色嵌合的表型.在此研究中，分别获得30.0%和5.17%的具有抗性和明显表型改变的山丹百合和麝香百合.该工作首次将CRISPR/Cas 9基因编辑系统成功应用于百合中，为百合的基因功能研究和种质改良奠定了重要的基础.2.6 蝴蝶兰的基因编辑研究2 花卉基因编辑研究进展基因编辑技术已成功用于矮牵牛、牵牛花、菊花、百合、蝴蝶兰和夏堇等花卉基因的编辑（表1），在有些物种中成功获得了性状改良的株系.2.1 矮牵牛的基因编辑研究矮牵牛（Petunia hybrida）作为花卉研究的一种模式植物，被广泛用于花色和花序发育研究.2016年，ZHANG等[15]在二倍体矮牵牛中，通过农杆菌介导法转化叶片，靶向八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因，在获得的阳性再生植株中，白化表型的株系占55.6%～87.5%.同年，SUBBURAJ等[16]通过核糖核蛋白复合物（RNPs）方法，在矮牵牛原生质体系统中，直接导入纯化的Cas9蛋白和sgRNA，成功对硝酸还原酶（NR）基因进行了靶向编辑.NAING等[17]通过农杆菌介导法转化叶片，用CRISPR/Cas9系统编辑矮牵牛的乙烯生物合成酶1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶1（ACO1）基因.在T0代株系中，检测到31.5%的靶位点突变频率，其中纯合株系、杂合株系和嵌合株系分别占2.5%，15.0%和82.5%.基因编辑株系中乙烯生成量减少，花期显著延长.该工作为通过基因编辑技术，利用植物乙烯生物合成基因延长花卉的花期提供了实验参考.野生矮牵牛（Petunia inflata）自交不亲和性是由多态性S位点调控的，S位点包含多个花粉特异性S位点F盒（SLF）基因和一个雌蕊特异性S-RNase基因.花粉中的每一个SLF蛋白都被组装成一个SCF（Skp1-Cullin1-F-box）E3泛素连接酶复合物.SUN等[18]通过CRISPR/Cas9系统靶向矮牵牛SCFSLF复合物中的Skp1亚基（SSK1）基因，对矮牵牛自交不亲和机制进行研究，在获得的3个再生植株中有1株的靶基因被成功编辑.2.2 日本牵牛花的基因编辑研究WATANABE等[19]首次报道了在日本牵牛花（Ipomoea nil）中针对花色的基因编辑，他们以花青素生物合成酶二氢黄酮醇-4-还原酶-B（DFR-B）基因为靶标，通过农杆菌介导法转化种子胚.在32株转基因株系中，有24株（75%）在靶位点产生突变，产生了花青素含量减少的白色花.这也是第一个将基因编辑技术用于改变高等植物花色的报道.日本牵牛花有多种花色品系，但是缺少黄色花，说明日本牵牛花花瓣中只有微量类胡萝卜素的积累.WATANABE等[20]研究类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCD），调控类胡萝卜素在花瓣中的积累.通过生物信息学分析，在牵牛花基因组中鉴定出7个CCD基因.测序和表达分析表明，CCD4可能参与花瓣类胡萝卜素的降解.他们利用CRISPR/Cas 9系统敲除了白花品种I.nil cv.AK77中的CCD4基因，使得白色的花瓣变成淡黄色.在日本牵牛花中，NAC（NAM/ATAF1，2/CUC2）类转录因子EPHEMERAL1（EPH1）是花瓣衰老的关键调控因子.SHIBUYA等[21]构建同时靶向EPH1基因中3个不同位置的CRISPR/Cas 9载体，并转化日本牵牛花，在获得的8株阳性转基因植物中都检测到了靶位点的突变.在T1代获得了靶位点纯合突变的株系，也成功获得一些不含T-DNA（Transfer DNA）插入的纯合株系，这些突变植株表现出明显的花瓣衰老延迟.2.3 菊花的基因編辑研究菊花是一种重要的观赏植物，但它是六倍体，基因组庞大，缺乏全基因组信息，这为菊花遗传改良带来了困难.KISHI-KABOSHI等[22]为了优化菊花中CRISPR/Cas 9基因编辑系统，首先创制了表达YGFP（yellowish-green fluorescent protein）基因的转基因菊花植株，再通过CRISPR/Cas 9系统对转基因植株中的YGFP基因进行编辑.在比较了CaMV 35S启动子和PcUbi启动子在菊花愈伤组织中的活性后发现，PcUbi启动子对菊花愈伤组织的基因编辑更有效.进一步利用PcUbi启动子表达Cas 9蛋白，并针对YGFP的两个位点设计了不同sgRNA，获得了YGFP突变的菊花植株，基因编辑效率为0～33%.这是利用CRISPR/Cas 9系统对菊花进行基因编辑的首次报道，为该技术用于菊花遗传改良提供了参考.2.4 夏堇的基因编辑研究夏堇（Torenia fournieri L.）属于木玄参科蝴蝶草属植物，是花卉研究中常用的模式植物.NISHIHARA等[23]利用CRISPR/Cas 9系统突变夏堇中参与类黄酮生物合成的关键基因黄烷酮3-羟化酶（F3'H），来改造夏堇花的颜色.在获得的基因编辑株系中，80%的植株表现出花色的变化，靶序列测序结果表明所有花色改变的株系，F3'H基因均发生了突变，突变类型包括碱基替换、插入或缺失等，这说明获得的花色变化表型是由F3'H基因的突变导致的.2.5 百合的基因编辑研究百合是常见的鲜切花之一，分布于世界各地.YAN等[24]首先在山丹百合（Lilium pumilum DC.Fisch.）和麝香百合（Lilium longiflorum White Heaven）中，分别通过体细胞胚和再生不定芽建立了稳定遗传转化体系，转化效率分别达到29.17%和4.00%.进一步，该工作通过CRISPR/Cas 9系统对2个百合属植物的PDS基因进行了敲除，在获得的再生植株中观察到完全白化、淡黄色和白绿色嵌合的表型.在此研究中，分别获得30.0%和5.17%的具有抗性和明显表型改变的山丹百合和麝香百合.该工作首次将CRISPR/Cas 9基因编辑系统成功应用于百合中，为百合的基因功能研究和种质改良奠定了重要的基础.2.6 蝴蝶兰的基因编辑研究2 花卉基因编辑研究进展基因编辑技术已成功用于矮牵牛、牵牛花、菊花、百合、蝴蝶兰和夏堇等花卉基因的编辑（表1），在有些物种中成功获得了性状改良的株系.2.1 矮牵牛的基因编辑研究矮牵牛（Petunia hybrida）作为花卉研究的一种模式植物，被广泛用于花色和花序发育研究.2016年，ZHANG等[15]在二倍体矮牵牛中，通过农杆菌介导法转化叶片，靶向八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因，在获得的阳性再生植株中，白化表型的株系占55.6%～87.5%.同年，SUBBURAJ等[16]通过核糖核蛋白复合物（RNPs）方法，在矮牵牛原生质体系统中，直接导入纯化的Cas9蛋白和sgRNA，成功对硝酸还原酶（NR）基因进行了靶向编辑.NAING等[17]通过农杆菌介导法转化叶片，用CRISPR/Cas9系统编辑矮牵牛的乙烯生物合成酶1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶1（ACO1）基因.在T0代株系中，检测到31.5%的靶位点突变频率，其中纯合株系、杂合株系和嵌合株系分别占2.5%，15.0%和82.5%.基因编辑株系中乙烯生成量减少，花期显著延长.该工作为通过基因编辑技术，利用植物乙烯生物合成基因延长花卉的花期提供了实验参考.野生矮牵牛（Petunia inflata）自交不亲和性是由多态性S位点调控的，S位点包含多个花粉特异性S位点F盒（SLF）基因和一个雌蕊特异性S-RNase基因.花粉中的每一个SLF蛋白都被组装成一个SCF（Skp1-Cullin1-F-box）E3泛素连接酶复合物.SUN等[18]通过CRISPR/Cas9系统靶向矮牵牛SCFSLF复合物中的Skp1亚基（SSK1）基因，对矮牵牛自交不亲和机制进行研究，在获得的3个再生植株中有1株的靶基因被成功编辑.2.2 日本牵牛花的基因编辑研究WATANABE等[19]首次报道了在日本牵牛花（Ipomoea nil）中针对花色的基因编辑，他们以花青素生物合成酶二氢黄酮醇-4-还原酶-B（DFR-B）基因为靶标，通过农杆菌介导法转化种子胚.在32株转基因株系中，有24株（75%）在靶位点产生突变，产生了花青素含量减少的白色花.这也是第一个将基因编辑技术用于改变高等植物花色的报道.日本牵牛花有多种花色品系，但是缺少黄色花，说明日本牵牛花花瓣中只有微量类胡萝卜素的积累.WATANABE等[20]研究类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCD），调控类胡萝卜素在花瓣中的积累.通过生物信息学分析，在牵牛花基因组中鉴定出7个CCD基因.测序和表达分析表明，CCD4可能参与花瓣类胡萝卜素的降解.他们利用CRISPR/Cas 9系统敲除了白花品种I.nil cv.AK77中的CCD4基因，使得白色的花瓣变成淡黄色.在日本牵牛花中，NAC（NAM/ATAF1，2/CUC2）類转录因子EPHEMERAL1（EPH1）是花瓣衰老的关键调控因子.SHIBUYA等[21]构建同时靶向EPH1基因中3个不同位置的CRISPR/Cas 9载体，并转化日本牵牛花，在获得的8株阳性转基因植物中都检测到了靶位点的突变.在T1代获得了靶位点纯合突变的株系，也成功获得一些不含T-DNA（Transfer DNA）插入的纯合株系，这些突变植株表现出明显的花瓣衰老延迟.2.3 菊花的基因编辑研究菊花是一种重要的观赏植物，但它是六倍体，基因组庞大，缺乏全基因组信息，这为菊花遗传改良带来了困难.KISHI-KABOSHI等[22]为了优化菊花中CRISPR/Cas 9基因编辑系统，首先创制了表达YGFP（yellowish-green fluorescent protein）基因的转基因菊花植株，再通过CRISPR/Cas 9系统对转基因植株中的YGFP基因进行编辑.在比较了CaMV 35S启动子和PcUbi启动子在菊花愈伤组织中的活性后发现，PcUbi启动子对菊花愈伤组织的基因编辑更有效.进一步利用PcUbi启动子表达Cas 9蛋白，并针对YGFP的两个位点设计了不同sgRNA，获得了YGFP突变的菊花植株，基因编辑效率为0～33%.这是利用CRISPR/Cas 9系统对菊花进行基因编辑的首次报道，为该技术用于菊花遗传改良提供了参考.2.4 夏堇的基因编辑研究夏堇（Torenia fournieri L.）属于木玄参科蝴蝶草属植物，是花卉研究中常用的模式植物.NISHIHARA等[23]利用CRISPR/Cas 9系统突变夏堇中参与类黄酮生物合成的关键基因黄烷酮3-羟化酶（F3'H），来改造夏堇花的颜色.在获得的基因编辑株系中，80%的植株表现出花色的变化，靶序列测序结果表明所有花色改变的株系，F3'H基因均发生了突变，突变类型包括碱基替换、插入或缺失等，这说明获得的花色变化表型是由F3'H基因的突变导致的.2.5 百合的基因编辑研究百合是常见的鲜切花之一，分布于世界各地.YAN等[24]首先在山丹百合（Lilium pumilum DC.Fisch.）和麝香百合（Lilium longiflorum White Heaven）中，分别通过体细胞胚和再生不定芽建立了稳定遗传转化体系，转化效率分别达到29.17%和4.00%.进一步，该工作通过CRISPR/Cas 9系统对2个百合属植物的PDS基因进行了敲除，在获得的再生植株中观察到完全白化、淡黄色和白绿色嵌合的表型.在此研究中，分别获得30.0%和5.17%的具有抗性和明显表型改变的山丹百合和麝香百合.该工作首次将CRISPR/Cas 9基因编辑系统成功应用于百合中，为百合的基因功能研究和种质改良奠定了重要的基础.2.6 蝴蝶兰的基因编辑研究2 花卉基因编辑研究进展基因编辑技术已成功用于矮牵牛、牵牛花、菊花、百合、蝴蝶兰和夏堇等花卉基因的编辑（表1），在有些物种中成功获得了性状改良的株系.2.1 矮牵牛的基因编辑研究矮牵牛（Petunia hybrida）作为花卉研究的一种模式植物，被广泛用于花色和花序发育研究.2016年，ZHANG等[15]在二倍体矮牵牛中，通过农杆菌介导法转化叶片，靶向八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因，在获得的阳性再生植株中，白化表型的株系占55.6%～87.5%.同年，SUBBURAJ等[16]通过核糖核蛋白复合物（RNPs）方法，在矮牵牛原生质体系统中，直接导入纯化的Cas9蛋白和sgRNA，成功对硝酸还原酶（NR）基因进行了靶向编辑.NAING等[17]通过农杆菌介导法转化叶片，用CRISPR/Cas9系统编辑矮牵牛的乙烯生物合成酶1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶1（ACO1）基因.在T0代株系中，检测到31.5%的靶位点突变频率，其中纯合株系、杂合株系和嵌合株系分别占2.5%，15.0%和82.5%.基因编辑株系中乙烯生成量减少，花期显著延长.该工作为通过基因编辑技术，利用植物乙烯生物合成基因延长花卉的花期提供了实验参考.野生矮牵牛（Petunia inflata）自交不亲和性是由多态性S位点调控的，S位点包含多个花粉特异性S位点F盒（SLF）基因和一个雌蕊特异性S-RNase基因.花粉中的每一个SLF蛋白都被组装成一个SCF（Skp1-Cullin1-F-box）E3泛素连接酶复合物.SUN等[18]通过CRISPR/Cas9系统靶向矮牵牛SCFSLF复合物中的Skp1亚基（SSK1）基因，对矮牵牛自交不亲和机制进行研究，在获得的3个再生植株中有1株的靶基因被成功编辑.2.2 日本牵牛花的基因编辑研究WATANABE等[19]首次报道了在日本牵牛花（Ipomoea nil）中针对花色的基因编辑，他们以花青素生物合成酶二氢黄酮醇-4-还原酶-B（DFR-B）基因为靶标，通过农杆菌介导法转化种子胚.在32株转基因株系中，有24株（75%）在靶位点产生突变，产生了花青素含量减少的白色花.这也是第一个将基因编辑技术用于改变高等植物花色的报道.日本牵牛花有多种花色品系，但是缺少黄色花，说明日本牵牛花花瓣中只有微量类胡萝卜素的积累.WATANABE等[20]研究类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCD），调控类胡萝卜素在花瓣中的积累.通过生物信息学分析，在牵牛花基因组中鉴定出7个CCD基因.测序和表达分析表明，CCD4可能参与花瓣类胡萝卜素的降解.他们利用CRISPR/Cas 9系统敲除了白花品种I.nil cv.AK77中的CCD4基因，使得白色的花瓣变成淡黄色.在日本牵牛花中，NAC（NAM/ATAF1，2/CUC2）类转录因子EPHEMERAL1（EPH1）是花瓣衰老的关键调控因子.SHIBUYA等[21]构建同时靶向EPH1基因中3个不同位置的CRISPR/Cas 9载体，并转化日本牵牛花，在获得的8株阳性转基因植物中都检测到了靶位点的突变.在T1代获得了靶位点纯合突变的株系，也成功获得一些不含T-DNA（Transfer DNA）插入的纯合株系，这些突变植株表现出明显的花瓣衰老延迟.2.3 菊花的基因编辑研究菊花是一种重要的观赏植物，但它是六倍体，基因组庞大，缺乏全基因组信息，这为菊花遗传改良带来了困难.KISHI-KABOSHI等[22]为了优化菊花中CRISPR/Cas 9基因编辑系统，首先创制了表达YGFP（yellowish-green fluorescent protein）基因的转基因菊花植株，再通过CRISPR/Cas 9系统对转基因植株中的YGFP基因进行编辑.在比较了CaMV 35S启动子和PcUbi启动子在菊花愈伤组织中的活性后发现，PcUbi启动子对菊花愈伤组织的基因编辑更有效.进一步利用PcUbi启动子表达Cas 9蛋白，并针对YGFP的两个位点设计了不同sgRNA，获得了YGFP突变的菊花植株，基因编辑效率为0～33%.这是利用CRISPR/Cas 9系统对菊花进行基因编辑的首次报道，为该技术用于菊花遗传改良提供了参考.2.4 夏堇的基因编辑研究夏堇（Torenia fournieri L.）属于木玄参科蝴蝶草属植物，是花卉研究中常用的模式植物.NISHIHARA等[23]利用CRISPR/Cas 9系统突变夏堇中参与类黄酮生物合成的关键基因黄烷酮3-羟化酶（F3'H），来改造夏堇花的颜色.在获得的基因编辑株系中，80%的植株表现出花色的变化，靶序列测序结果表明所有花色改变的株系，F3'H基因均发生了突变，突变类型包括碱基替换、插入或缺失等，这说明获得的花色变化表型是由F3'H基因的突变导致的.2.5 百合的基因编辑研究百合是常见的鲜切花之一，分布于世界各地.YAN等[24]首先在山丹百合（Lilium pumilum DC.Fisch.）和麝香百合（Lilium longiflorum White Heaven）中，分別通过体细胞胚和再生不定芽建立了稳定遗传转化体系，转化效率分别达到29.17%和4.00%.进一步，该工作通过CRISPR/Cas 9系统对2个百合属植物的PDS基因进行了敲除，在获得的再生植株中观察到完全白化、淡黄色和白绿色嵌合的表型.在此研究中，分别获得30.0%和5.17%的具有抗性和明显表型改变的山丹百合和麝香百合.该工作首次将CRISPR/Cas 9基因编辑系统成功应用于百合中，为百合的基因功能研究和种质改良奠定了重要的基础.。