产甲烷菌菌落特性及分子生物学研究汇总.
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脂蛋白 肽聚糖
Euryarchaeota
†产甲烷菌的分类
METHANOGEN
氢营养型：利用氢气和二氧化碳
根据可利 用底物
乙酸盐营养型：乙酸
甲基营养型：甲醇、三甲基胺、二甲肽硫化合物以及 其他的一些醇如异丙醇、异丁醇、乙醇、环戊醇
嗜冷产甲烷菌：Topt < 25℃了 嗜温产甲烷菌：Topt ≈ 35℃
ΔG′0= -131 kJ ΔG′0= -319 kJ ΔG′0= -31 kJ Euryarchaeota
†产甲烷菌的分类
METHANOGEN 颗粒污泥表面的菌群
颗粒污泥外观特征
马氏甲烷球菌
甲酸甲烷杆菌
巴氏甲烷八叠球菌 Euryarchaeota
†产甲烷菌的分类
METHANOGEN
Euryarchaeota
更先进的技术 更完善的体系 …… Euryarchaeota
†产甲烷菌的生物学特性
METHANOGEN 1
专性厌氧 •-320mV下正常生长 • -160mV 下生长缓慢
• 遇氧停止生长甚至死亡
2
生长繁殖困难 •十几天~几十天才出现菌落 •菌落一般圆形、透明、边缘整齐
可利用的底物很少： CO2、H2、乙酸、甲醇、 甲基胺等
Euryarchaeota
†产甲烷菌富集与纯化方法
METHANOGEN
样品采集
水沉积物、沼泽、苔原、稻田、瘤胃、盲肠、地热温泉等 碳源、氮源、维生素、微量元素、还原剂、指示剂
繁殖培养
培养基配好后先煮沸数分钟 厌氧操作箱中进行接种操作，充入体积比4:1的H2/CO2 培养10天后，重复上述过程四次。 滚管分离 在荧光显微镜下标记产甲烷菌菌落，在厌氧操作箱中挑取菌落。 涂片染色检验 滚管观察
METHANOGEN
产甲烷菌菌落特性及 分子生物学研究
Euryarchaeota
内 容
1 2 3 厌氧发酵微生物概述 产甲烷菌分类及代谢途径 产甲烷菌富集与纯化
METHANOGEN
4
5
微生物群落研究方法
分子多样性研究
Euryarchaeota
†厌氧发酵微生物概述
METHANOGEN
基质分解菌群
不产 甲烷菌
•菌落特别小，很容易遗漏。
Euryarchaeota
†产甲烷菌的生物学特性
3 METHANOGEN
独特的产甲烷菌辅酶 •甲烷吠喃(MFR) •甲烷喋呤 •辅酶M(CoM) •辅酶F430 •辅酶F420 •HS-HTP
孔道蛋白 脂多糖
4
特殊的细胞壁结构 •无肽聚糖骨架 •蛋白质亚基和大量杂多糖组成 •不受青霉素抑制 •细胞内无细胞色素C
纯化分离
纯度检验
在荧光显微镜下观察看其是否有蓝绿色荧光
进行沼气发酵试验看其是否产生沼气
菌种保存
4:1的H2/CO2 ，放置在4℃保存 用悬浮液冷冻保存法保藏产甲烷菌 Euryarchaeota
†微生物群落研究方法进展
METHANOGEN
核酸探针杂交技术
利用能与特定核苷酸序列发生特异性互补的已知核苷酸片段作探针；探针可 以是长探针(100 ~ 1000 bp)，也可以是短的寡核苷酸(10 ~ 50 bp)。根据所用的 探针和靶核酸的不同，杂交可分为DNA-DNA 杂交，DNA-RNA (核糖核酸)杂 交，RNA –RNA杂交3类 •原位杂交
†产甲烷菌显著影响因子
METHANOGEN
微量元素 微量元素缺乏会导致VFA高，气 体产率下降。 对毒性物质具有拮抗作用 使反应器内优势菌种发生变化 使乙酸利用率提高数倍。 最适pH值6.8 ~ 7.4 pH值的变化可引起微生物体表面 的电荷变化，影响培养基中有机 化合物的离子化作用 酶只有在最适宜的pH 值时才能发 挥最大活性。 pH值
为产甲烷菌清除有害物质
产甲 烷菌
Euryarchaeota
†厌氧发酵微生物的发展史
METHANOGEN 1868 Bechamp 甲烷形成是微生物 学过程 1899 俄国 奥姆良 将厌氧分解纤维的 微生物分为两类 1916奥氏甲烷杆菌 1901荷兰 Sohngen氢和二 氧化碳的混合气 能发酵成甲烷
源自文库
苔原湿地、湖底沉积物 厌氧消化器、淡水沉积物
根据生 长温度
嗜热产甲烷菌：Topt ≈ 55℃
极端嗜热产甲烷菌：Topt > 80℃
海底沉积物、热泉等
Euryarchaeota
†产甲烷菌甲烷生产途径
METHANOGEN
H2/CO2途径
甲基途径
乙酸途径
CO2 + H2 → CH4 + 2H2O 4CH3OH → 3CH4 + CO2 + 2H2O CH3COO- + H2O → CH4 + HCO3-
硫酸盐
硫酸盐还原细菌和产甲烷细菌存 在竞争关系，二者都以氢、乙酸、 乳酸等为电子供体。 硫化氢致害浓度为50 mg· L-1，驯 化后的500 mg· L-1。
产甲烷菌最适宜的Eh为-350 mV 或更低，过高则停止生长甚至死 亡。 中温Eh 应低于-300~-380 mV 高温厌氧消化系统-500~-600 mV 氧化还原电位(Eh)
RNA
DNA
•菌落杂交 •Southern 印迹杂交 •斑点印迹杂交 •狭线印迹杂交 •荧光原位杂交
Euryarchaeota
复性
†微生物群落研究方法进展
METHANOGEN
核酸探针杂交技术
能快速，能灵敏地探测出环境微生物中特殊的核酸序列
定性、定量分析微生物的存在、分布、丰度和适应性等
荧光原位杂交((Fluorescence In Situ
挥发酸生成菌群
产琥珀酸丝状菌 纤维素降解细菌 溶纤维丁酸弧菌 半纤维素降解细菌 白色瘤胃球菌 淀粉降解细菌 牛链球菌 脂肪降解细菌 溶脂厌氧弧菌 沃尔夫互营单细胞菌 中温丙酸氧化菌 伍德乙酸杆菌 乙酸梭菌 嗜热自养梭菌 嗜甲基丁酸杆菌
产氢产乙酸菌 同型产乙酸菌
提供生长和产甲烷所需要的基质
创造适宜的氧化还原电位条件
Hybridization，FISH)是目前单个细胞
水平上分析微生物群落结构的常用分 子生态学方法。用荧光标记探针，原 位鉴定单个细胞, 可原位分析它们的
1901-1903年巴斯 德研究所的Maze 马氏甲烷球菌.
1936 H A Barker 发现沼气发酵分为 产酸和分解酸形成 甲烷两个阶段
1950 美国 R. E .Hungate 发明厌氧培养技术
1967 Bryant 采用改进Hungate 技术纯化产甲烷菌 1972 三阶段理论
1974 Bryant首次 提出了产甲烷菌 (Methanogen)一词
Euryarchaeota
†产甲烷菌的分类
METHANOGEN
氢营养型：利用氢气和二氧化碳
根据可利 用底物
乙酸盐营养型：乙酸
甲基营养型：甲醇、三甲基胺、二甲肽硫化合物以及 其他的一些醇如异丙醇、异丁醇、乙醇、环戊醇
嗜冷产甲烷菌：Topt < 25℃了 嗜温产甲烷菌：Topt ≈ 35℃
ΔG′0= -131 kJ ΔG′0= -319 kJ ΔG′0= -31 kJ Euryarchaeota
†产甲烷菌的分类
METHANOGEN 颗粒污泥表面的菌群
颗粒污泥外观特征
马氏甲烷球菌
甲酸甲烷杆菌
巴氏甲烷八叠球菌 Euryarchaeota
†产甲烷菌的分类
METHANOGEN
Euryarchaeota
更先进的技术 更完善的体系 …… Euryarchaeota
†产甲烷菌的生物学特性
METHANOGEN 1
专性厌氧 •-320mV下正常生长 • -160mV 下生长缓慢
• 遇氧停止生长甚至死亡
2
生长繁殖困难 •十几天~几十天才出现菌落 •菌落一般圆形、透明、边缘整齐
可利用的底物很少： CO2、H2、乙酸、甲醇、 甲基胺等
Euryarchaeota
†产甲烷菌富集与纯化方法
METHANOGEN
样品采集
水沉积物、沼泽、苔原、稻田、瘤胃、盲肠、地热温泉等 碳源、氮源、维生素、微量元素、还原剂、指示剂
繁殖培养
培养基配好后先煮沸数分钟 厌氧操作箱中进行接种操作，充入体积比4:1的H2/CO2 培养10天后，重复上述过程四次。 滚管分离 在荧光显微镜下标记产甲烷菌菌落，在厌氧操作箱中挑取菌落。 涂片染色检验 滚管观察
METHANOGEN
产甲烷菌菌落特性及 分子生物学研究
Euryarchaeota
内 容
1 2 3 厌氧发酵微生物概述 产甲烷菌分类及代谢途径 产甲烷菌富集与纯化
METHANOGEN
4
5
微生物群落研究方法
分子多样性研究
Euryarchaeota
†厌氧发酵微生物概述
METHANOGEN
基质分解菌群
不产 甲烷菌
•菌落特别小，很容易遗漏。
Euryarchaeota
†产甲烷菌的生物学特性
3 METHANOGEN
独特的产甲烷菌辅酶 •甲烷吠喃(MFR) •甲烷喋呤 •辅酶M(CoM) •辅酶F430 •辅酶F420 •HS-HTP
孔道蛋白 脂多糖
4
特殊的细胞壁结构 •无肽聚糖骨架 •蛋白质亚基和大量杂多糖组成 •不受青霉素抑制 •细胞内无细胞色素C
纯化分离
纯度检验
在荧光显微镜下观察看其是否有蓝绿色荧光
进行沼气发酵试验看其是否产生沼气
菌种保存
4:1的H2/CO2 ，放置在4℃保存 用悬浮液冷冻保存法保藏产甲烷菌 Euryarchaeota
†微生物群落研究方法进展
METHANOGEN
核酸探针杂交技术
利用能与特定核苷酸序列发生特异性互补的已知核苷酸片段作探针；探针可 以是长探针(100 ~ 1000 bp)，也可以是短的寡核苷酸(10 ~ 50 bp)。根据所用的 探针和靶核酸的不同，杂交可分为DNA-DNA 杂交，DNA-RNA (核糖核酸)杂 交，RNA –RNA杂交3类 •原位杂交
†产甲烷菌显著影响因子
METHANOGEN
微量元素 微量元素缺乏会导致VFA高，气 体产率下降。 对毒性物质具有拮抗作用 使反应器内优势菌种发生变化 使乙酸利用率提高数倍。 最适pH值6.8 ~ 7.4 pH值的变化可引起微生物体表面 的电荷变化，影响培养基中有机 化合物的离子化作用 酶只有在最适宜的pH 值时才能发 挥最大活性。 pH值
为产甲烷菌清除有害物质
产甲 烷菌
Euryarchaeota
†厌氧发酵微生物的发展史
METHANOGEN 1868 Bechamp 甲烷形成是微生物 学过程 1899 俄国 奥姆良 将厌氧分解纤维的 微生物分为两类 1916奥氏甲烷杆菌 1901荷兰 Sohngen氢和二 氧化碳的混合气 能发酵成甲烷
源自文库
苔原湿地、湖底沉积物 厌氧消化器、淡水沉积物
根据生 长温度
嗜热产甲烷菌：Topt ≈ 55℃
极端嗜热产甲烷菌：Topt > 80℃
海底沉积物、热泉等
Euryarchaeota
†产甲烷菌甲烷生产途径
METHANOGEN
H2/CO2途径
甲基途径
乙酸途径
CO2 + H2 → CH4 + 2H2O 4CH3OH → 3CH4 + CO2 + 2H2O CH3COO- + H2O → CH4 + HCO3-
硫酸盐
硫酸盐还原细菌和产甲烷细菌存 在竞争关系，二者都以氢、乙酸、 乳酸等为电子供体。 硫化氢致害浓度为50 mg· L-1，驯 化后的500 mg· L-1。
产甲烷菌最适宜的Eh为-350 mV 或更低，过高则停止生长甚至死 亡。 中温Eh 应低于-300~-380 mV 高温厌氧消化系统-500~-600 mV 氧化还原电位(Eh)
RNA
DNA
•菌落杂交 •Southern 印迹杂交 •斑点印迹杂交 •狭线印迹杂交 •荧光原位杂交
Euryarchaeota
复性
†微生物群落研究方法进展
METHANOGEN
核酸探针杂交技术
能快速，能灵敏地探测出环境微生物中特殊的核酸序列
定性、定量分析微生物的存在、分布、丰度和适应性等
荧光原位杂交((Fluorescence In Situ
挥发酸生成菌群
产琥珀酸丝状菌 纤维素降解细菌 溶纤维丁酸弧菌 半纤维素降解细菌 白色瘤胃球菌 淀粉降解细菌 牛链球菌 脂肪降解细菌 溶脂厌氧弧菌 沃尔夫互营单细胞菌 中温丙酸氧化菌 伍德乙酸杆菌 乙酸梭菌 嗜热自养梭菌 嗜甲基丁酸杆菌
产氢产乙酸菌 同型产乙酸菌
提供生长和产甲烷所需要的基质
创造适宜的氧化还原电位条件
Hybridization，FISH)是目前单个细胞
水平上分析微生物群落结构的常用分 子生态学方法。用荧光标记探针，原 位鉴定单个细胞, 可原位分析它们的
1901-1903年巴斯 德研究所的Maze 马氏甲烷球菌.
1936 H A Barker 发现沼气发酵分为 产酸和分解酸形成 甲烷两个阶段
1950 美国 R. E .Hungate 发明厌氧培养技术
1967 Bryant 采用改进Hungate 技术纯化产甲烷菌 1972 三阶段理论
1974 Bryant首次 提出了产甲烷菌 (Methanogen)一词