细胞爬片制备详细过程

细胞爬片染色步骤

免疫组化法：
1 胰酶消化细胞，收集至离心管；调整样本细胞数为1×106/ml；
2 将单细胞悬液滴加至平皿内无菌载玻片表面，置于37℃ 5%的加湿CO2孵箱中过夜，使细胞爬片。

3 吸弃平皿内培养上清，加入新鲜培养基，用无菌培养基洗3次；
4 PBS冲洗相应方案的载玻片3次；
5 将载玻片置于95%乙醇中固定约1h；
6 倒置相差显微镜下观察，并划定载玻片上细胞爬片密集区；
7 在相应区域滴加按一定比例稀释后一抗，4℃冰箱内过夜湿孵。

阴性对照以PBS缓冲液代替一抗。

8 先暂复温30min，后PBS冲洗载玻片3次；
9 滴加二抗，室温湿孵30min；后PBS冲洗载玻片3次；
10 DAB显色：将配置好的DAB溶液滴加至载玻片上，室温下孵育3min至载玻片略显黄色；
11 清水充分冲洗载玻片，苏木素复染核3-5min，清水冲洗，盐酸酒精分化20s，清水冲洗，氨水返蓝3min，清水冲洗，后置于75%-80%-95%-无水酒精中脱水，每步骤约2min；
12 将载玻片置于1、2、3道二甲苯中，各约15min，中性树脂封片，置于阴凉通风处风干。

免疫荧光技术试验流程

免疫荧光技术试验流程免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。

它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。

很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。

以荧光抗体方法较常用。

用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。

免疫细胞荧光试验流程：1、细胞爬片制备1）、将盖玻片放入培养瓶或多孔板中2）、细胞生长实现60％后取出盖玻片3）、用PBS清洗盖玻片3次4）、将盖玻片（细胞面朝上）浸入冷丙酮或4％多聚甲醛或中性福尔马林中10至20分钟（盖上盖子以防止蒸发）5）、用PBS清洗盖玻片3次6）、将盖玻片放在滤纸上（细胞朝上）7）、干燥8—10小时，放入—20°C保管8）、试验前解冻爬片，在室温下用中性PBS浸泡10—15分钟注意：使用多聚甲醛和福尔马林固定可能会导致绿色光谱中的自发荧光。

在这种情况下，可以试验红色或红外的荧光素。

2、破膜1）、0.1％Triton孵育10min2）、PBS洗涤3次，每次3分钟3、抗原修复1）、用滤纸擦干细胞爬片2）、在爬片上加入如胰蛋白酶或其它酶抗原修复液3）、在室温下孵育10分钟4）、用PBS洗涤3次，每次10分钟4、封闭1）、在爬片上加入5％BSA封闭液（种属与二抗来源相同）2）、37°C孵育30分钟3）、甩掉多余的液体并用滤纸擦干（不需要洗涤）5、一抗孵育1）、用抗体稀释液稀释一抗，实现抗体制造商介绍的浓度2）、将稀释的抗体（介绍浓度：0.4μg至2μg）加到爬片上，4°C孵育过夜3）、用PBS洗涤3次，每次15分钟6、二抗孵育1）、用抗体稀释液稀释生物素化的二抗2）、将稀释的抗体加到爬片上，37°C孵育30分钟3）、用PBS洗涤3次，每次8分钟7、染色1）、爬片上滴加稀释好的SABC—FITC或SABC—Cy3试剂2）、37°C孵育30分钟（避光）3）、用PBS洗涤2次4）、滴加DAPI染液，避光孵育10min5）、用PBS洗涤3次6）、用抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜下察看结果。

细胞爬片

一，盖玻片需要过酸，并且自来水、蒸馏水冲洗干净。

两张或者以上的玻片很容易因为虹吸作用粘到一起，很容易冲不干净，很容易把两张完全重叠在一起的玻片当成一张，一定要看清楚，晾干片子最好是在消毒饭盒中进行，饭盒底面放上纱布，将玻片斜靠在饭盒侧壁，玻片正面不要接触纱布，否则会粘上毛毛的。

然后高压蒸汽灭菌，烤箱中烤干。

第二，爬片前最好用多聚赖氨酸或者层粘蛋白或者胶原溶液处理玻片，未处理过的细胞不容易贴壁，细胞系还好，原代细胞很少能贴得牢。

这一步至关重要，否则在后面用PBS洗片时很容易将细胞洗掉。

用这些促进细胞贴壁的溶液处理玻片后，放到培养皿之前需要用培养基冲洗一到三遍！层粘蛋白和胶原还好，多聚赖氨酸有几次我没冲结果细胞全部不贴壁。

第三，传代消化下来的细胞一定不要过多稀释，将浓一点的细胞悬液吹打混匀后滴在玻片上，几个小时后再追加培养基。

第四，玻片在培养皿中容易漂起，如果事先在皿中铺上液体很可能会不容易揭下来，或者揭下来时出印子在镜下很难看。

漂起的玻片很容易两面都培养出细胞的，这时背面的细胞必须去除，挺难操作的，用PBS冲洗可能会伤到正面的细胞，用小镊子夹玻片很容易夹碎，也很容易脱落，小心点好。

第五，将玻片拿出后一定要记好哪边是正面，最好做玻片时将玻片切成长方形的。

目前市场售的多为18mm x 18mm的盖玻片，或者24mmx24mm的盖玻片，正方形，很难分辨反正面，在某个角上打个缺口，对正方形是不中用的。

可以用小砂轮切一下改成长方形，至于在某个角上用砂轮做个标记，理论上很简单，实际操作有难度。

第六，上面步骤都没问题后，玻片就需要进一步处理了，这里有几个细节，分述如下：1.PBS对玻片是冲洗还是浸泡，我个人认为浸泡好，我吃过冲洗的亏，每一步后都要冲洗2-3次，有时还没等试验做完，大部分细胞已经被冲掉了，呵呵！我当时欲哭无泪啊！2.4%的多聚甲醛或者别的固定液的温度是多少，有人认为4°C的好，有人认为37°C的好，我个人感觉，娇贵的原代细胞先在常温下固定较好，然后放到4°C冰箱中。

细胞爬片制备详细过程

【爬片的准备】1.爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2.应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。

如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。

3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。

4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。

烤干后可放入超净台中。

5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。

但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。

【细胞爬片】1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。

整个过程注意无菌操作。

3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。

5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。

取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。

如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。

末取出的可接着继续培养。

【细胞爬片的固定】细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。

当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。

爬片和组化的实验步骤

爬片和组化的实验步骤实验九组织切片与细胞爬片/涂片的HE染色【实验目的】1．掌握细胞涂片的HE染色方法2．熟悉细胞涂片及爬片的制备方法【实验原理】苏木素-伊红染色又称HE染色，是目前应用最广泛的染色方法。

苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。

HE染色主要用于显示各种组织的正常成分和病变组织的一般形态结构，各种组织或细胞的一般形态、结构特点和病变的发生、发展及修复的全过程，在质量较佳的HE染色切片上，基本上都可以观察到，从而进行判定或研究。

HE 染色适用于各种固定、包埋方法制作的石蜡切片、冰冻切片和细胞涂片，且切片不易褪色，可以长期保存。

HE染色在病理诊断、教学和科研中具有重要的价值。

【实验方法】1．细胞爬片的制备（1）将灭菌的载玻片放入培养板内。

（2）将培养好的贴壁细胞消化后离心，计数，按照一定的细胞密度加入孔板中，根据实验目的选择培养基或加入药物。

（3）将孔板放入37℃二氧化碳孵箱中孵育数小时或过夜，待细胞的贴壁密度符合实验要求时，吸去孔板内的培养基或药物，用37℃预温的0.1mol/LPBS漂洗一次。

（4）吸去孔板内的PBS液，加入4%多聚甲醛室温固定15～30min。

（5）吸去4%多聚甲醛，用PBS漂洗3次，每次间隔3min。

（6）取出细胞爬片，晾干后存放于-20℃或直接进行染色。

2．细胞爬片的制备备选方法将培养好的贴壁细胞消化后离心，计数，按照一定的细胞密度加入孔板中（24孔），根据实验目的选择培养基或加入药物，培养到预定时间点。

取出培养板，1000rpm离心5min后，弃上清。

每孔加入PBS2ml,1000rpm离心5min，弃上清；重复1次，共进行2次洗涤。

3．细胞涂片的制备收集处理的细胞，PBS洗2次后，调细胞密度为0.3～0.5某106/ml,按照每片0.1ml，用涂片离心机制备涂片；或者调细胞密度为0.3～0.5某107/ml,取0.005ml涂于载玻片上。

细胞爬片免疫组化步骤

1.转染48小时后，弃去旧液，1ml PBS洗两遍用BD公司的固定透膜液400ul （Fixation and Permeabilization Solution）于4度冰箱内固定透膜20分钟后，PBS洗两遍
2.用弯曲的针头挑起爬片，镊子夹出置于载玻片上，内源性过氧化物酶阻断剂室温（无色液体）孵育10分钟
3.吸水纸吸去阻断剂后将玻片在摇床上PBS中洗3次，每次5分钟。

（若洗的次数多则细胞脱片程度也有可能加大，摇洗的力度也不宜过高）
4.滴加试剂A（蓝色液体）室温孵育10分钟，用吸水纸从一侧吸去，勿洗。

5滴加20倍稀释的单抗，800倍稀释的感染血清，于湿盒内37度孵育2小时。

6.吸水纸吸去稀释后的一抗，在摇床上PBS洗3次，每次5分钟。

7.滴加试剂B（黄色液体）室温孵育10分钟。

8.吸水纸吸去试剂B后，于摇床上PBS洗3次，每次5分钟。

9.滴加试剂C（橙色液体）室温孵育10分钟。

10.吸水纸吸去试剂C后，于摇床上PBS洗3次，每次5分钟。

11.显色剂DAB显色。

细胞爬片制备详细过程

【爬片的准备】1.爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2.应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。

如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。

3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。

4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。

烤干后可放入超净台中。

5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。

但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。

【细胞爬片】1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。

整个过程注意无菌操作。

3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。

5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。

取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。

如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。

末取出的可接着继续培养。

【细胞爬片的固定】细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。

当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。

4%多聚甲醛固定细胞爬片流程

4%多聚甲醛固定细胞爬片流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!4%多聚甲醛固定细胞爬片是一种常用的细胞固定和爬片制作方法，以下是详细的操作流程：1. 细胞培养：首先需要培养好所需的细胞，细胞生长至适合的密度后，可以进行后续操作。

细胞生物学实验细胞爬片ppt课件

9. 整理实验用品。
下次课内容：细胞骨架及细胞核染色 11月2日：期中考试（已学操作，无菌规范）
四、实验步骤：
1. 将超净台内物品，按照无菌操作要求摆放。
2. 用灭菌小镊子将处理好盖玻片轻轻放入35mm培养皿中。
3. 打开细胞瓶盖并在酒精灯上轻轻烧口消毒，倒掉或吸出培养基。
4. 加一滴管胰酶轻轻漂洗一下细胞，使其湿润整个细胞层，弃胰酶，再加入一滴管胰酶，盖好瓶盖。
5. 显微镜下观察细胞的消化状态，待细胞大部分收缩、突起、变圆，细胞边界清晰时，即可竖立或翻转培养瓶停止消化，在超净台内靠近火焰处弃胰酶。
一、实验原理
1.细胞爬片
细胞爬片就是让玻片浸在细胞培养基内，细胞在玻片上生长，主要用于组织学，免疫组织化学，切片，细胞涂片，原位杂交等。
细胞爬片采用的玻片可以是普通的盖玻片也可以用细胞爬片专用玻片。使用普通盖玻片时，要按照玻璃器皿的清洗方法进行清洗，并进行高压灭菌。专用玻片通常已经过处理可直接使用。
6. 加两滴管含10%FCS的DMEM培养基反复冲瓶壁上的细胞层，至全部冲下，滴管轻轻吹打，混匀，成 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胞悬液，细胞计数，将细胞稀释成1105/mL）
7. 在35mm培养皿中加入1 mL细胞悬液+1 ml完全培养基，镜下观察细胞密度和状态，标记细胞名称及操作者。
8. 将细胞放入5%CO2、37℃培养箱培养，至下次课期间换液即可。
二、实验目的
1．巩固细胞传代技术。 2．掌握细胞爬片的方法。 3. 为细胞骨架的观察提供实验材料
三、实验材料及设备
1.细胞 CHO细胞、鸡胚成纤维细胞、HeLa
2.试剂 DMEM培养基、血清、抗生素、胰酶
3.仪器

免疫细胞化学步骤及说明

1. 细胞爬片制备盖玻片在75%酒精浸泡24h以上，超净台内酒精灯上烤干。

六孔板内分别滴入一滴培养液，盖上盖玻片。

分别加入等量细胞，常规培养至细胞70%左右融合。

关于盖玻片的准备，有很多种说法，但我的做法比较简单，这样做不会脱片，也不影响观察。

2. 细胞固定6孔板置冰上冷却，吸尽培养液。

4℃PBS，洗5min×3次。

吸去残留PBS，空气干燥，细胞面微潮湿时，加入预冷95%酒精固定液，浸没细胞面，更换预冷95%酒精2次，第三次在-20℃静置20min。

这一步用4%多聚甲醛可能更省时省事。

3. SP法免疫组化染色步骤(1)细胞爬片蒸馏水洗5min×1次，PBS浸泡5min。

固定之后的细胞一般不会脱落，可以放在摇床上洗。

(2)滴加3%H2O2去离子水，室温孵育30min。

PBS洗5min×3次。

(3)滴加0.3%Triton X-100（全液用蒸馏水稀释）通透30min。

PBS洗5min×3次。

细胞通透很重要，因为蛋白在胞内，我第一次做时没有通透，结果什么都没有。

(4)BSA封闭，室温10min。

倾去，勿洗。

(5)滴加一抗(a-actin l:300)，4℃过夜。

PBS洗5min×3次。

抗体的浓度是自己摸索出来的，还有听说4℃过夜是比较合适的做法。

(6)滴加二抗(聚合HRP标记抗小鼠IgG)，室温30min。

PBS洗5min×3次。

(7)按1mL蒸馏水+A、B、C（DAB试剂盒，要按顺序滴加）各一滴，混匀，镜下显色观察，注意避光。

蒸馏水充分冲洗。

(8)苏木素染2min。

自来水充分冲洗。

(9)依次在75%→85%→95%→100%浓度酒精中浸泡2min脱水。

封片之前常规有二甲苯透明的，但我滴加了二甲苯之后，片子变得很脏，不知什么原因。

后来就不加了，直接脱水后封片，现在看来片子还不错啊。

而且二甲苯太呛人了。

(10)中性树胶封片。

细胞爬片制备详细过程.doc

【爬片的准备】1.爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2.应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。

如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。

3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。

4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。

烤干后可放入超净台中。

5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。

但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。

【细胞爬片】1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。

整个过程注意无菌操作。

3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。

5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。

取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。

如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。

末取出的可接着继续培养。

【细胞爬片的固定】细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。

当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。

细胞爬片制备

细胞爬片制备细胞爬片制备是一种常用的实验技术，用于研究细胞的形态、结构和功能。

本文将介绍细胞爬片制备的原理、步骤和注意事项。

一、原理细胞爬片制备是通过将细胞附着在载玻片上，使其保持形态并能够观察和分析。

一般来说，细胞爬片制备包括以下几个步骤：细胞培养、处理、固定和染色。

二、步骤1. 细胞培养：将需要研究的细胞株培养在含有合适培养基的培养皿中，确保细胞的健康生长。

2. 处理：根据实验需要，给予细胞相应的处理，例如添加药物、激素或基因转染等。

3. 固定：用适当的固定剂处理细胞，使其保持在原位，不发生移动或变形。

4. 染色：使用合适的染料对细胞进行染色，以便观察细胞的形态和结构。

三、注意事项1. 细胞培养要注意无菌操作，避免细胞受到污染。

2. 处理细胞时要根据实验设计进行，注意处理时间和浓度的控制。

3. 固定细胞时要选择合适的固定剂和浓度，避免对细胞造成损伤。

4. 染色时要选择适当的染料，并按照染色剂的使用方法进行操作，避免染色不均匀或过度染色。

四、实验结果的分析与展示细胞爬片制备完成后，可以使用显微镜观察细胞的形态和结构，并进行图像的采集和分析。

可以根据实验的需要，选择合适的显微镜镜头和放大倍数，获得清晰的细胞图像。

通过图像分析软件可以对细胞的形态、大小、数量等进行定量化分析，进一步研究细胞的功能和特性。

细胞爬片制备是细胞生物学研究中常用的技术方法之一，可以帮助科研人员观察和分析细胞的形态和结构。

通过细胞爬片制备，可以了解细胞的生理状态和功能，对细胞的研究提供重要的实验依据。

在进行细胞爬片制备时，需要注意细胞的培养、处理、固定和染色等步骤，以及实验结果的分析和展示。

只有掌握了细胞爬片制备的技术原理和操作要点，才能获得准确、可靠的实验结果，推动细胞生物学的发展。

细胞爬片实验操作步骤

细胞爬片实验操作步骤嘿，咱今儿就来唠唠细胞爬片实验操作步骤这档子事儿！细胞爬片实验啊，就像是一场精心编排的舞蹈，每一步都得踩在点儿上。

先得准备好那些个“舞台道具”，什么培养皿啦、细胞啦、盖玻片啦，一个都不能少。

把盖玻片小心翼翼地放进培养皿里，这就好比给舞台搭好了架子。

然后呢，就是把细胞这个主角请出来啦！把细胞混悬液均匀地滴在盖玻片上，可别滴多了也别滴少了，这就跟做饭放盐似的，得恰到好处。

滴完后，轻轻地把培养皿放进培养箱里，让细胞在里面舒舒服服地生长。

过了一段时间，等细胞长到差不多了，就得给它们来点特别照顾啦。

这时候要给细胞进行固定，就像是给它们拍张定妆照，让它们乖乖地待在那儿。

固定好了，接下来就是染色啦！这可真是个神奇的过程，就像给细胞穿上了漂亮的彩衣。

不同的染色剂能让细胞呈现出不同的模样，有的红啦，有的蓝啦，可有意思了。

染完色，还得把多余的染色剂洗掉，可不能让细胞花里胡哨的。

然后呢，把爬片取出来，放在显微镜下观察。

哇塞，你就能看到细胞们在那小小的世界里活动啦，就像在看一场微观世界的大戏！你说这细胞爬片实验有趣不有趣？就好像我们在操控着一个小小的细胞世界，看着它们成长、变化。

这过程中可不能马虎，一个不小心可能就前功尽弃啦。

所以得打起十二分精神来，每一步都要仔仔细细的。

做细胞爬片实验，不就跟我们过日子一样嘛，得用心经营，每一个环节都不能马虎。

你想想，要是做饭的时候盐放多了或者火候没掌握好，那做出来的菜能好吃吗？同理，细胞爬片实验要是哪个步骤没做好，那得出的结果能可靠吗？所以啊，咱做这个实验的时候，就得像个细心的大厨，精心烹制每一道“细胞大餐”。

只有这样，才能让我们看到细胞最真实、最美丽的一面呀！你说是不是这个理儿？总之呢，细胞爬片实验操作步骤可不能小瞧，得认真对待。

这可不仅仅是个实验，更是我们探索微观世界的奇妙之旅啊！让我们一起在这个小小的细胞世界里遨游吧！。

细胞爬片

第一，盖玻片需要过酸，并且自来水、蒸馏水冲洗干净。

两张或者以上的玻片很容易因为虹吸作用粘到一起，很容易冲不干净，很容易把两张完全重叠在一起的玻片当成一张，一定要看清楚，晾干片子最好是在消毒饭盒中进行，饭盒底面放上纱布，将玻片斜靠在饭盒侧壁，玻片正面不要接触纱布，否则会粘上毛毛的。

然后高压蒸汽灭菌，烤箱中烤干。

第二，爬片前最好用多聚赖氨酸或者层粘蛋白或者胶原溶液处理玻片，未处理过的细胞不容易贴壁，细胞系还好，原代细胞很少能贴得牢。

这一步至关重要，否则在后面用PBS洗片时很容易将细胞洗掉。

用这些促进细胞贴壁的溶液处理玻片后，放到培养皿之前需要用培养基冲洗一到三遍！层粘蛋白和胶原还好，多聚赖氨酸有几次我没冲结果细胞全部不贴壁。

第三，传代消化下来的细胞一定不要过多稀释，将浓一点的细胞悬液吹打混匀后滴在玻片上，几个小时后再追加培养基。

第四，玻片在培养皿中容易漂起，如果事先在皿中铺上液体很可能会不容易揭下来，或者揭下来时出印子在镜下很难看。

漂起的玻片很容易两面都培养出细胞的，这时背面的细胞必须去除，挺难操作的，用PBS冲洗可能会伤到正面的细胞，用小镊子夹玻片很容易夹碎，也很容易脱落，小心点好。

第五，将玻片拿出后一定要记好哪边是正面，最好做玻片时将玻片切成长方形的。

目前市场售的多为18mm x 18mm的盖玻片，或者24mmx24mm的盖玻片，正方形，很难分辨反正面，在某个角上打个缺口，对正方形是不中用的。

可以用小砂轮切一下改成长方形，至于在某个角上用砂轮做个标记，理论上很简单，实际操作有难度。

第六，上面步骤都没问题后，玻片就需要进一步处理了，这里有几个细节，分述如下：1.PBS对玻片是冲洗还是浸泡，我个人认为浸泡好，我吃过冲洗的亏，每一步后都要冲洗2-3次，有时还没等试验做完，大部分细胞已经被冲掉了，呵呵！我当时欲哭无泪啊！2.4%的多聚甲醛或者别的固定液的温度是多少，有人认为4°C的好，有人认为37°C的好，我个人感觉，娇贵的原代细胞先在常温下固定较好，然后放到4°C冰箱中。

制作细胞爬片的方法

制作细胞爬片的方法细胞爬片是一种常用的实验技术，用于研究细胞的结构与功能。

通过制作细胞爬片，可以观察细胞的形态、活动和相互作用，从而揭示细胞的生理和病理过程。

本文将介绍几种常用的制作细胞爬片的方法。

一、细胞培养制作细胞爬片首先需要进行细胞培养。

细胞培养可分为原代细胞培养和细胞系培养两种方式。

1. 原代细胞培养原代细胞是从组织或动物体内获得的初代细胞，其细胞增殖能力有限。

原代细胞培养需要先将组织切碎，并经过消化和传代培养扩增细胞数量。

培养基的选择应根据细胞类型的不同，可使用DMEM、RPMI-1640等培养基，并添加适当的血清、生长因子等。

2. 细胞系培养细胞系是指从组织中分离出来的，具有细胞无限增殖能力的细胞。

细胞系培养相对简单，常用的细胞系包括HeLa、293T等。

培养细胞系需要使用与细胞类型相匹配的培养基，并注意保存细胞的纯度和稳定性。

二、细胞准备在制作细胞爬片之前，需要将细胞转移到玻璃基质上以形成单层细胞。

以下是几种常见的细胞准备方法。

1. 机械刮取法机械刮取法是一种简单有效的细胞准备方法。

将培养皿中的细胞用细胞刮刀轻轻刮去，使细胞均匀地分布在玻璃基质上。

2. 酶消化法酶消化法适用于粘附性较强的细胞。

将培养皿中的细胞用适量的胰蛋白酶等酶溶液消化，使细胞悬浮于培养基中。

然后将细胞悬浮液加入预先涂覆在玻璃基质上的培养皿中，适当晃动培养皿以均匀分布细胞。

3. 离心沉积法离心沉积法适用于较大颗粒的细胞，如神经元等。

将细胞悬液离心，去除上清液后，用滴管吸去细胞上清液，仅保留底部的细胞沉淀。

然后将培养基加入沉淀中，并用移液管轻轻混合，将细胞均匀分布到玻璃基质上。

三、固定和染色为了使细胞保持在制作的细胞爬片上并保持形态完整，需要对细胞进行固定处理。

固定可选择用甲醛或乙醇等化学物质固定。

1. 甲醛固定法将4%甲醛溶液加入适量的PBS缓冲液中，将制备好的细胞爬片浸泡于甲醛溶液中，固定15-30分钟后，用PBS洗涤细胞片数次，使甲醛完全去除。

免疫细胞化学

一．细胞爬片制作：消化脱壁，稀释后每孔中加2ml细胞悬液，37。

C培养2天（勿让细胞密度过大）。

二．吸去培养基，【每孔加2ml PBS，浸泡（勿冲刷、触及爬片）2min，吸去】*3。

此过程中一根吸管专门用于吸来PBS，一根用于吸去。

三．4%多聚甲醛固定10min（加量以覆盖爬片为准），PBS*3。

四．过氧化氢1~2滴，室温6min，PBS*3。

封闭血清1~2滴，室温10min，予纸巾吸干。

五．于1.5ml EP管中混合（0.5ml PBS、1ul一抗、1.5ul Triton、封闭血清1滴）。

每孔加适量上述混合物，4。

C过夜。

六．PBS*3，纸巾吸干。

每爬片加二抗1滴，37 。

C，30min。

七．PBS*3，加DAB（预先避光配制，1滴浓缩液+1ml缓冲液），室温暗处放置1~2min后即镜下观察。

阳性反应最强而背景开始着色，即以水冲洗5min停止反应（勿直接冲刷爬片表面）。

八．苏木素细胞核染色1min，自来水洗去。

九．逐级脱水（3个50ml离心管中分别配制70%、95%、无水乙醇），二甲苯透明，树脂封片。

细胞爬片步骤

细胞爬片步骤PLL配制和处理（Sigma产品，武汉博士德分装，10ml/瓶。

4℃存放，有效期1年）(1) 储存液：1:10稀释液可以保存在4℃里，三个月内仍然可以使用。

稀释、储存和吸取多聚赖氨酸要使用塑料制品。

工作液：0.1%( w/v)PLL，用移液枪吸取0.3ml PLL＋3ml无菌去离子水，混匀放于10ml 无菌塑料离心管中。

封口模密封后4℃存放。

(2) 无菌处理：PLL不可以高温消毒，故应过滤除菌分装于无菌处理的细胞冻存管内，1ml/管，封口模密封，4℃保存。

另外，准备无菌去离子水50ml。

多聚赖氨酸PLL包被（1）灭菌的去离子水(三蒸水)1:10稀释多聚赖氨酸溶液。

（2）用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度维持在18-26℃。

（3）将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5分钟。

（注意增加时间不会提高包被效果）。

（4）将过滤除菌的多聚赖氨酸加入一个消毒好的培养皿(超净台内操作)，然后将高压灭菌的小玻片放到多聚赖氨酸内浸泡5min，无菌晾干即可。

（底面贴紧培养皿，存在包被PLL 不好的可能，放入培养板孔内注意正反面！！）或者：铺片于培养皿中，移液枪将PLL工作液滴加于玻片上，室温10分钟后，用消毒好的纱布条吸取玻片上的PLL液。

在超静台内风干后使用，或者超静台内过夜晾干，次日使用。

或者：在60℃烘箱1小时干燥，或室温18-26℃过夜干燥待用。

步骤：（1）准备24孔细胞培养板（消毒好的培养皿）（2）多聚赖氨酸PLL包被（3）培养板每孔中滴1滴培养基，然后将玻片置于液滴上，压紧（通过表面张力的作用将玻片吸附于培养板上）（4）常规细胞消化，离心，重悬，将吹打的细胞悬液分别加到每个孔盖玻片上，让其贴壁生长，可以用移液枪加样30μl于盖玻片上（5）24孔板做完细胞爬片后，再小心用镊子将爬片取出，细胞面朝向载玻片，用中性树胶封片，照相。

（主张用20%-50%甘油封片，中性树胶封的不好容易“花片”）（6）PBS洗涤，以去除血清等物质。

细胞爬片实验方案

准备：盖玻片、4%多聚甲醇、50%的甘油PBS4%多聚甲醛溶液:多聚甲酵40g O.lmol/L磷酸缓冲液至1000 mL方法:称収40g多聚甲醛,置于三角烧瓶中,加入500-800 mL 0.1 mol/L 磷酸缓冲液,加热持续搜拌(或磁力搅拌)使粉末完令溶解,通常需滴加少许NaOH才能使溶液清亮,最后补足0.1 mol/L的PBS至1000 mL,充分混匀。

0.1 M (pH 7.4) PBS1 mol/L Na2HP0477.4ml1 mol/L NaH2P0422.6ml蒸馏水加至10001爬片的准备爬片可用一般的盖玻片也可用专用爬片,根据自己的需要剪裁成合适的大小,以备置于6孔板、12孔板或24孔板;将剪裁好的爬片,泡酸过夜,捞出后流水洗净,烤干浸泡于75%酒精中备用2细胞爬片用胰酶消化好细胞,充分吹打,使之成细胞悬液,计数,根据需要调整细胞到适当密度。

取无菌的细胞培养板,先加少量培养基(以使玻片与培养板紧密接触)。

将玻片小心从洒精中取出,在酒精灯火焰外焰轻轻划过,使玻片表面酒精燃烧从而起到灭菌的效果。

待冷却后,将玻片轻轻放入培养板中,然后将单细胞悬液一逐滴的滴到上而。

然后置于37°C5%C02的细胞培养箱屮培养。

培养一定时间后培养液换为含材料的培养液继续共培养（2ml, 100µg ml-1 in DMEM）6h后，用PBS冲洗两遍去除未被吞噬的纳米颗粒，然后取出爬片。

对于贴壁能力较弱的细胞,爬片前应将玻片置于细胞培养板中,用PLL包被至少Ih。

3细胞固定爬片置于37°CPBS中洗三次,每次10到20秒钟,然后在4%多聚甲醛中室温固定15分钟,然后再用37°CPBS将多聚甲醛冲干净,清洗过程要注意手法轻柔,否则细胞会从玻片上脱落。

固定后的细胞爬片置于滤纸上晾干,然后用50%的甘油PBS溶液封片,备用。

4共聚焦显微镜激发690nm, 荧光在400nm左右。

细胞爬片制作（Hela细胞为例）

细胞爬片制作（Hela细胞为例）
细胞爬片SOP（以Hela为例）
1、在六孔板中加入细胞爬片，然后铺上5X105个细胞培养24h.
2、待细胞贴壁后，配制转染混合液，将2ugDNA加至250ul无血清DMEM中混匀，室温静置5min；加5ul soinfection 转染试剂加至250ul 无血清DMEM中混匀，室温静置5min；然后将两者混匀室温孵育30min.
3、将转染混合液缓慢而分滴加至6孔板中培养48-72h
4去细胞上清，用PBS清洗2次，新配80%冷丙酮固定液加入细胞中，室温作用10min，
5、PBS洗2遍，每次洗5min。

加入2%BSA（每孔500ul）封闭30min，再次PBS清洗两次
6、加入0.1% Triton-X100（每孔500ul）孵育10min,PBS清洗两次
7、加入稀释好的一抗（每孔50ul）至孔板中间部位，室温孵育1h。

8、PBS清洗3次，加入稀释好的二抗（每孔50ul）至孔板中间部位，室温孵育1h。

9、用PBS清洗三次后进行细胞核染色。

加1:200稀释好DAPI染色，室温作用30min。

10、用PBS清洗2次后，将爬片取出，用吸水纸吸干表面水并去除周边细胞，用记号笔圈出孵育抗体的细胞。

11、滴一滴封片剂在载玻片上，然后将细胞爬片倒放在载玻片上，用白色指甲油封片。