人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定
人脐静脉内皮细胞分离、培养及鉴定
人脐静脉内皮细胞分离、培养及鉴定权燕;郑练【期刊名称】《汕头大学医学院学报》【年(卷),期】2009(22)4【摘要】目的:寻求一种简单、实用的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分离及培养方法。
方法:在传统HUVECs分离、培养的基础上,进行实验方法的改进,用Ⅰ型胶原酶分离HUVECs;通过倒置显微镜观察HUVECs生长情况,最后使用Ⅷ因子免疫荧光及摄取Dil-Ac-LDL实验鉴定HUVECs,采用流式细胞术检测HUVECs纯度。
结果:改进实验工序和精化实验操作后,HUVECs分离不受影响,原代HUVECs3～4d后融合,传代后2～3d融合,倒置显微镜下见细胞呈"铺路石"状,有接触性抑制现象,Ⅷ因子及摄取Dil-Ac-LDL实验呈阳性,流式细胞术检查细胞纯度达92.9%。
结论:本培养方法操作简便,培养周期短,获得的HUVECs纯度较高,有助于体外研究血管内皮细胞模型的构建。
【总页数】4页(P209-211)【关键词】人脐静脉;内皮细胞;细胞培养;分离;鉴定【作者】权燕;郑练【作者单位】汕头大学医学院第一附属医院小儿外科【正文语种】中文【中图分类】R329.2【相关文献】1.人脐静脉内皮细胞分离培养及鉴定技术 [J], 吴金义;张蕾;张秀英;曲丽梅2.人脐静脉内皮细胞的分离培养和鉴定及酪氨酸激酶受体-2在其中的表达 [J], 吴世卿;郑俊发;曾曙光;陈少鹏;薛国初;章锦才3.人脐静脉内皮细胞体外分离培养方法改进的探索及鉴定 [J], 林少芬;周焕娇;丁运刚;梁小玲;罗燕;唐仕波4.人脐静脉内皮细胞的分离培养及鉴定 [J], 牛成伟;曹凯5.人脐静脉内皮细胞的体外改良分离、培养及鉴定 [J], 阮溦;李锁北;戴如平;徐军美因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定
本课题为安徽省自然科学基金安科医药专项资助项目(01043708)作者单位:230001 合肥 安徽省立医院普外科安徽医科大学2001级硕士研究生(傅斌生)人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定余继海 许戈良 汪 建 荚卫东 傅斌生[摘 要] 目的 探讨新生儿脐静脉内皮细胞的培养及鉴定方法,建立血管内皮细胞培养模型,为体外研究血管内皮细胞提供实验手段。
方法 采用胶原酶 灌流消化法培养人脐静脉内皮细胞,当原代培养细胞80%以上汇合后,用胰蛋白酶消化传代;根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术(F M 术)免疫荧光检查对细胞进行鉴定。
结果 种植在培养瓶中的内皮细胞12小时贴壁生长,48~72小时生长最快,7~10天汇合。
内皮细胞呈接触抑制生长、呈鹅卵石样外观,FM 术检测CD31和V -R-Ag 均为阳性表达。
结论 消化酶灌注脐静脉消化内皮细胞是获取血管内皮细胞的一种好方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型。
[关键词] 内皮细胞;培养C ulture and identif ication of human endothelial cells derived f rom umbilical veins Y u Jihai ,Xu Geliang,W ang J ian,et al A nhui Prouincial H osp ital,H ef ei 230001[Abstract] Objective T o extablish the methods of culturing human endothelial cells (EC)and identifing the cells ac cording to t he antigens expressed and their morpholog ical aspect.Methods A fter digestion w ith t ype collagenase at 37!for 10minutes,the cells were centrifuged,and the cell pellet was resuspended in DEM E medium containing fetal bovine serum (10%vol/vol),seeded on gelatin(0.1%w t/vol)procoated dishes at aconcentr at ion of 10,000per square centimeter.T he medium was changed 1days later when the cells w er e attached and every 2days,until the cells reached confluence.Phase con trast microscopy and flow cy tometry with specific antisera against von willebrand factor and CD31were used to obser ve and i dentify the culturedcells.Results At confuluence (7~9days),the cultured cells had a cobbestone appear ance wit h a strict monolayer grow th and contact inhibition.T he mean fluorescence intensity of the cells was similar w ith both antibodies for the cultured cells vs controls.C onclusion T he cultured cells are endothelial cells,and the method of identification is practical and convenient.[Key words] Endot helial cells;Culture我们采用胶原酶 灌流消化法成功培养人脐静脉内皮细胞,根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术免疫荧光检查对细胞进行鉴定,从而构建体外研究血管内皮细胞的模型,现报告如下。
一种改进的人脐静脉内皮细胞的培养方法
一种改进的人脐静脉内皮细胞的培养方法作者：李琴山冯赞杰刘洋徐海燕钱民章【关键词】 ,内皮细胞；脐静脉；细胞培养【Abstract】 AIM: To establish a stable method to isolate and culture human umbilical vein endothelial cells (hUVEC) in vitro. METHODS: Endothelial cells of vein from newborn umbilical cord were successfully isolated using a combination of collagenase and trypsin (1∶1). Cells were not digested with trypsin until the cells reached confluence over 80%. The composition of culture medium was simplified by not adding vascular endothelial cell growth factor and heparin. The cultured cells were verified as hUVEC by morphology and immunofluorescence staining. RESULTS: The endothelial cells initially spread on the bottom of the dishes in 4 h, then coalesced and grew to form confluent monolayers of polygonal cells within 7-10 d. The cultured cells had a cobblestone appearance with a strict monolayer growth and contact inhibition. The purity of endothelial cells was more than 95% identified by immunocytochemistry staining for Ⅷ:Ag and KDR. CONCLUSION: Method of injection with mixed Enzyme solution is an optimized protocol which is reliable and of high achievement ratio. Cellsharvested with this protocol can be used as models on research of vascular endothelial cells in vitro.【Keywords】 endothelial cell; umbilical vein; cell culture【摘要】目的：建立稳定的人脐静脉内皮细胞分离和培养的方法. 方法：采用胰蛋白酶/胶原酶（1∶1）混合酶液消化法培养人脐静脉内皮细胞，简化完全培养液组分（不添加血管内皮细胞生长因子、肝素等辅助因子），当原代培养细胞80％以上汇合后用胰蛋白酶消化传代；用形态学、免疫细胞化学法进行鉴定. 结果：种植在培养瓶中的内皮细胞4h贴壁生长，48~96 h生长最快，7~10 d汇合. 内皮细胞呈单层铺路石样外观，Ⅷ因子相关抗原（Ⅷ：Ag）和内皮细胞生长因子受体2（KDR）鉴定内皮细胞纯度达95％以上. 结论：用混合酶液灌注脐静脉消化内皮细胞是获取内皮细胞的一种好方法，可靠性大，成功率高，可以构建体外研究血管内皮细胞的模型.【关键词】内皮细胞；脐静脉；细胞培养0引言血管内皮细胞(vascular endothelial cell, VEC)在心血管疾病的发生中占有重要的地位［1］. 采用培养的VEC进行相关机制研究是一种普遍应用的实验方法. 由于人体组织取材限制，很难获取大量原代培养的人VEC.我们以健康胎儿脐静脉血管为材料，建立起一种改良的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, hUVEC）培养方法.1材料和方法1.1材料新生儿脐带由遵义医学院附属医院提供；胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、EDTA（Sigma公司）；M199、胎牛血清（Gibco公司）；台盼蓝(Amresco公司进口分装)；鼠抗人Ⅷ因子抗体、鼠抗人内皮细胞生长因子受体2（KDR）抗体（美国Dako公司）；超净台（苏州苏净集团安泰空气公司）、倒置相差显微镜（日本Nikon公司）, CO2孵箱（美国Thermo Formo公司）、酶标仪（德国Huma Reader公司）. 完全培养液为800 mL/L M199培养液、200 mL/L胎牛血清、2 mmol/L L谷氨酰胺、1×105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素，使用前调节pH至7.0~7.4.1.2方法1.2.1hUVEC的分离和培养在无菌条件下，取健康产妇分娩后6 h内［2］的脐带，长约30 cm,剪去脐带两端钳夹处. 于脐静脉一端插入一针头，用生理盐水反复冲洗至无血迹后，将脐静脉另一端用止血钳夹紧，用空针封闭. 灌入1 g/L胶原酶和2.5 g/L胰蛋白酶（1∶1）（V/V） 15 mL，置37℃水浴箱中孵育8 min，将消化液收集入离心管，用PBS冲洗脐静脉2次，将冲洗液一同收集入离心管，1000 r/min 离心10 min，去上清液，加入完全培养液重悬细胞，取0.1 mL细胞悬液用4 g/L台盼蓝染色后作活细胞计数. 将1.5×107/L细胞接种到24孔板中，每孔加入完全培养液1 mL，置37℃，950 mL/L O2，50 mL/L CO2培养箱内静置培养，次日换培养液，以后每3 d换液1次，7~10 d 融合.1.2.2细胞计数采用台盼蓝排斥法. 取0.1 mL混匀的内皮细胞悬液与4 g/L台盼蓝0.9 mL混匀后，取1滴在显微镜下计数100个细胞. 当细胞悬液中细胞存活率大于95%时可用于进行原代细胞培养.1.2.3hUVEC的鉴定［3-5］用Ⅷ因子抗体（抗von Willebrand 因子抗体）以及KDR抗体免疫细胞化学法鉴定内皮细胞. 将酸化处理的普通盖玻片消毒后放入6孔培养板，将原代或传代的内皮细胞悬液接种于盖玻片上，当细胞生长至近融合状态时用PBS缓冲液冲洗细胞爬片，-20℃丙酮固定10 min；PBS缓冲液洗3次，5 min/次；用30 mL/L H2O2,室温孵育5 min，灭活内源性过氧化物酶；分别滴加适量鼠抗人Ⅷ因子一抗工作液（1∶100）； KDR（1∶200）一抗工作液，37℃作用60 min；PBS缓冲液洗3次，每次5 min；再分别滴加羊抗鼠的IgGFITC 和IgGTR的二抗工作液，37℃作用30 min后，PBS洗涤3次. 立即在荧光显微镜下观察、摄片. GAMFITC绿色荧光显示膜上KDR；GARTR红色荧光显示胞内的Ⅷ因子. 对于Ⅷ因子相关抗原还采用免疫细胞化学SABC法进行检测，显微镜下观察.1.2.4hUVEC的消化传代①取生长融合的细胞吸去培养液，PBS洗2次；②翻转培养瓶，加入1.25 g/L胰蛋白酶, 0.2 g/L EDTA 的细胞消化液；③倒置显微镜下观察细胞消化情况，待细胞与细胞分开、胞体变圆变亮时翻转培养瓶，吸去消化液；④加入完全培养液，小心吹散细胞，计数，接种到新的培养瓶或培养板, 置37℃, 50 mL/L CO2培养箱中培养.1.2.5细胞生长曲线的测定取待测生长状态良好细胞，增长至接近汇合时向培养瓶内加入1 mL 1.25 g/L胰蛋白酶液消化，待细胞接近脱离瓶壁前吸出消化液，加入完全培养液，轻轻吹打制成细胞悬液、计数. 向24孔板的每孔中接种等量细胞，置37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养. 将细胞分成8组，每组3孔，培养8 d. 从接种次日起每24 h分别取3个孔计数，取平均值，以时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制生长曲线.2结果2.1hUVEC的培养与鉴定在倒置显微镜下连续观察，培养的原代内皮细胞在接种4 h之后开始贴壁生长，细胞呈球形、小多角形，单个或小团块存在. 接种第2～3日，细胞即进入对数生长期，细胞生长迅速；第5～8日时铺满培养瓶瓶底，呈现典型的铺路石样形态特征(图1). Ⅷ因子mAb免疫细胞化学结果显示95%以上为阳性血管内皮细胞，细胞胞质为棕黄色，胞核为蓝色(图2). KDR(图3)和Ⅷ因子(图4)免疫荧光双标显示95%以上为阳性血管内皮细胞.图1培养6 d的原代脐静脉内皮细胞（略）图2脐静脉内皮细胞Ⅷ因子免疫组化检测（略）图3脐静脉内皮细胞内皮细胞生长因子受体2免疫荧光检测（略）2.2hUVEC生长曲线测定通过细胞计数,接种后第1日，细胞较接种时无明显变化，此时细胞仍处于滞留期，第2日则明显增加，第3~5日增长迅速,达到其生长高峰，此时细胞处于对数生长期，第6~8日细胞生长稳定,处于生长平台期(图5).图4脐静脉内皮细胞Ⅷ因子免疫荧光检测（略）图5原代人脐静脉内皮细胞生长曲线（略）3讨论我们以人脐静脉作为培养血管内皮细胞的来源，是因为它具有取材及操作方便，获得细胞数多，在某些方面尚具有与动脉生物学特征相似的优点.获取内皮细胞的方法有机械刮取［6］、组织块移植和酶消化法3种. 前两种易混杂其它血管壁细胞，近几年来已逐渐被酶消化法取代. 从分离细胞数量、保持细胞活性和结构完整性来看，胶原酶是理想的血管内皮细胞分离酶，自成功分离hUVEC以来，已得到广泛应用，但其价格昂贵. 用胰蛋白酶代替胶原酶分离血管内皮细胞已有文献报道. 我们比较了全胶原酶和胰蛋白酶加胶原酶混合两种酶液的消化能力，结果表明，采用胰蛋白酶加胶原酶混合消化的方法，hUVEC 收获量基本接近全胶原酶血管内皮细胞的收获量. 在混合酶液中，胶原酶仅占1/2，这种方法既经济，效果又好. 而且用胰蛋白酶处理可以降低非内皮细胞的贴壁能力，内皮细胞的贴壁能力比平滑肌细胞和成纤维细胞早，所以在接种后6 h可以去除未贴牢的细胞，这些非内皮细胞的污染如不去除，将抑制内皮细胞的增殖.hUVEC较动物内皮细胞的培养困难，只有在培养液中加入刺激细胞生长的物质，方能长期传代培养. 董玉兰等［7］和Relou等［8］报道，培养液中加入人血清、血管内皮细胞生长因子、肝素及培养瓶（皿）用明胶覆盖是hUVEC长期培养的重要条件. 但这些促进内皮细胞贴壁及生长的物质的加入可能成为影响实验结果的混杂因素，限制内皮细胞的实验应用范围. 有人［9-11］研究发现，血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等有助于培养的胚胎干细胞分化为内皮细胞. 胚胎干细胞有望成为新的种子细胞来源. 我们在改进内皮细胞分离和传代方式的基础上选择M199培养基，补充200 mL/L胎牛血清和2 mmol/L L谷氨酰胺，在维持内皮细胞正常生长和形态结构的前提下尽可能减少完全培养液的组分，能将hUVEC传5～6代. 总之，我们改进的hUVEC培养方法可获取足够数量高纯度可传代的内皮细胞，对内皮细胞生物学特性和心脑血管相关疾病的研究有重要意义.【参考文献】［1］ Li XD, Lu kH, Guo SZ, et al. Culture of vascular endothelial cell ［J］. Chin J Aesthetic Med, 2001,10(3):18-20.［2］王建民，刘荫秋，赖西南. 正常脐静脉离体后不同时间内皮某些物质含量的变化［J］. 第三军医大学学报，1995，17（1）：86.［3］ Jonathan B. Rosenberg, Judith S, et al. Genetic induction of a releasable pool of factor Ⅷ in human endothelial cells ［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2000, 20 (12)：2689-2695.［4］李孟彬，王为忠，张宏伟，等. 猪血管内皮细胞的培养与表型鉴定［J］. 第四军医大学学报，2004，25（24）：45.［5］ Mario P, Afazal J, Daniel P, et al. Expression of VEGFR2 and AC133 by circulating human CD34+ cells identifies a population of functional endothelial precursors ［J］. Blood, 2000,95（3）：952-958.［6］ Quattrone S, Chiappini L, Scapagnini G, et al. Relaxin potentiates the expression of inducible nitric oxide synthase by endothelial cells from human umbilical vein in in vitro culture ［J］. Mol Hum Reprod, 2004,10(5): 325-330.［7］董玉兰，陈铁镇，王铁吉,等. 人脐静脉内皮细胞的继代培养［J］. 中国医科大学学报，1989，18（2）：81-85.［8］ Relou IAM, Damen CA, Van der Schaft. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness ［J］. Tissue Cell, 1998,30(5):525-530.［9］ Evans GR, Brandt K, Klatz S, et al. Bioactive poly(Llactic acid) conduits seeded with Schwann cells for peripheral nerve regeneration［J］. Biomaterials, 2002,23(1):841.［10］ Liang PF, Zhang PH, Yang XH, et al. Experimental study on inductionof endothelial apoptosis by burn serum and subeschar tissue fluid ［J］.中华烧伤杂志,2004,20(5):275-277.［11］ Savore C, Zhang C, Muir C, et al. Perlecanknockdown in metastatic prostate cancer cells reduces heparinbinding growth factor responses in vitro and tumor growth in vivo ［J］. Clin Exp Metastasis,2005,22(5):377-390.。
人脐静脉血管内皮细胞的高效分离与培养
人脐静脉血管内皮细胞的高效分离与培养张臣;李彤;侯跃龙;严晓晔;高英堂【摘要】目的:建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外分离、培养、鉴定的高效方法.方法:胰酶消化法从脐静脉获得HUVEC,观察其形态并传代培养,检测其摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-AcLDL)的情况,传3代流式榆测内皮细胞特异性表达.结果:消化分离的细胞呈小圆形且聚集成团;2h细胞开始贴壁,呈条索状;7d细胞增多呈漩涡样生长;此后细胞继续增多接近融合,呈铺路石样改变.流式检测细胞高表达血管内皮细胞特异性标志CD144、vWF、CD31,部分表达CD34,而白细胞共同抗原CD45为阴性表达.镜下发现贴壁细胞原代、第5代摄取Dil-AcLDL,胞浆呈现红色荧光,提示为有活性的内皮细胞.结论:利用胰酶消化法能从人脐静脉获得大量内皮细胞,体外培养后能成功增殖传代.【期刊名称】《天津医药》【年(卷),期】2010(038)007【总页数】3页(P605-607)【关键词】内皮细胞;脐静脉;细胞培养技术;细胞分离;连续传代【作者】张臣;李彤;侯跃龙;严晓晔;高英堂【作者单位】300170,天津市第三中心医院,天津市人工细胞重点实验室;300170,天津市第三中心医院,天津市人工细胞重点实验室;300170,天津市第三中心医院,天津市人工细胞重点实验室;300170,天津市第三中心医院,天津市人工细胞重点实验室;300170,天津市第三中心医院,天津市人工细胞重点实验室【正文语种】中文人的内皮细胞是血管壁的主要组成部分，在维持组织稳态、纤溶与凝血、血液组织交换、血管舒缩调节、血管新生、血细胞激活和迁移等生理和病理过程中发挥着重要作用，另外在免疫反应起始过程中也起着决定性的作用[1]。
因此体外获得血管内皮细胞可为阐明许多疾病血管并发症的病理过程提供重要研究模型[2]。
新生儿脐带由于取材经济、来源充足,而成为血管内皮细胞体外获得的主要材料。
人脐静脉内皮细胞分离培养及鉴定技术
２ １ ４月 ０ ０年
第１ ４卷
第 ４期
一
５ｌ 一 Ｉ
文 章 编 号 ：０７— ２７２ １）４ ５ １ ３ １０ ４ ８ （００ ０ —０ １ —０
人 脐 静 脉 内皮 细 胞 分 离 培 养 及 鉴 定 技 术
吴金 义 张 ， 蕾 ， 张秀英 曲丽梅 ，
（． １吉林大学 中 日联谊 医院 心内科 ， 吉林 长 春 １０ ３ ； ． ３０３ ２ 一医院 病理科 ） 摘要： 目的 探讨人脐静脉 内皮 细胞 （ Ｖ Ｃ 体外 分离 原代 培养 的方法 ， ￣ＪＥ ） 并总结对培养 的细胞 鉴定 方法。方法
通过胰酶灌注法从人脐带获取 内皮 细胞 进行分离培养 ， 并采用免疫组 化法及 光镜和透射 电镜观察 超微结构 鉴定所获
得 的细胞系 。结果
分离 的 Ｈ Ｖ Ｃ在体外 ７ ０天左右可长成单层 ， ＵＥ —１ 光镜下 胞体 为单层铺 路石状排列 。第 ＶＩ 因子 Ｉ Ｉ
用胰酶灌 注法是获
相关抗原 的检测 为阳性 。透射 电镜下 观察培养的内皮细胞胞浆内可见 Ｗｅ ｅ—ａ ｄ 小体 。结论 ｉｌ ｌｅ ｂ Ｐａ 得脐静脉 内皮细胞 的有效 方法 。本 方法 为血 管内皮细胞的研究提供 了实验模型 。
（ ’ Ｌ ｂＤ ａ ｎ ２ １ ，４ ０ １ ） Ｃ Ｊ ａ ／ ， ０ １ ： １ ｇ ０ ５
ｃｅ ａ ｎ ｔｅ ｃ ｉ ｐ ａ ｍ ｕ ｄ ｒｅｅ ｔ ｎ—ｍ ｃｏ ｃ ｐ ｈ ｃ ｅ ｅ ｉｅ ｔ ｅ Ｃ ． ｎ ｌ ｓ ｎ Ｔ ｅｄ ｇ ｓ ｏ ｆ ａ ｃ ｅ ｔ ｅ ＿ ｌ ｓｗ ｓ ｉ ｅｌ ｌ ｅ ｌｃｒ ｈ ｓ ｎ ｏ ｉ ｒｓ ｏ ｙｗ ｉｈ ｗ ｒ ｄ ｎｉ ｄ ａ Ｅ ｓ Ｃｏ ｃ ｉ ｈ ｉ ｔ ｎ ｏ ｎ ｒａｉ ｐ ｄ — ｉ ｆ ｓ ｕ ｏ ｅｉ ｐ ｎ ｕ ｓ ｎ ｉ ａ ｆ ｃ ｖ ｔ ｏ ｏ ｇ ｉ Ｃ ， ｄ ｔｉ ｍｅ ｏ ｒ ｖｄ ｓｅ ｐ ｒ ｎａ ｄ ｌｆｒＶ Ｃｌ Ｃ ｅ ｅ ｒ ｈ ｉ ｅ ｅ ｔ ｅ ｍｅｈ ｄ ｔ ａｎ Ｅ ｓ ａ ｈｓ ｔ ｄ ｐ ｏ ｉｅ ｘ ｅ ｉ ｔ ｍｏ ｅ ｏ ａ ｌａ Ｅ ｓｒ ｓ ａｃ ． ｏ ｓｎ ｉ ｎ ｈ ｍｅ ｌ ｓ ｌ ｒ Ｋｅ ｒ ｓ ｈ ｍａ ａ ｃ ｌｒ ｎ ｏｈ ｌ ｅｌｉ ｍｂｌ ａ ｖ ｉ ｃ ｌ ｃ ｔｒ ；ｄ ｎ ｉ ｃ ｔ ｎ ｙ ｗｏ ｄ ： ｕ ｎ ｖ ｓ ｕ ａ ｄ ｔｅｉ ｃ ｌ ｎ ｕ ｉ ｃ ｅｎ； ｅ ｕ ｕ ｅ ｉ ｅ ｔ ａｉ ｅ ｌ ａ ｉｌ ｌ ｉ ｆ ｏ
人脐静脉内皮细胞的分离培养及鉴定
两种易混 杂其 它血管壁细胞 ， 年 已逐渐被酶 消化 法取 近
代 ＿。 蛋 白酶 、 原 酶 均 可 用 于 消 化 血 管 内皮 细 胞 ， ２胰 Ｉ 胶 但 胰 蛋 白酶 对 内 皮 细 胞 的 损 伤 较 大 ； 原 酶 作 用 较 温 和 ， 胶 但 价 格 昂 贵 ， 制 了 其 在 大 规 模 实 验 研 究 中 的应 用 。 限 本
用Ｓ Ｐ系 列 试剂 盒 、 ＤＡＢ显 色 试 剂 盒 为 中杉 金 桥 生 物 技 术
２ 结果
２ １ 形 态 学观 察 原 代 细 胞 呈单 层生 长 ， 界 清楚 ， ． 边 形 态 为 卵 圆 形 。 养 ３ ｄ 合 ， 典 型 的铺 路 石 状 镶 嵌 排 培 —４ 融 呈
列 。 代细 胞的形 态和 生长特 点与原 代细胞 类似 。 传
公司； 净化工作台 ， 上海新苗 医疗 器械制 造有限公司。
１ ２ 方 法 ．
人 脐静 脉 作 为 内皮 细胞 的 材料 来 源 ， 有取 材 容 具
易 、 作 方 便 的 特 点 ， 与 各 种 实 验 动 物 相 比 ， 实 验 条 操 且 其 件 更 符 合 人 体 情 况 ， 果 更 具 有 意 义 。 培 养 细 胞 的 获 结 在 取 方 法 上 ， 机 械 刮 取 、 织 块 移 植 和 酶 消化 法三 种 。 有 组 前
洗脐静 脉 ， 将冲洗液一并收 集在锥形瓶 中 ， 离心 ｌ ｍｉ ｎ； ０
固定 １ｍｉ ，％Ｈ， 浸泡３ ｍｉ ， ０ ｎ ３ Ｏ， ０ ｎ 山羊血清封闭 ， 加入兔抗 人Ⅷ 因子Ｉ Ｇ抗体 （ ｇ 一抗 ） ℃过夜 ， ＡＢ显色 ， ４ Ｄ 苏木精 复 染 ， 水透 明封 片 后显微镜 下观察 。 脱 以胞 质内 出现棕 黄
人脐血CD133 +血管内皮祖细胞的培养、鉴定与分化研究
可分化为梭形血管 内皮细胞及形成集 落 ； Ｃ Ｄ １ ３ ３ 细胞培 养过 程 中 Ｄ ｉ ｌ － Ｌ Ｄ Ｌ及 Ｆ ＴＣ Ｉ － Ｌ ｅ ｃ ｔ ｉ ｎ摄取 阳性 ， 双染 阳性率为 （ ９ ５ ． ８ ３± １ ． ７ ２ ） ％； Ｃ Ｄ １ ３ ３ 细胞 培养 １周后经 免疫组 织化学 检测 Ｃ Ｄ ３ ４ 、 Ⅷ因子 阳性 率 分别 为（ ９ ５ ． ８ ３± ２ ． ２ ３ ） ％ 和（ ９ ５ ． ９ ２±１ ． ４ ３ ） ％， 与人脐静 脉 内皮 细胞 比较 差异无统计 学意 义 ； Ｃ Ｄ １ ３ ３ 细胞体外培养 ４ ｄ 、 １ 周可形成小血 管结 构。结论 免疫 磁珠分选法 可获取 较高 纯度 Ｃ Ｄ １ ３ ３ 血 管 内 皮祖细胞 ， 在生长因子作 用下诱 导其分化为成熟血管 内皮细胞 。
维普资讯
２ ０ ０ ７年 ５月 第 ４ ５卷 第 ９期
Ｃ ｈ ｉ ｎ Ｊ Ｓ ｕ ｒ Ｋ ． Ｍａ ｙ ２ ０ ０ ７， Ｖ ｏ １ ． ４ ５ ， Ｎ ｏ ． ９
・
６１ ９・
．
论 著
人脐血 Ｃ Ｄ １ ３ ３ ＋ 血 管 内皮 祖 细胞 的 培养 、 鉴 定 与 分 化 研 究
【 关键词】 血管 内皮 ； 干细胞 ； 细胞培养
Ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｏ ｎ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ． ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｉｃ ｆ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ 谶 ￣ｎ ｉａ ｔ ｉ ｔ ｏ ｎ ｏ ｆ ＣＤ１ ３ ３ ｅ ｎ ｄ ｏ ｔ ｈ ｅ ｌ ｉ ａ ｌ ｐ ｒ ｏ ｇ ｅ ｎ ｉ ｔ ｏ ｒ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｆ ｒ ｏ ｍ
验、 细胞 免疫组 织 化 学 等 进 行 鉴 定 。结果 经 流 式 细 胞 仪 检 测 Ｃ Ｄ １ ３ ３ 细 胞 平 均 占单 核细 胞 的
人脐静脉内皮细胞体外培养_鉴定与形态学特征观察
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人脐静脉内皮细胞的分离培养及鉴定
physiology and the role of novel risk factors:a
静脉通道，遇到病情变化可随时用药，为抢救患者生命
2 方法
赢得了宝贵的时间。
2.1 材料选用 套管针采用洁瑞公司生产的封闭式套 3.3 套管针的穿刺部位均为静脉远端，近邻无重要脏
管针，型号为２０Ｇ或２２Ｇ；敷料采用３Ｌ公司９ｃｍ×６ｃｍ的无 器组织，从而避免了深静脉穿刺的并发症。
菌透明敷贴。
4 使用套管针的注意事项
静脉套管针作为一项新的护理技术已广泛应用于 套管，放松止血带，拔出针芯，用无菌透明敷贴固定套管
临床，特别在急危患者的抢救中更为重要，它保持了静 针，调节输液速度。
脉管道的持续畅通。在Ｃ Ｃ Ｕ 的工作中常常遇到以下情 3 使用套管针的优越性
况：急性心肌梗死的患者由于剧烈的胸痛和恶心呕吐导 3.1 套管针针体长，外套管柔软远端圆滑而整齐，留
1 临床资料
体外渗的发生，对急性心肌梗死的患者静脉具有保护作
我院自２００８．１－２００９．４应用静脉套管针技术抢救急 用，套管针可以留置５－７ｄ［２］。对于需要反复多次静脉输液
性心肌梗死患者１００例，其中男６８例，女３２例；年龄２９－８６ 及随时需要输液的患者，套管针的留置等于一条开放的
岁，平均６ ７ ． ４ 岁。
·６０·
承 德 医 学 院 学 报 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＥＮＧＤＥ ＭＥＤＩＣＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ
原代人脐静脉内皮细胞培养方法经验总结
原代人脐静脉内皮细胞培养方法经验总结刘文;陈瑞云;王志伟【摘要】目的建立分离培养原代人脐静脉内皮细胞的方法.方法采用0.125％胰酶+0.01％乙二胺四乙酸(EDTA)消化液灌注法,获得原代人脐静脉内皮细胞,用免疫组织化学方法进行细胞鉴定.结果原代培养的脐静脉内皮细胞呈典型的铺路石样排列;细胞鉴定可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应.结论 0.125％胰酶+0.01％EDTA消化法能够获取大量且纯度高的原代人脐静脉内皮细胞,为体外实验提供可靠的细胞模型.【期刊名称】《中国医学工程》【年(卷),期】2016(024)008【总页数】3页(P11-13)【关键词】原代人脐静脉内皮细胞;分离;细胞培养【作者】刘文;陈瑞云;王志伟【作者单位】山东省青岛科技大学校医院内科,山东青岛266044;山东省青岛大学第二附属医院胃肠外科,山东青岛266042;山东省青岛大学第二附属医院肛肠外科,山东青岛266042【正文语种】中文【中图分类】Q813.11血管内皮细胞（endothelial cell, EC）是血管内表面的单层扁平上皮，构成了血管壁与血液之间的机械屏障，EC能吞噬异物、细菌、坏死和衰老的组织，能分泌很多生物活性物质以调节血管通透性、参与凝血和动脉粥样硬化过程，还能通过调节血管的收缩和舒张以调节血压等。
为研究人体大血管内皮功能需要体外建立人血管内皮细胞模型，而内皮细胞株ECV304,在形态学、基因学等生物特性上与内皮细胞存在明显差异[1]，因此，体外分离培养原代人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）是获取内皮细胞的重要途径。
本实验总结了体外培养HUVECs的方法，应用消化酶灌注法,成功分离了人脐静脉内皮细胞，获取了大量的HUVECs，创建了研究内皮细胞的模型。
1 材料与方法1.1 标本来源脐带均来自于剖宫产的新生儿脐带，于无菌条件下获取，迅速转移至细胞室超净台中，进行分离培养。
人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定
人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定王娟;陆琰;何冬梅;张洹【期刊名称】《暨南大学学报（自然科学与医学版）》【年(卷),期】2009(030)004【摘要】目的:从人脐带中分离、培养并鉴定间充质干细胞(MSCs).方法:用胶原酶消化法分离脐带间充质干细胞,差速贴壁法进行纯化;MTT法检测细胞增殖活性,并绘制生长曲线;流式细胞仪检测其表面标志和细胞周期;地塞米松、抗坏血酸、磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,并用碱性磷酸酶染色鉴定;地塞米松、胰岛素、吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,用油红O染色鉴定;将脐带MSCs注射到BALB/c裸鼠肾被膜下,观察有无致瘤性.结果:从人脐带中分离出的同充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞表达CD29、CD44,低表达CD106,不表达CD14、CD31、CD34、CD45和HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能;将脐带MSCs移植到BALB/c裸鼠肾被膜下,未观察到致瘤性.结论:从脐带中成功分离培养的细胞,具有间充质干细胞生物学特性.【总页数】6页(P367-372)【作者】王娟;陆琰;何冬梅;张洹【作者单位】暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632【正文语种】中文【中图分类】Q813【相关文献】1.人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定 [J], 王玲玲;马峰;张玉成;杜珍武;张桂珍2.睾丸Leydig干细胞分离、纯化及鉴定的体外研究 [J], 肖斌;王晓云;周广东;周英晋;毕宏达;朱吉;张敬德;邢新3.大鼠雪旺细胞体外分离培养纯化及鉴定 [J], 张春燕;张自强;刘玉梅;邓雯;王玉琴4.猴头菌素分离纯化、结构鉴定及体外活性研究 [J], 何晋浙;樊鹏;孙培龙5.胎猪胰腺导管干细胞的体外分离、纯化、培养及鉴定 [J], 李云龙;郭欣;杨晓波;黄跃南因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
内皮细胞增殖实验步骤
一、脐带内皮细胞的分离1. 脐带收集用无菌止血钳夹闭脐带两端，在止血钳外侧剪断脐带，放入盛有4 ℃Cord Buffer 的饭盒内。
脐带在4 ℃放置不应超过24 小时。
2. 脐带内皮细胞分离（1）带无菌手套，取出脐带，在止血钳内侧用碘酒和酒精棉球消毒后，用无菌剪刀将两端脐带剪除。
（2）在脐带一端找到静脉，插入脐带静脉插管，用2 根粗丝线扎牢，用Cord Buffer 抽吸有的30 ml注射器冲洗静脉腔，至将脐血洗净。
（3）赶出静脉腔内残余液体，将脐带另一端用止血钳夹闭，用10 ml注射器连接针头，注入37 ℃预热的0.1 ％胶原酶约6-8 ml，放入37 ℃Cord Buffer中保温6-10 min。
（4）吸出静脉腔内胶原酶所消化的细胞悬液，加入预加有20 ml Cord Buffer的离心管中，冲洗静脉腔，一并加入离心管中。
（5）离心，1500 rpm，10 min弃上清，用5～7 ml 20 ％FCS，RPMT 1640重悬细胞，转入培养瓶，放5 ％CO孵箱。
二、牛下丘脑内皮细胞生长因子粗提物的制备1. 取新鲜牛下丘脑，加1.5倍体积的冰生理盐水用组织匀浆机匀浆，每次0.5 min，共6次。
2. 在4 ℃条件下用震荡器机械震荡约1.5 h。
3. 离心，10000 g，40 min，收取上清液。
4. 按0.5 ％加硫酸链霉素，4 ℃过夜。
5. 离心，20000 g，40 min，收取上清液。
6. 用紫外分光光度测280 nm，260 nm OD值按公式计算蛋白含量。
7. 过滤，分装，-20 ℃保存备用。
三、内皮细胞的培养与鉴定1. 培养瓶包被明胶培养瓶（25 cm）中加入0.2 ％明胶3 ml，使其铺满瓶底，放4 ℃备用。
用前弃去明胶溶液。
2. 原代培养将从脐带静脉中收集到的内皮细胞移入包被明胶的培养瓶（25 cm），加5～7 ml 20 ％小牛血清199培养基，按终浓度分别为20 μg/ml和100 μg/ml加入内皮细胞生长因子粗提物和肝素。
内皮实验报告
实验目的：本研究旨在通过体外实验，探讨内皮细胞在不同条件下的生物学特性，包括细胞增殖、凋亡、迁移和血管生成能力，以期为内皮细胞在疾病发生发展中的作用提供实验依据。
实验材料：1. 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）2. DMEM培养基（高糖）3. 胎牛血清（FBS）4. 0.25%胰蛋白酶5. 细胞培养箱6. 倒置显微镜7. 流式细胞仪8. 实验试剂（如Annexin V-FITC/PI双染试剂盒、血管内皮生长因子（VEGF）检测试剂盒等）实验方法：一、细胞培养与鉴定1. 将HUVECs接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
2. 每2-3天更换一次培养基。
3. 利用免疫荧光染色法鉴定内皮细胞，观察细胞形态和内皮细胞标记物（如VE-cadherin）的表达。
二、细胞增殖实验1. 将细胞分为实验组和对照组。
2. 实验组给予不同浓度的VEGF处理，对照组给予等量DMEM培养基。
3. 在不同时间点收集细胞，利用CCK-8法检测细胞增殖情况。
三、细胞凋亡实验1. 将细胞分为实验组和对照组。
2. 实验组给予不同浓度的肿瘤坏死因子α（TNF-α）处理，对照组给予等量DMEM 培养基。
3. 利用Annexin V-FITC/PI双染试剂盒检测细胞凋亡情况。
四、细胞迁移实验1. 将细胞分为实验组和对照组。
2. 实验组给予不同浓度的细胞外基质（ECM）蛋白处理，对照组给予等量DMEM培养基。
3. 利用Transwell小室检测细胞迁移能力。
五、血管生成实验1. 将细胞分为实验组和对照组。
2. 实验组给予不同浓度的VEGF处理，对照组给予等量DMEM培养基。
3. 利用血管生成实验试剂盒检测细胞血管生成能力。
实验结果：一、细胞培养与鉴定成功培养出HUVECs，细胞形态为长梭形，细胞表面表达VE-cadherin。
二、细胞增殖实验VEGF处理组细胞增殖能力明显增强，与对照组相比，增殖率显著提高。
三、细胞凋亡实验TNF-α处理组细胞凋亡率显著升高，与对照组相比，凋亡率显著增加。
huvec细胞鉴定方法-概述说明以及解释
huvec细胞鉴定方法-概述说明以及解释1.引言1.1 概述HUVEC（人脐静脉内皮细胞）是一种常用的细胞模型，在很多生物医学研究中被广泛应用。
正确认识和鉴定HUVEC细胞的方法对于确保实验结果的准确性和可靠性至关重要。
然而，由于其细胞特性的多样性和相似性，准确地鉴定HUVEC细胞一直是一个具有挑战性的课题。
目前，主要的HUVEC细胞鉴定方法包括形态学观察、免疫细胞化学染色和遗传学分析等。
形态学观察是最直观的方法，通过观察细胞的形态、大小、颜色等特征来初步鉴定。
然而，形态学观察仅仅是最初的鉴定步骤，无法提供确凿的证据。
免疫细胞化学染色是一种常用的鉴定方法，通过使用特异性的抗体标记HUVEC细胞所表达的特定蛋白，如血管内皮细胞相关抗原（CD31）、血管内皮细胞黏附分子（VCAM-1）等。
这种方法能够在细胞水平上确定细胞的身份，并且具有较高的特异性和敏感性。
另外，遗传学分析也是一种重要的HUVEC细胞鉴定方法。
通过检测HUVEC细胞中特定基因的表达情况或突变情况，如内皮细胞特异性基因（von Willebrand因子、血管内皮生长因子等）的表达，或特定突变基因（如朊病毒受体Eynoltin-2的突变）等，可以进一步确定细胞的身份。
综上所述，准确鉴定HUVEC细胞的方法包括形态学观察、免疫细胞化学染色和遗传学分析等多种方法的综合应用。
在进行HUVEC细胞相关研究时，应充分考虑综合运用这些方法来确保实验结果的准确性和可靠性。
未来的研究可以进一步改进和发展更加精确、高效的HUVEC细胞鉴定方法，以满足不断深入的实验需求。
1.2 文章结构文章结构部分的内容如下：文章结构部分旨在向读者介绍本篇文章的整体结构，以帮助读者更好地理解和阅读文章。
本文分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分包括概述、文章结构和目的三个方面。
在概述中，将简要介绍HUVEC细胞的重要性和研究价值。
文章结构部分将向读者展示本文的整体框架，以便读者在阅读过程中能够有条不紊地理解文章内容。
人脐静脉内皮细胞体外培养方法的改进
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究 奠 定基 础 。方 法 比较 ０ ２ 胰酶 、 ． Ｉ型胶 原酶 、 ． ５ 胰 酶 与 ０ １ Ｉ型胶 原酶 （ ．５ ０１ ０ ２ ． １：１ ３种 消化 方 法 分 离 ＨＵＶＥ ） Ｃｓ的
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人脐静脉内皮胞细体外培养及鉴定
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人 脐 静 脉 内皮胞 细体 外 培 养及 鉴 定
李 东升 邵 素玲 杨 万松 黄 体钢 １解放 军 ２ ６医院心 内科 河 北 承德 （ ６ ２承德 医学 院附属 医院 消毒 供应 中心 河 北 ３天 医科 大 学第二 医院心脏 科 天津 承德 ０７０ ６００； ３０ １ ） ０２ １
人脐带间充质干细胞来源外泌体的提取、鉴定和蛋白组学分析
人脐带间充质干细胞来源外泌体的提取、鉴定和蛋白组学分析摘要：目的：探讨人脐带间充质干细胞来源外泌体进行提取鉴定和蛋白组学。
方法：培养人脐带间充质干细胞并采用超滤序贯超离法提取外泌体，通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、蛋白质定量、蛋白质印迹法及蛋白组学分析等技术鉴定。
结果①所抽取的外泌体分散度比较好，而且均匀。
②，外泌体粒径分布的高峰为（129.5+8.7) nm，它的膜表面是带有负电荷的，其浓度为8.375>109颗粒/ml，平均 zeta电位为（-28.1+3.6) mV。
③ 外泌体中存在着一类特殊的膜蛋白，即CD9,CD63等。
④蛋白质组学研究发现外泌体中的大部分蛋白都具有较高的活性，它们涉及到 RNA剪接、 mRNA加工、蛋白质折叠等生物学过程，涉及到 RNA/DNA等基因材料的合成、加工、降解等过程。
结论：经研究发现，人脐带间充质干细胞外泌体与其母系细胞存在某种“同质”、“差别”，且这些“差别”的蛋白质功能与其自身的免疫学特性都不相关，从而证实人脐带间充质干细胞外泌体具有较小的免疫学活性及较高的安全性。
关键词：人脐带间充质干细胞；外泌体;蛋白组学:免疫原性引言：间充质干细胞起源于中胚层，它是一种能够在各种组织中进行定向分裂并进行自身增生的干细胞，它可以从各种组织中被提取，比如脐带、子宫内膜息肉、月经期血液、骨髓、脂肪组织等，由于它的来源多样化，并且可以大规模地获取，所以它在实验和临床上都有着非常重要的研究价值。
本课题拟通过分离人脐带间充质干细胞源性外泌体，并通过比较两者的蛋白质组水平上的差别，验证其在体外的免疫活性，进而验证其在临床上的应用前景，并评估其在临床应用中的应用前景。
一、资料与方法1.1一般资料选取本企业2021年8月至2022年8月该时间段接受人脐带充质干细胞来源外泌体进行提取鉴定和蛋白组学分析的足月产新生儿脐带50例。
1.2方法1．2.1人脐带间充质干细胞培养及鉴定(1)人脐带充质干细胞的原代培养法：6小时之内，对所收集的脐带进行清洗，并将其两侧有瘀斑或瘀斑的部位，用 PBS对其周边及脐静脉进行彻底的清洗，并将其切割为1毫米×1毫米×1毫米的小段，并将其放置在18 wt的 DMEM全培养剂（Rh)+1 wt青链霉索 V+ DMEN （DMEM）浸润的T75玻璃瓶底部，底部向上，放置在37℃，5%体积分数的 DMEM全培养剂（DMEM）浸润的玻璃瓶中，2小时后将玻璃杯倒置，倒入5 mL DMEM全培养剂，第2日再更换玻璃杯，并用2 mL TrypL酶解，使其达到70%-80%的水平，按1:4的比例进行传代，获取生长良好3-6代细胞。
改良酶消化法体外培养人脐静脉内皮细胞
４ ６・ ７
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改 良酶 消 化 法体 外 培 养人 脐 静 脉 内皮 细胞
张 瑛 邹和群 ｈ ， 夏 学颖 （ ， 南方医科大学第三附属医院肾内科， 广州 ５０３； 广东省妇幼保健院整形 １ ０ ６
Ｍ ｏ ｉｉｄ ｅ ｚ ｍｅ ｄ ｇ ｓｉ ｎ ｔｃ ｎ ｑ ｅ ｆ ｒ ｃ ｌ ｒｎ ｕ ａ ｂ ｌ ｌｖ ｉ ｎ ｏ ｈ ｌ ｌ ｅｌ ｄ ｆ ｎ ｙ ｉ ｅ ｔ ｅ ｈ ｉ ｕ ｏ ｕ ｔ ｉ ｇ ｈ ｍ ｎ ｕ ｅ ｏ ｕ ｍ ｉ ａ ｅｎ ｅ ｄ ｔ ｅｉ ｌ ｉ ａ ｃ ｓ
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胞模型的构建。
离培养方法 ， 以在体外获得较高数量的 Ｈ Ｖ Ｃ ， 可 Ｕ Ｅ ｓ在细胞形态 、 面抗原标志等方 面具 内皮细胞特 征 ， 以用于血管 内皮细 表 可
关键词 ： 脐静脉 内皮细胞 ； 细胞培养 ； 抗原 表达
中图分类号： Ｑ １． 文献标志码： Ａ 文章编号 ： １０ ８３１ ０ ７—６ １ （０ ２ ０ ０ ７ ６ １ ２ １ ） ６— ４ ６—０ Ｄ Ｉ１ ．９９ Ｊ ＩＳ ．０ ７—６ １ ．０ ２ ０ ．２ ３ Ｏ ：０ ３ ６／ ．Ｓ Ｎ １０ ６ １２ １．６ ０ ３
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微血管内皮细胞的体外分离培养方法概述
微血管内皮细胞的体外分离培养方法概述微血管内皮细胞的体外分离培养方法概述＊段慧琴1，张永东2，穆祥1*(1.北京农学院动科系，北京102206；2.北京农业职业学院，北京102442)摘要：微血管内皮细胞在许多病理生理过程中起着关键性的作用。
应用体外培养的微血管内皮细胞，不仅广泛应用于微循环系统对不同生理或病理刺激的反应，也可阐明伴随微血管功能障碍和组织损伤的某些疾病的病理机制，所以分离培养动物及人各个器官组织微血管内皮细胞的报道日渐增多。
微血管内皮细胞分离方法主要有3种，包括酶消化法、机械分离法和磁珠分离法，每种方法各有利弊。
微血管内皮细胞一般通过其表面的血管紧张素酶、摄取乙酰基低密度脂蛋白和表达Ⅷ因子相关抗原进行鉴定。
目前从不同组织器官分离培养微血管内皮细胞的方法已经比较成熟。
关键词：微血管内皮细胞；体外；分离培养从1973年Jaffe E A等成功培养人的脐静脉内皮细胞至今，血管内皮细胞的研究已经取得了重要的进展，极大地丰富了人们对血管内皮细胞的认识。
研究资料已经证实，动脉起源的内皮细胞不同于静脉起源的内皮细胞，微血管内皮细胞不同于大血管的内皮细胞[1]，并且不同器官组织起源的血管内皮细胞也表现出不同的功能特性。
微血管内皮细胞所表现的组织器官特异性，使人们认识到微血管内皮细胞研究的重要性。
因此，研究发生于某一器官或组织的微血管病变，应该采用这一器官或组织的微血管内皮细胞作为细胞模型。
因此，微血管内皮细胞的培养技术越来越受到人们的重视，已经成为医学研究中不可缺少的重要手段。
但是，由于微血管内皮细胞的培养难度较大，研究成本较高，因而它的普及和应用都受到一定的限制。
近年来，内皮细胞生长因子的应用和免疫磁珠技术的发展，使微血管内皮细胞的培养和纯化变得相对简化，加之许多微血管内皮细胞系的建立，使得微血管内皮细胞的研究及应用得到迅速发展。
1微血管内皮细胞体外培养状况到目前为止，人体主要器官和组织的微血管内皮细胞已经培养成功。
人脐静脉血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定
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比较两种酶的消化效果。收集细胞并用含有 １０ ｎｇ／ｍＬ 的 ＶＥＧＦ 的培养基中培养， 观察细胞的生长及传代。并在倒
置显微镜下观察细胞的形态学特点， 同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。用流式细胞术观察细胞周
期。结果 两种消化酶方法均获得了相当数量的人脐静脉内皮细胞， 胶原酶Ⅱ的消化效果稍优于混合消化酶， 且比
较理想的消化时间均为 １３ ｍｉｎ， 细胞接种后 ４～５ ｈ 开始贴壁生长， １ 周左右可生长成单层， 光镜下呈多角形 ， “铺
路石”样排列， 免疫组织化学法可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。细胞周期显示约有 ５０．６％
的细胞处于 Ｇ０／Ｇ１ 期。结论 胶原酶Ⅱ和胶原酶Ⅰ与胰酶等比混合消化液灌注法是获得脐静脉内皮细胞的一种可 取方法， 而胶原酶是分离培养脐静脉内皮细胞的首选消化液， 成功率高， 可靠性大， 可成功构建体外研究血管内皮
ＱＩＮ Ｍｉｎｇ－ ｃｈｕｎ， ＷＡＮＧ Ｒｕｏ－ ｇｕａｎｇ， ＱＩＮ Ｌｉ－ ｈｕａ， ＬＩＵ Ｘｉａｏ－ ｌｉ， ＬＩ Ｃｈｕｎ－ ｍｅｉ， ＬＩＵ Ｈｕｉ－ ｐｉｎｇ， ＹＥ Ｚａｎ
（ＴＣＭ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｕｎａｎ， Ｃｈａｎｇｓｈａ， Ｈｕｎａｎ ４１０００７， Ｃｈｉｎａ）
〔收稿日期〕２００６－ １２－ ２６ 〔基金项目〕国家自然科学基金（ ３０４７２２２７， ３００００２２５） 。 〔作者简介〕秦明春（ １９７９－ ） ， 男， 硕士， 主要从事妊娠病临床及基础研究工作。 〔通讯作者〕＊ 王若光， 男， 教授， 博士后， Ｔｅｌ： ０７３１－ ５３８１２９２。
第４期
〔Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ〕ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｉｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ； ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ； ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ； ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ； ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ； ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
血管内皮细胞是位于血管内壁的单层细胞， 通 过产生和分泌许多血管活性物质， 在维持血管舒缩、 抗凝血及血管构建等方面起重要作用， 同时由于其 特殊的解剖学部位使内皮细胞能敏感地感知血流、 压力、炎症信号以及血液循环中激素水平的变化， 通 过一系列的信号转导过程与邻近及远处的细胞相互 联系， 对各种刺激作出反应， 维持机体内外环境的稳 定。内皮细胞的体外培养是研究内皮细胞生物学与 多种疾病关系的重要方法。新生儿脐带由于取材方 便， 来源充足， 而成为血管内皮细胞体外实验的主要 材料。本文利用健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐 带， 采用改进的灌注消化法， 运用不同的消化酶成功 分离了人脐静脉内皮细胞， 并用免疫组织化学法进 行了鉴定， 从而为构建体外研究血管内皮细胞的模 型及进一步实验研究打下了基础。
秦明春， 等 人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定
１３
ｇｅｎｅｎａｓｅⅡ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅⅠｉｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｇａｉｎ ＥＣｓ， ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎｅｎａｓｅ ｉｓ ｔｈｅ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｆｌｕｉｄ ｆｏｒ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｈｏｉｃｅ， ａｎｄ ｃａｎ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ＥＣｓ．
１４
湖南中医药大学学报
２００７ 年第 ２７ 卷
１ 材料与方法
１．１ 材料 １．１．１ 标本来源与采集 标本均来自于湖南中医药 大学第一附属医院妇产科正常足月妊娠娩出的新生 儿脐带。于无菌条件下剪下脐带（ 至少 ２０ ｃｍ） 放入 装有培养基的无菌容器中， 快速移入实验室， １ ｈ 内 行脐静脉内皮细胞的分离培养。 １．１．２ 试剂 ＰＲＭＩ－ １６４０ 培养基、类标准胎牛血清 （ Ｈｙｃｌｏｎｅ）； Ｌ－ 谷氨酰胺（ Ｓｉｇｍａ 公司） ； ＶＥＧＦ（ Ｓｉｇｍａ 公 司） ； 胰蛋白酶（ Ａｍｒｅｓｃｏ 公司） ； 胶原酶Ⅰ、Ⅱ（ Ｇｉｂｃｏ 公司） ； 兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试 剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）； 青－ 链霉素 （ Ｇｉｂｃｏ 公司） ； 其它试剂均为国产分析纯。 １．１．３ 仪器 水套式 ＣＯ２ 培养箱 （ ２３００ 型， ＳＨＥＬ－ ＬＡＢ） ； 超 净 工 作 台 （ ＳＷ－ ＣＪ－ ＩＦ， 苏 州 安 泰 空 气 技 术 公 司 ） ； 台 式 多 管 自 动 平 衡 离 心 机 （ ＴＤＺ５－ ＷＳ， 长 沙 平凡仪器仪表有限公司） ； 倒置显微镜（ ＸＤ－ １０１ 型， 南京江南光电股份有限公司） ； 制冰机（ ＡＦ１００ 型， 斯 科茨曼公司） ； 超纯水仪 （ Ｍａｘｉｍａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＥＬＧＡ 公司） ； 电热重蒸水器 （ ＺＬＳＣ， 上海申安医疗器械 厂） ； 座式自控电热压力蒸气灭菌器（ＺＤＸ－ ３５ 型， 上
〔摘要〕目的 探讨人脐静脉内皮细胞的原代培养方法， 提高体外分离培养血管内皮细胞的成功率。建立血管
内皮细胞培养模型， 为体外研究血管内皮细胞提供实验基础。方法 取 ２ 根脐带（ 至少 ２０ ｃｍ） 冲净淤血， 采用加工
穿刺针固定脐静脉灌注消化液， 一根用 ０．２％胶原酶Ⅱ， 另一根用 ０．１％胶原酶Ⅰ和 ０．２５％胰酶等比混合消化液，
细胞的模型。
〔关 键 词 〕人脐静脉内皮细胞； 细胞培养； 流式细胞术； 细胞周期； 分离； 鉴定
〔中 图 分 类 号 〕Ｒ４５８．８
〔文 献 标 识 码 〕Ａ
〔文章编号〕１０００－ ５６３３（２００７）０４－ ００１２ｉｎ ｖｉｔｒ ｏ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒ ｏｍ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ
１２ ·基础研究·
湖南中医药大学学报 Ｊ ｏｕｒ ｎａｌ ｏｆ ＴＣＭ Ｕｎｉｖ． ｏｆ Ｈｕｎａｎ
２００７ 年 ８ 月第 ２７ 卷第 ４ 期 Ａｕｇ． ２００７ Ｖｏｌ． ２７ Ｎｏ． ４
人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定
秦明春 １， 王若光 ２＊， 秦莉花 １， 刘小丽 １， 李春梅 ２， 刘惠萍 １， 叶 赞 １ （ １．湖南中医药大学 ２００４ 级硕士研究生班， 湖南 长沙 ４１０００７； ２．湖南中医药大学中西医结合学院， 湖南 长沙 ４１０００７）
〔Ａｂｓｔｒ ａｃｔ〕Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅ－ ｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ（ＥＣｓ） ｆｒｏｍ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ， ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｓｕｃｃｅｓｓ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ＥＣｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ， ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ＥＣｓ， ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒｅ－ ｓｅａｒｃｈ ｏｆ ＥＣｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄｓ， ２０ ｃｍ ｌｏｎｇ， ｗｅｒｅ ｆｉｘｅｄ ａｎｄ ｆｉｌｌｅｄ ｔｈｅ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｆｌｕｉｄｓ， ０．２％ ｃｏｌｌａｇｅｎｅｎａｓｅ Ⅱ ｉｎ ｏｎｅ ｃｏｒｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｅｎｚｙｍｅ ｏｆ ０．２５％ ｔｒｙｐｓｉｎ ａｎｄ ０．１％ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅⅠｉｎ ａｎ ｏｔｈｅｒ， ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ． Ａｌｌ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｆｌｕｉｄ ｗｉｔｈ １０ ｍｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ， ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｃｒｅａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ， ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ＥＣｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｗｉｔｈ ｌｉｇｈｔ ｍｉ－ ｃｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｕｎｄｅｒ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ， ａｎｄ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｅｎｏｕｇｈ ＥＣｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｂｏｔｈ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｌｉｑｕｉｄｓ， ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅ－ ｎｅｎａｓｅ Ⅱ ｗａｓ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｅｎｚｙｍｅ， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｉｇｅｓｔｉｎｇ ｔｉｍｅ ｗａｓ １３ ｍｉｎｕｔｅｓ． ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｇｒｅｗ ｏｎ ｔｈｅ ｗａｌｌ ａｐｐｅａｒｅｄ ａｆｔｅｒ ４－ ５ ｈｏｕｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｆｏｒｍｅｄ ａｆｔｅｒ ｏｎｅ ｗｅｅｋ． Ⅷ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ＥＣｓ ｓｈｏｗｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ５０．６％ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ａｔ ｓｔａｇｅ ｏｆ Ｇ０／Ｇ１． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｏｌｌａ－
海申安医疗器械厂）； 电子分析天平（ ＡＢ２０４Ｎ 型， 梅 特 勒 － 托 力 多 有 限 公 司 ） ； 流 式 细 胞 仪 （ ＢＥＣＴＯＮ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ） 。 １．２ 方法 １．２．１ 人脐静脉内皮细胞的原代分离及培养 将取 来的脐带迅速移入洁净操作台内， 无菌条件下将其 放入提前盛有预热 ＰＢＳ 培养皿中， 剪去有钳夹痕及 血肿的部分， 挤出脐带中的血， 用剪刀修齐两断面， 分成 ２０ ｃｍ 的一段。找出脐静脉（ ２ 根管腔较细的是 脐动脉， １ 根管腔较粗的是脐静脉） ， 用带平针头的 注射器从一端插入脐静脉， 血管钳固定， 再用预热的 ＰＢＳ 冲洗 ３ 次以上， 将血迹完全冲洗干净。为防止脐 动脉残留的血液混入， 可将动脉分离少许用消毒线 结扎， 用止血钳钳夹另一端。从冲洗的针头中注入 ０．１％胶原酶Ⅱ使其充盈， 另一条以同样的方法注入 ０．１％胶原酶Ⅰ和 ０．２５％胰酶等比混合消化液。取出 针头， 用止血钳夹住注入端， 移入无菌烧杯中， 置于 ３７ ℃培养箱中孵育 １３ ｍｉｎ。取出， 松开注入端的血 管 钳 ， 收 集 脐 静 脉 内 的 消 化 液 ， 然 后 注 入 含 １０％胎 牛血清的 ＲＰＭＩ－ １６４０ 培养液再次冲洗管腔， 将消化 液与冲洗液一并收集于离心管， １ ０００ ｒ／ｍｉｎ， 离心 ５ ｍｉｎ， 弃上清， 加入 ＲＰＭＩ－ １６４０ 完全培养液 （ 含 ２０％ 胎牛血清， １０ ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ。Ｌ－ 谷氨酰胺 ２ ｍｍｏＬ／Ｌ， 青 霉 素 １００ Ｕ／ｍＬ，链 霉 素 １００ ｍｇ／ｍＬ） ，用 巴 氏 吸 管 轻轻吹打均匀， 按 １×１０６ 个接种于培养瓶， 置于 ５％ ＣＯ２， ３７ ℃培 养 箱 中 培 养 ， ２４ ｈ 后 更 换 培 养 液 去 除 未贴壁的细胞， 然后每隔 ２４ ｈ 半定量换液 １ 次至细 胞生长铺满瓶底。 １．２．２ 人脐静脉内皮细胞的传代培养 待细胞生长 融合成单层细胞后， 弃去培养液， 加入 ０．１２５％胰 蛋 白酶／０．０２％ ＥＤＴＡ 混合消化液 ２～３ ｍＬ， 倒置显微 镜下观察， 当细胞回缩变圆后弃去消化液， 加入 ＲＰ－ ＭＩ－ １６４０ 完全培养液 ５～１０ ｍＬ 终止消化， 用巴氏吸 管吹打制成细胞悬液， 按 １∶２ 或 １∶３ 比例将细胞悬液 接种于培养瓶中， 置于培养箱中培养。 １．２．３ 人脐静脉内皮细胞的形态学观察及鉴定 细 胞换液后直接在倒置显微镜下观察细胞的形态及生