细菌单染色法及口腔微生物的观察知识分享
口腔微生物观察方法涂片
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口腔微生物群
细菌
真菌
病毒
原虫
目前有关口腔微生物分布的研究主要是细菌，其次 是真菌，对病毒、支原体和原虫等口腔微生物分布的 文献鲜见。
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来源:父母或亲密接触的人
研究者们在剖腹产的新生儿口腔 中未检查出细菌，由此认为人出生 时口腔一般是无菌的。
在一项出生 1～2 天的新生儿口腔菌群调查中发现，在 新生儿口腔中检出与母亲口腔中相同血清型的唾液链球 菌 。 一项对父子（女）或母子（女）口腔内中间普雷沃 菌的检测，也发现了相同血清型的中间普雷沃菌在父子 （女）或母子（女）口腔中存在。
实验四
一. 真菌形态观察 二. 口腔微生物观察 三. 牙菌斑生物膜检测
一、真菌形态观察 （一）目的
观察单细胞和多细胞真菌形态
多细胞真菌 单细胞真菌
（二）材料
1.菌种 单细胞真菌-酵母菌 多细胞真菌-曲霉示教片（4张/班） 霉菌平板
2.染液 石碳酸复红（ 革兰染液之复染液）
3.其他 盖玻片、透明胶带、载玻片、酒精灯等
提高刷牙效果。
播放牙刷选择及正确刷牙方法视屏
下周实验内容
病毒的接种技术 实验考试
3.牙菌斑生物膜的形成和发展分3个阶段 （2）细菌的黏附
细菌黏附和共聚是牙菌斑形成和成熟的 必要条件。
黏附是一个复杂的过程，机制尚未完全清楚。 如：钙桥作用、氢键作用、疏水作用和受体粘附素作用等等。
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3.牙菌斑生物膜的形成和发展分3个阶段
（3）牙菌斑的成熟
成熟是一个动态变化过程。 菌斑成熟的重要特征是细菌组成的变异性大。 成熟过程中细菌的组成和比例，菌斑的结构都在不 断变化，以适应环境的改变，最终发育成熟。早期 菌斑结构疏松，兼性厌氧菌为主，随后逐渐致密， 后期厌氧菌多。12小时可由菌斑染色剂显示，9天形 成各种细菌的复杂生态群体，10~30 天菌斑发育成 熟达到高峰。
微生物学实验-1 口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色共38页
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使染色观察与显微镜油镜的
使用;细菌的革兰氏染色
26、机遇对于有准备的头脑有特别的 亲和力 。 27、自信是人格的核心。
28、目标的坚定是性格中最必要的力 量泉源 之一， 也是成 功的利 器之一 。没有 它，天 才也会 在矛盾 无定的 迷径中 ，徒劳 无功。- -查士 德斐尔 爵士。 29、困难就是机遇。--温斯顿．丘吉 尔。 30、我奋斗，所以我快乐。--格林斯 潘。
实验1显微镜油镜的使用、细菌单染色法及细菌芽孢观察（09下）
实验1显微镜油镜的使用、细菌单染色法及细菌芽孢观察（09下）实验1 显微镜油镜的使用、细菌单染色法及细菌芽孢观察(09下)A.显微镜油镜的使用一、实验目的和内容目的：复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。
内容：1．学习油浸系物镜的使用方法。
2．用油镜观察枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片。
二、实验材料和用具枯草芽孢杆菌(Bacillus subitilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的染色装片。
香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸。
三、操作步骤(一)观察前的准备1．将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为4cm。
坐正，练习用左眼观察。
2．调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm左右。
转动反光镜采集光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。
观察染色装片时，光线宜强；观察末染色装片时，光线不宜太强。
(二)低倍镜观察染色装片首先上升镜简，将枯草芽孢杆菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片0.5cm处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升(或使镜台下降)至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。
移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。
(三)高倍镜观察眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相懂。
再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。
用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。
将最适宜观察部位移至视野中心，绘图。
不要移动装片位置，准备用油镜观察。
(四)油镜观察1．提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。
在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方)滴一滴香柏油。
2．从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。
实验二细菌的观察
细菌一般形态染色观察一、实验目的学习了解微生物染色的基本原理与方法学习掌握细菌的简单染色和革兰氏鉴别染色技术巩固显微镜油镜的使用方法。
二、实验原理细菌的个体极微小，无色透明，必须借助于染色法，使细菌（或背景）着色，与背景（或菌体）形成明显的对比便于在显微镜下观察细菌的形态构造。
染色方法主要有：见下图简单染色法简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用染料有：碱性染料：结晶紫、碱性复红、龙胆紫、番红、中性红、孔雀绿等。
酸性染料：酸性复红、刚果红、曙红等简单染色一般常用碱性染料进行染色原因：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，带正电荷，因此碱性染料很容易与细菌结合使细菌着色细菌细胞壁含有蛋白质或多肽，也就有等电点已知细菌的等电点pH为2～5。
革兰氏阳性菌为2～3，革兰氏阴性菌为4～5。
当细菌的培养液pH值大于等电点时，细菌带有负电荷；反之，带有正电荷。
一般，细菌的培养、染色、试验过程均在偏碱性（7～7.5）、中性、偏酸性（6～7）条件下，都高于细菌的等电点，故均带有负电荷革兰氏染色革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法，根据细菌对这种染色反应的不同，可分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两大类，其机理是由于细菌细胞壁的化学组成及结构不同和通透性不同的缘故。
革兰氏染色对于细菌的分类、鉴定及食品卫生检测都有重要意义。
革兰氏染色原理影响革兰氏染色结果的因素菌龄培养基pH值染色技术：涂片质量、染色时间、脱色时间、染色脱色均匀度等三、实验器材1. 器材：显微镜，擦镜纸，二甲苯，香柏油，载玻片，接种环，酒精灯,火柴，吸水纸，无菌牙签。
2. 染色液及试剂：石碳酸复红染液、碱性美蓝染液、结晶紫染色液，路戈氏碘液，95％的酒精，蕃红染色液，黑色素水溶液，蒸馏水。
3. 菌种：白葡萄球菌、大肠杆菌的新鲜斜面菌种各1支。
四、操作步骤（一）简单染色涂片火焰固定染色水洗干燥镜检（二）革兰氏染色涂片→干燥→火焰固定结晶紫染色→水洗碘液媒染95%酒精脱色→水洗蕃红复染→水洗干燥镜检（三）口腔中微生物观察负染色五、实验报告1、实验结果绘图2、思考题（1）细菌制片过程应注意哪些？（2）试分析菌龄、培养pH、染色技术对革兰氏染色结果的影响。
微生物学实验-1 口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色剖析共38页
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
微生物学实验-1 口腔微生物的染色观
察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏
染色剖析
11、用道德的示范来造就一个人，显然比用法律来约束他更有价值。—— 希腊
12、法律是无私的，对谁都一视同仁。在每件事上，她都不徇私情。—— 托马斯
13、公正的法律限制不了好的自由，因为好人不会去做法律不允许的事 情。——弗劳德
14、法律是为了保护无辜而制定的。——爱略特 15、像房子一样，法律和法律都是相互依存的。——伯克
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
口腔微生物知识点整理
牙菌斑生物膜掌握：牙菌斑的定义、牙菌斑的基本结构、牙菌斑的形成和发育。
了解：牙菌斑的分类、牙菌斑的组成、牙菌斑的物质代谢、牙菌斑的致病性牙菌斑 (dental plaque)：存在于牙面或牙周袋内的一个细菌生态环境，细菌在其中生长、发育和衰亡，并进行着复杂的物质代谢活动，在一定条件下，细菌及其代谢产物将会对牙齿和牙周组织产生破坏。
生物膜（biofilm）：各种细菌嵌于来自其自身和/ 或外界环境的胞外基质内，而在固相界面上结成的有着三维立体结构的微生态环境，牙菌斑就是一种经典的生物膜。
牙菌斑生物膜：牙菌斑生物膜是牙面上或牙周袋内的多种菌丛构成的生态系。
细菌在内生长、发育和衰亡。
其复杂的结构使它能包涵对氧不同敏感性的细菌，这些细菌嵌入在由多糖、蛋白质和矿物质组成的基质中。
细菌在其中的代谢活动，影响着细菌与宿主之间或细菌菌属之间的动态平衡生物膜的作用① 节制细菌代谢活性和保护菌丛抵抗口腔苛刻环境，使细菌在不适合的条件中仍能存留。
② 膜内的多聚物基质起约束网络作用，摄取和收藏食物，控制基质成分的移动速度。
③膜内高水平的巯基能中和氧基，保护菌细胞勉受氧化损伤。
④ 浓缩从环境中来的营养物质和其它元素，保留一些细胞内遗漏出来的溶解物质（如 eDNA）。
⑤细菌耐药性二、分类（一）根据所在部位分类龈缘为界 : 龈上菌斑、龈下菌斑：附着菌斑，非附着菌斑。
1．龈上菌斑（ supragingival plaque）位于牙颈部龈缘以上牙面上的菌斑。
包括窝沟菌斑、光滑面菌斑、邻面菌斑、颈缘菌斑。
这种菌斑的结构比较完整，主要细菌是革兰阳性球菌、杆菌。
随着菌斑成熟，革兰阴性球菌、杆菌和丝状菌的数量增多。
2．龈下菌斑 (subgingival plaque)位于龈缘以下，分布在龈沟或牙周袋内，分为附着龈下菌斑和非附着龈下菌斑。
附着龈下菌斑由龈上菌斑延伸到牙周袋内，附着于牙根面，其结构、成分与龈上菌斑相似，细菌种类增多，主要为格兰阳性球菌及杆菌、丝状菌，还可见少量格兰阴性短杆菌和螺旋体非附着龈下菌斑位于附着龈下菌斑的表面，为结构较松散的菌群，直接与龈沟上皮和袋内上皮接触，主要为格兰阴性厌氧菌，还包括许多能动菌和螺旋体。
实验三、细菌简单染色和运动性观察-精选文档
载玻片无油迹；滴蒸馏水不要太多；涂片要涂抹均匀
❖ 2.干燥 室温自然干燥
❖ 3.固定 涂面朝上，通过火焰2-3次，热固定温度不宜过高，以免 改变或破坏细胞形态。
❖ 4.染色 滴加石炭酸复红染液于涂片上，染色约1-2分钟
❖ 5.水洗 用自来水冲洗，直至涂片上流下的水为无色为止。
不要直接冲洗涂面，使水从载玻片的一端流下。水流不宜过大， 以免涂片薄膜脱落
❖ 6.干燥 自然干燥或用吸水纸吸干
❖ 7.镜检 涂片必须完全干燥后才能用油镜观察
结果要画出形态图
（二）细菌运动性的观察
压滴法
❖ （1）制片 加水——挑菌液——加一滴0.01%的美蓝水溶液——加盖玻片
❖ （2）镜检 先用低倍镜找标本，再用高倍镜观察。 也可用油镜观察。 观察时要用略暗光线。
二、器材
1.菌种 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus) 苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）
2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ染色剂：石炭酸复红染液
3.仪器及其他用具 显微镜 酒精灯 载玻片 接种环 双层瓶 擦镜纸 蒸馏水
三、操作步骤
（一）细菌的简单染色
❖ 1.涂片 取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种
细菌染色和涂片观察的方法
细菌染色和涂片观察的方法细菌的染色和涂片观察是微生物学中非常重要的实验方法，可以帮助我们识别和研究细菌的形态、结构和特征。
下面将详细介绍细菌染色和涂片观察的方法。
一、细菌染色方法：1.革兰氏染色法：革兰氏染色法是细菌染色中最常用的方法之一、通过该方法，细菌可以被分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
步骤：(1)取一块玻璃片，将细菌涂布于玻璃片上。
(2)用火炬预热玻璃片，使玻璃片夹持菌液返燃。
(3)在火焰中反复将菌液加热，使其彻底干燥。
(4)将干燥的玻片放在青霉素醛固定液中，固定细菌片。
(5)用生理盐水将玻璃片在微生物操作台上反复冲洗，去除青霉素醛固定液。
(6)将玻璃片放在碘酒液中浸泡3-5分钟，使菌液变成深度蓝黑色。
(7)洗净玻片，以去除碘酒液。
(8)将玻片放入95%乙醇中，进行除膜操作，1-2秒钟后取出。
(9)玻片反复在试管中加乙醇，直至洗涤液基本为无色，然后将玻片放入流动水中漂洗。
(10)用草绿素溶液染色，将玻片浸泡5分钟。
(11)用水漂洗片面，直至玻片颜色基本不变。
(12)用纤维纸轻轻拍去多余的水分，放在显微镜载物玻片上中间，覆盖一层玻璃标本纸，压平，尽量避免产生气泡。
(13)利用显微镜观察染色结果，革兰氏阳性菌为紫色或紫蓝色，革兰氏阴性菌为粉红色。
2.肥湖水染色法：肥湖水染色法也是常用的细菌染色法之一，可以用来观察鞭毛、纤毛等细菌结构。
步骤：(1)取一块玻璃片，将细菌涂布于玻璃片上。
(2)用火焰热熔玻璃片，使其保持与菌液接触状态，避免菌液干燥。
(3)将玻璃片放在肥湖水溶液中浸泡2-3分钟。
(4)用生理盐水将玻璃片反复冲洗，去除肥湖水溶液。
(5)用希森润湿法将玻璃片上覆盖一层希森润湿剂。
(6)利用显微镜观察染色结果，鞭毛呈现鲜绿色，纤毛呈现暗蓝色。
二、涂片观察方法：1.涂片制备：涂片制备是观察细菌形态和结构最常用的方法之一、涂片制备的步骤如下：(1)在无菌条件下，将细菌涂布于玻璃片上。
(2)用火焰或紫外线灭菌，使其迅速晾干。
微生物常用染色法知识分享
朱葵向
细菌染色的一般程序
涂片(干燥)---固定---染色---脱色---复染
涂片制备
血液,分泌物,排泄物,穿刺液和液体培养物,直接 在载玻上作薄涂片. 固体培养基上的菌落或菌 苔的制片,用接种环取1 环9g/L氯化钠溶液置载 玻片中央.再用无菌接种环取少量的培养物在 氯化钠溶液中磨匀,涂成人1CM*1CM大小的涂 面细菌蛋白及结构,便于染色.避 免在水洗过程中被水冲掉. 通常用火焰加热固 定,将涂片在火焰中迅速通过3次,以手背皮肤接 触玻片不烫为佳.
染色
根据检验目的不同,选择不同染色方法进行染 色.染色时滴加染色液以覆盖涂面为佳，染色 时间则随时间而定
媒染
使染料固定于被染物引起细胞膜通透性改变. 常用明矾,鞣酸,金属盐和碘作为媒染
染色原理
抗酸性染色细菌与细胞壁成分有关.分枝杆菌 细胞壁含脂质较多,其中主要成分是分枝菌酸. 决定抗酸性染色反应,用乙醚脱去分 分枝菌酸,则呈非抗酸染色性.
性为红色.
BASO革兰染液
抗酸染色
萋__纳抗酸染色法步骤:
细菌涂片经火焰固定,加石碳酸复红溶液,加热至 有蒸气出现,切不可沸腾.染液因蒸发减少时,应随时补充,防止染
液蒸干 .持续5 min,水洗,甩干.
滴加3%盐酸乙醇脱色,不时摇动玻片至红色脱落 为止,水洗,甩干.
加吕氏美蓝复染液数滴复染1min,水洗.
– 复染色法 用两种或以上的不同颜色的染料进行 染色，可将不同细菌或同一细菌的不同结构染成 不同颜色
革兰染色
– 细菌涂片经火焰固定,加结晶紫染液1min,清水冲去染液. – 加碘液媒染1min,水洗,甩干. – 用95%乙醇脱色,轻轻摇动约30S,至无紫色洗落为止,水洗,
微生物学实验指导-华南师范大学生命科学学院
温度低于饱和蒸气的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见（表 2—3）
温度/℃
时间/h
干热
4
130-140
湿热 105.3
3
表 2-2 干热温热穿透力及灭菌效果比较
透过布层的温度/℃
灭菌
20 层
10 层
100 层
86
72
70.5
不完全
101
101
101
完全
表 2—3 灭菌锅留有不同分量空气时，压力与温度的关系
自控高压蒸气灭菌锅（autoclave）的使用可参照厂家说明书。
图 2—2A 卧式灭菌锅
图 2—2B 手提式灭菌锅
1. 安全阀; 2.压力表; 3.放气阀; 4.软管; 5.紧固螺栓; 6.灭菌桶; 7. 筛架; 8.水
（三）器材 牛肉膏蛋白胨培养基，培养皿(6 套一包)，手提式高压蒸气灭菌锅等。 （四）操作步骤 1．首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。 切勿忘记加水，同时水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。 2．放回内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭 菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。 3．加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧 相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。 4．用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气 完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加到逐渐上升。当锅内压力升到所需 压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用 0.1Mpa，121.5℃，20min 灭菌。 灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀， 维持所需压力。 5．灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的 压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。 压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降， 使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生 污染，甚至灼伤操作者。 6．将取出的灭菌培养基，需摆斜面的则摆成斜面，然后放入 37℃温箱培养 24h，经检 查若无杂菌生长，即可待用。 （五）实验报告 l．结果
实验三 细菌染色法及微生物的观察
方法三 （1）将培养48-60小时左右的巨大芽孢杆菌，作涂片、干
燥、固定。 （2）将固定好的涂片装入装片架，置于染色缸中的孔雀绿
染液中。 （3）沸水浴加热染液,近沸腾时开始计时约10—15分钟。 （4）取出涂片，待冷却后，水洗，至孔雀绿不再褪色为止。 （5）用番红染液复染1分钟，水洗。 （6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。
4.2 染色 （1）初染：于制片上滴加结晶紫染液，染1min后，用水
洗去剩余染料。 （2）滴加卢戈氏碘液，1min后水洗： （3）滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱
退为止(根据涂片之厚薄需时30s)。 （4）复染 滴加石炭酸复红液复染1min，水洗。 （5）用滤纸吸干，油镜镜检。
图 革兰氏染色方法
染色
3.4 革兰染色结果
革兰氏染色阴性
革兰氏染色阳性
4. 芽孢染色实验原理
• 芽孢：芽孢又叫内生孢子，是某些细菌生长到一定阶段 （环境中缺乏营养及有害代谢产物积累过多时），在细 胞内形成一个圆形或椭圆形厚壁、含水量极低、抗逆性 极强的休眠体。
• 芽孢的存在和特点是细菌分类与鉴定的重要形态学指标； • 是衡量各种消毒灭菌手段的重要指标。
实验三 细菌染色法及微生物的观察
简单染色法 正染色
鉴别染色法
革兰氏染色法 抗酸性染色法
芽孢染色法
死菌
姬姆萨染色法
细菌染色法
负染色：荚膜染色法等
活菌: 用美蓝或TTC（氯化三苯基四唑） 等作活菌染色
目的：巩固无菌操作技求，掌握细菌及其结构的 染色技术。
内容： 1、学习细菌单染色操作技术。 2、学习革兰氏染色技术。 3、学习芽孢染色技术。
实验一 细菌的简单染色和细菌形态的观察
实验一 细菌的简单染色和细菌形态的观察一、实验原理简单染色采用一种染料对菌体进行染色，常用结晶紫、美蓝、碳酸复红等碱性染料。
染色后，菌体与背景形成鲜明对比，在显微镜下很容易被识别。
通过简单染色方法可以观察细菌的菌体形态特征和菌体的排列方式。
观察菌体形态 简单染色（只用一种染料） 观察菌体排列方式染色方法 革兰氏染色鉴别鉴别染色 抗酸性染色（利用两种染料） 芽孢染色观察特殊结构 荚膜染色鞭毛染色二、实验步骤：涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检三、思考题1、制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节？答；（1）涂片：开始所加无菌水液滴不要太大，否则不易干燥；取菌量要适宜且要涂抹均匀，避免过大造成堆积，而难以看清细胞个体形态同时也应避免取菌量太少而难以在显微镜视野中找到细胞。
（2）无菌操作取菌：一定要等接种换冷却后再取菌，以免高温使菌体变形；（3）干燥固定：干燥后加热固定，可避免加热时间过长，否则细胞会破裂或变形；（4）固定：菌膜一面朝上，通过酒精灯微火三次。
注意温度不宜过高，时间不宜太长，否则菌体形态则会发生改变。
（5）水洗：倾去染色液后，用水沿着菌膜四周冲洗，注意勿使水流直接冲洗菌膜部位，水流不宜过急，过大，至流出水无色为止；2、为什么要求制片完全干燥才能用油镜观察？答：使用油镜时，物镜与标本间的介质为香柏油（N=1.515），不仅增加了透明度，而且会提高了分辨率。
若制片不完全干燥后，就用油镜观察，则N 会减小，分辨率D 也会变小。
而且还会造成油水两相不互溶，所以制片要求完全干燥后才能用油镜观察。
3、如果涂片未经加热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高，时间太长，又会怎样呢？答：加热固定的作用是使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细胞形态，而且还可增加细胞对染料亲和力。
（1）如果图涂片未经加热固定，则细胞无法固定在载玻片上，在染色水洗后会被水流冲走。
（2）如果加热温度过高，时间太长，则会使细菌形态发生变化甚至破裂。
实验三细菌的简单染色与形态观察
实验三细菌的简单染色与形态观察一、目的要求：1.了解并掌握细菌简单染色的机理及技术；2.学会用油镜观察细菌细胞的形态。
二、实验材料：1.菌种：枯草杆菌Bacilluubtili、大肠杆菌Echerichiacoli、金黄色葡萄球菌StapHyloccuaureu等培养好的细菌斜面；2.染料：结晶紫3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸。
三、基本原理：染色是细菌学上一个重要而基本的操作技术。
因细菌细胞小而且透明，当把细菌悬浮于水滴内，用光学显微镜时，由于菌体和背景没有显著的明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易识别其结构，所以，用普通光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助于颜色的反衬作用，可以更清楚地观察到细菌的形状及其细胞结构。
用于微生物染色的染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。
发色基团赋予化合物的颜色特征，助色基团则给予化合物能够成盐的性质。
染料通常都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类。
在微生物染色中，碱性染料较常用，如常用的美蓝、结晶紫、碱性复红、沙黄、孔雀绿等都属于碱性染料。
简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
此法操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性和弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料电离后带有正电荷，很容易与菌体结合使细菌着色。
通过本实验，学习和掌握细菌的染色技术，了解细菌细胞的形态，巩固课堂知识，增加感性认识。
四、方法与步骤：（一）制片1.涂片：在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴蒸馏水，用接种环以无菌操作从枯草芽孢杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜，涂布面积约1~1.5cm2。
2.干燥：室温自然干燥3.固定：手执载玻片一端，使涂菌一面向上，通过火焰2~3次。
此操作也称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在玻片上。
细菌单染色法及口腔微生物的观察知识分享
二、实验材料和用具
大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylocosccus aureus)的斜面菌种。
吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、无菌水；
显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签。
三、操作步骤
(一)单染色法
1．涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2(图7—1A、B)。
6．干燥自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体（图7—1F）。
7．待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。
(二)口腔微生物的观察
1．单染色法
(1)在洁净无油腻的载片中央滴一小滴无菌水，用牙签取牙垢少许与水滴充分混匀，涂成薄膜。
(2)将涂片于室温中自然干燥后，按上面单染色法的步骤，进行固定、染色、水洗，干燥后镜检。
2．干燥将涂片于室温中自然干燥。
3．固定手扶载片一端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火2～3次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏(图7—1C)。
4．染色将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min（图7—1D）
5．水洗倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止（图7—1E）。
2．负染色法
(1)在洁净无油腻的载片的一端滴一小滴无菌水，用牙签取牙垢少许与水滴充分混匀，然后加少许黑色素溶液，充分混匀。
(2)另取一载片将其边缘放在含菌载片的一端，然后推向另一端，则含菌载片上的混合液被推成薄膜。
实验一细菌的单染色及油镜的使用
显微镜的放大倍数和分辨率
1.放大倍数：物镜放大倍数×目镜放 大倍数 2. 显微镜的分辨率:是表示显微镜辨 析两点之间距离的能力。可用公式 表示为：
Dቤተ መጻሕፍቲ ባይዱλ/2n·sin(α/2 )
式中D：物镜分辨出物体两点间的最 短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折射率。 ：镜口角（即入射角）。
四、细菌的特殊形态结构
芽孢：休眠体，不利环境下产生，耐受各 种极端环境。
荚膜：多糖，包裹在菌体外围，保护菌体
鞭毛：运动，菌落形态。
精选ppt课件
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枯草杆菌芽孢的观察
精选ppt课件
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细菌鞭毛的观察
精选ppt课件
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细菌荚膜的观察
荚膜
精选ppt课件
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五、实验结果
用油镜观察大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以 及口腔微生物的染色标本，并绘图。
油镜的使用
待后边演示
二、实验原理2
细菌的单染色
细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。利 用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背 景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和 结构。
染色前必须固定细菌，其目的是： 一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。 二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和自然 风干固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。
后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残 留的二甲苯，后将镜体全部复原。
注意：油镜使用完毕后一定要用二甲苯擦拭镜头
三、口腔微生物的观察
1.在洁净无油腻的载片中央滴一小滴无菌水，用牙签取牙垢少许 与水滴充分混匀，涂成薄膜。
2.将涂片于室温中自然干燥后，按单染色法的步骤，进行固定、 染色、水洗，干燥后镜检。
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大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylocosccus aureus)的斜面菌种。
吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染色液、ห้องสมุดไป่ตู้色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、无菌水；
显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签。
三、操作步骤
(一)单染色法
1．涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2(图7—1A、B)。
载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄。
五、实验报告
(一)绘图
1．单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图。
2．你所观察到的口腔微生物的形态图，并注明使用的染色方法，菌体和背景的颜色。
(二)单染色法和负染色法操作要点。
七、问题和思考
1．涂片在染色前为什么要先进行固定?固定时应注意什么问题?
2．干燥将涂片于室温中自然干燥。
3．固定手扶载片一端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火2～3次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏(图7—1C)。
4．染色将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min（图7—1D）
5．水洗倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止（图7—1E）。
2．负染色法
(1)在洁净无油腻的载片的一端滴一小滴无菌水，用牙签取牙垢少许与水滴充分混匀，然后加少许黑色素溶液，充分混匀。
(2)另取一载片将其边缘放在含菌载片的一端，然后推向另一端，则含菌载片上的混合液被推成薄膜。
(3)于室温中自然干燥。
(4)镜检：将光线调亮，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察。
四、注意事项
6．干燥自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体（图7—1F）。
7．待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。
(二)口腔微生物的观察
1．单染色法
(1)在洁净无油腻的载片中央滴一小滴无菌水，用牙签取牙垢少许与水滴充分混匀，涂成薄膜。
(2)将涂片于室温中自然干燥后，按上面单染色法的步骤，进行固定、染色、水洗，干燥后镜检。
2．制备染色装片时应注意哪些事项，为什么?制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察?
3．你知道口腔中通常存在哪些微生物吗?如何进行区分?
细菌单染色法及口腔微生物的观察
细菌单染色法及口腔微生物的观察
录入时间:2008-10-21 11:14:57来源：google
一、实验目的和内容
目的：巩固无菌操作技术，掌握细菌的涂片和单染色技术，了解口腔中的微生物及其观察方法。
内容：1.学习细菌单染色操作技术。
2.用单染色法或负染色法观察口腔中的微生物。