杂交瘤细胞
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PEG法诱导原生质体的机制尚不十分清楚，初步分 析可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体 表面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电键，促使 异源的原生质体间的黏着而结合。用高钙离子和pH 溶液将与质膜结合的PEG分子进行洗脱，导致电荷平 衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连 接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。
A 平行多电极融 合装置示意图
在交流电场中原 生质体排列成念 珠状、发生融合 B 电融合微室示意图 上：俯视图 :下侧面图
电融合设备及原理图
6.2.3 物理法——电融合诱导法
电融合诱导法：
1. 亲本原生质体均匀混合放入融合小室，微电极只有一个小
室，平行电极型有4个小室，两电极间隔3㎜，整个装置放在 一个培养皿中。 2. 微电极型的两个电极的端部同时与两个靠近的原生质体膜 表面接触，5~12mA脉冲电流刺激1~5mS,原生质体在累计几秒 到几十秒时间内暂时收缩，两膜间形成小孔，连接成桥，经 点到面完成连接，最后形成融合体。 3. 经平行电极的1兆赫交流双向脉冲，原生质体极化产生偶极
细胞发生融合（HVJ与细胞膜的受体结合）：
1.两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近
2.通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞
膜间相互渗透，胞质互相渗透。 3.两个原生质体的细胞核相互融合，融为一体。 4.进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色 体的杂种子细胞。
6.2.2 化学法—PEG结合高Ga2+、pH诱导
6.1.3 原生质体的制备与培养
6.1.3.1 原生质体的制备 1.原生质体来源：植物的叶片、根尖、花粉等。
2. 制备原生质体：机械法；酶解法
酶解法：（1） 取材消毒 （2） 酶解制备
（3） 原生质体收集
3. 原生质体的纯化方法 过滤-离心法； 漂浮法； 沉降法和漂浮法结合
6.1.3 原生质体的制备与培养
pH、高钙离子液,15分钟后冲洗液冲洗，离心收集原生质
体。 4.计算融合率 融合率=（融合细胞的细胞核总数/视野内全部细胞的 细胞核总数）×100%
6.2.3 物理法——电融合诱导法
是20世纪80年代出现的细胞融合技术。在直流电脉
冲的诱导下，原生质体膜表面的电荷和氧化还原电位
发生改变，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破 裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融 合体。 优点：融合率高、重复性好、对原生质体伤害 小、装置精巧、方法简便、可在显微镜下观察或录象 融Fra Baidu bibliotek过程、诱导过程可控性强等。
第六章
细胞融合
(Cell fusion)
6.1 概述
细胞融合(cell fusion)又称体细胞杂交（somatic
hybrydization）或细胞杂交（cell hybrydization ）：
在离体条件下用人工方法将不同种或同种不同类型 的单细胞通过无形方式融合成一个杂合细胞,生产 特殊生物制品、分化再生新物种或新品种的技术。 细胞融合技术的出现标志着细胞工程的诞生。 目前被广泛地应用于单克隆抗体、生物的远缘杂 交、新品种的培育和人类基因图工作（小鼠和人类
6.1.3.2 原生质体培养方法： （1）液体培养法：将纯化后的原生质体悬浮于 液体培养基中培养。 （2） 固体平板法：固体培养基上培养。类似植 物单细胞培养法 （3）双层培养法：在琼脂培养基上部加入一薄 层液体原生质体培养液培养原生质体
6.1.4 动物单个细胞的获得
动物单细胞的获得：
1、组织的获得：处死动物取出组织块，放入小烧杯
细胞融合）。
6.1 概述
受精：雌雄生殖细胞间的自然融合。
体细胞间的融合现象：Muller（1838）发现脊椎 动物肿瘤细胞的多核现象。其后发现骨髓、肺组织 和各种正常组织及炎症和坏死部位的多核现象。 实验体细胞融合：在细胞培养技术之后。首先
（Lambert）发现体外培养的肿瘤细胞自发融合。
后（Okata,1962）发现仙台病毒可诱发艾氏腹水瘤 细胞融合，开创了动物细胞融合的崭新领域。其后 不同动物细胞、植物和微生物原生质体融合技术也 相继发展起来。
移，创造出自然界中所没有的新物种或杂合细胞。还 可创造细胞质杂种。
6.1.2 细胞融合的原理和融合材料
1、 细胞融合的基本原理：不同的原生质体或细胞→融合细 胞→新生物（或杂合细胞）。 两种不同植物的体细胞经纤维素酶、果胶酶消化，除去细胞 壁，得到原生质体（或动物细胞），通过化学或物理方法诱导 其细胞融合形成杂种细胞；以适当的技术进行杂种细胞的分拣 和培养，促使杂种细胞分裂形成细胞团、愈伤组织、直到分化 发育成杂种植株，实现基因在远缘物种间的转移。 2、融合材料 （1） 植物或微生物原生质体的制备 （2） 动物单个细胞的获得 获得步骤： （1） 组织的获得、（2） 组织的消化、（3）原生质体或动 物单细胞的分离。
6.2.2 化学法—PEG结合高Ga2+、pH诱导
1. 做好两种原生质体的识别标记，如色素、缺陷型抗
性等。 2. 两种原生质体（密度105个∕ml）按1:1等量混合。 3.PEG的分子量为4000~6000，加热融化与Eagle溶液配 成50%。加入PEG后，24℃培育10~20min，缓缓加入高
6.1.1 细胞融合的意义
细胞融合(cell fusion)：将不同来源的原生质体（动 物细胞）相融合，使之分化再生、形成杂合细胞、新 物种或新品种的技术。 意义：可应用于优先选择改良、克服远缘杂交中的
不亲和障碍、更加广泛地组合起各种植物的优良遗传
性状，从而培养出理想的品种。可以避开生殖细胞的
受精过程，从而在亲缘关系更远的物种间实现基因转
细胞融合技术主要有：
生物法——仙台病毒法
化学法——PEG结合高Ga2+、pH诱导法 物理法——电融合诱导法 融合细胞的选择： 融合细胞的类型：同核体；异核体；多核体。
常用的选择方法：遗传互补筛选法；抗性互补筛选
法；生长特性筛选法；物理特性筛选法；其他方法
6.2.1 生物法——仙台病毒法
灭活的仙台病毒（HVJ）可促使细胞凝结、使
中，组织块剪碎1mm3大小加入Hanks溶液，低速离 心，留下组织块。 2、组织的消化：胰蛋白酶消化： ①向组织块中加入30~50倍体积的胰蛋白酶液。 ②37℃水浴内消化，每5~10分钟摇一次。 ③Hanks漂洗两次。
④800r/min离心5min，弃上液，加入营养液。
6.2 细胞融合技术与融合细胞的选择
A 平行多电极融 合装置示意图
在交流电场中原 生质体排列成念 珠状、发生融合 B 电融合微室示意图 上：俯视图 :下侧面图
电融合设备及原理图
6.2.3 物理法——电融合诱导法
电融合诱导法：
1. 亲本原生质体均匀混合放入融合小室，微电极只有一个小
室，平行电极型有4个小室，两电极间隔3㎜，整个装置放在 一个培养皿中。 2. 微电极型的两个电极的端部同时与两个靠近的原生质体膜 表面接触，5~12mA脉冲电流刺激1~5mS,原生质体在累计几秒 到几十秒时间内暂时收缩，两膜间形成小孔，连接成桥，经 点到面完成连接，最后形成融合体。 3. 经平行电极的1兆赫交流双向脉冲，原生质体极化产生偶极
细胞发生融合（HVJ与细胞膜的受体结合）：
1.两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近
2.通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞
膜间相互渗透，胞质互相渗透。 3.两个原生质体的细胞核相互融合，融为一体。 4.进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色 体的杂种子细胞。
6.2.2 化学法—PEG结合高Ga2+、pH诱导
6.1.3 原生质体的制备与培养
6.1.3.1 原生质体的制备 1.原生质体来源：植物的叶片、根尖、花粉等。
2. 制备原生质体：机械法；酶解法
酶解法：（1） 取材消毒 （2） 酶解制备
（3） 原生质体收集
3. 原生质体的纯化方法 过滤-离心法； 漂浮法； 沉降法和漂浮法结合
6.1.3 原生质体的制备与培养
pH、高钙离子液,15分钟后冲洗液冲洗，离心收集原生质
体。 4.计算融合率 融合率=（融合细胞的细胞核总数/视野内全部细胞的 细胞核总数）×100%
6.2.3 物理法——电融合诱导法
是20世纪80年代出现的细胞融合技术。在直流电脉
冲的诱导下，原生质体膜表面的电荷和氧化还原电位
发生改变，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破 裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融 合体。 优点：融合率高、重复性好、对原生质体伤害 小、装置精巧、方法简便、可在显微镜下观察或录象 融Fra Baidu bibliotek过程、诱导过程可控性强等。
第六章
细胞融合
(Cell fusion)
6.1 概述
细胞融合(cell fusion)又称体细胞杂交（somatic
hybrydization）或细胞杂交（cell hybrydization ）：
在离体条件下用人工方法将不同种或同种不同类型 的单细胞通过无形方式融合成一个杂合细胞,生产 特殊生物制品、分化再生新物种或新品种的技术。 细胞融合技术的出现标志着细胞工程的诞生。 目前被广泛地应用于单克隆抗体、生物的远缘杂 交、新品种的培育和人类基因图工作（小鼠和人类
6.1.3.2 原生质体培养方法： （1）液体培养法：将纯化后的原生质体悬浮于 液体培养基中培养。 （2） 固体平板法：固体培养基上培养。类似植 物单细胞培养法 （3）双层培养法：在琼脂培养基上部加入一薄 层液体原生质体培养液培养原生质体
6.1.4 动物单个细胞的获得
动物单细胞的获得：
1、组织的获得：处死动物取出组织块，放入小烧杯
细胞融合）。
6.1 概述
受精：雌雄生殖细胞间的自然融合。
体细胞间的融合现象：Muller（1838）发现脊椎 动物肿瘤细胞的多核现象。其后发现骨髓、肺组织 和各种正常组织及炎症和坏死部位的多核现象。 实验体细胞融合：在细胞培养技术之后。首先
（Lambert）发现体外培养的肿瘤细胞自发融合。
后（Okata,1962）发现仙台病毒可诱发艾氏腹水瘤 细胞融合，开创了动物细胞融合的崭新领域。其后 不同动物细胞、植物和微生物原生质体融合技术也 相继发展起来。
移，创造出自然界中所没有的新物种或杂合细胞。还 可创造细胞质杂种。
6.1.2 细胞融合的原理和融合材料
1、 细胞融合的基本原理：不同的原生质体或细胞→融合细 胞→新生物（或杂合细胞）。 两种不同植物的体细胞经纤维素酶、果胶酶消化，除去细胞 壁，得到原生质体（或动物细胞），通过化学或物理方法诱导 其细胞融合形成杂种细胞；以适当的技术进行杂种细胞的分拣 和培养，促使杂种细胞分裂形成细胞团、愈伤组织、直到分化 发育成杂种植株，实现基因在远缘物种间的转移。 2、融合材料 （1） 植物或微生物原生质体的制备 （2） 动物单个细胞的获得 获得步骤： （1） 组织的获得、（2） 组织的消化、（3）原生质体或动 物单细胞的分离。
6.2.2 化学法—PEG结合高Ga2+、pH诱导
1. 做好两种原生质体的识别标记，如色素、缺陷型抗
性等。 2. 两种原生质体（密度105个∕ml）按1:1等量混合。 3.PEG的分子量为4000~6000，加热融化与Eagle溶液配 成50%。加入PEG后，24℃培育10~20min，缓缓加入高
6.1.1 细胞融合的意义
细胞融合(cell fusion)：将不同来源的原生质体（动 物细胞）相融合，使之分化再生、形成杂合细胞、新 物种或新品种的技术。 意义：可应用于优先选择改良、克服远缘杂交中的
不亲和障碍、更加广泛地组合起各种植物的优良遗传
性状，从而培养出理想的品种。可以避开生殖细胞的
受精过程，从而在亲缘关系更远的物种间实现基因转
细胞融合技术主要有：
生物法——仙台病毒法
化学法——PEG结合高Ga2+、pH诱导法 物理法——电融合诱导法 融合细胞的选择： 融合细胞的类型：同核体；异核体；多核体。
常用的选择方法：遗传互补筛选法；抗性互补筛选
法；生长特性筛选法；物理特性筛选法；其他方法
6.2.1 生物法——仙台病毒法
灭活的仙台病毒（HVJ）可促使细胞凝结、使
中，组织块剪碎1mm3大小加入Hanks溶液，低速离 心，留下组织块。 2、组织的消化：胰蛋白酶消化： ①向组织块中加入30~50倍体积的胰蛋白酶液。 ②37℃水浴内消化，每5~10分钟摇一次。 ③Hanks漂洗两次。
④800r/min离心5min，弃上液，加入营养液。
6.2 细胞融合技术与融合细胞的选择