菌种的传代、保藏

微生物菌种的使用、保存与管理、验证。 一.制定菌种使用保藏管理程序 （1）做好菌种的来源登记，确保溯源性 清楚. （2）菌种的接收与复活
标准菌种的保藏形式 我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式 包装于熔封的厚玻璃容器中。在这种容器中， 微生物通常与赋形剂共存，由于缺乏生长必须 的环境条件，一般呈休眠状态。
4.取1支（第二代）冷冻保存管转种于平板 和斜面培养基上，平板上的菌种制成冷冻 保存管（第三代）斜面养基适当温度培养 后作为工作用菌种（第三代） 5.将（第三代）菌种冷冻或低温保存，将 生长、转种后的第二代菌种灭菌处理。 6.当工作用用菌种代数小于5时，可直接用 上代工作用菌种转接下代工作用菌（第三 代）可直接 转接第四代，直至四代转为五代。
和培养条件、保藏方法、储存条件及保存 库址等。
3.在操作过程中，必须严格遵守实验室安 全防护措施规程，采取有效预防措施进行 自我保护。 4.为了防止菌种污染或将污染传播到别处， 其他部门的人员未经允许不得进微生物实 验室。所有的意外情况，都必须立即向主 管部门报告以便得到及时解决。 5相关记录 在菌种的使用制备与保藏过程 中，应建立菌种制备、保藏和使用的记录 格式。
分离培养：伊红美兰培养基（EMB平板）
生化反应：IMViC试验结果：＋＋－－ MUG 试验结果：荧光：＋
大肠埃希菌—EMB平板菌落形态
大肠埃希菌—显微镜下菌体形态
大肠埃希菌—电镜下菌体形态
金黄色葡萄球菌
形态特征： G＋球菌、呈单个、成双、短链或排
列呈葡萄串样，无鞭毛、芽胞。
培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，在普通营
养琼脂培养基上形成较大的圆形、光滑、湿润、
隆起、边缘整齐、不透明的菌落。菌落因种不同 而出现不同的色素。在营养肉汤培养基中呈均匀 混浊生长。 分离培养：高盐甘露醇培养基
生化反应：血浆凝固酶试验结果：＋
金黄色葡萄球菌—显微镜下菌体形态
金黄色葡萄球菌—电镜下菌体形 态
沙门菌
形态特征： G-直 杆菌、无芽胞、无荚膜、多具有 周身鞭毛，能运动。有菌毛。
菌种的确认
一.初步鉴定试验 分离培养—菌落形态 革兰染色—菌体染色特性及菌形 生化试验—检测细菌对各种基质的代谢作 用及代谢产物，借以鉴别细菌的种类
二.全面鉴定
血清分型 毒素分析—内毒素和外毒素 基因分型 蛋白组分析 自动化仪器分析（生化，酶学，基因序列等）
铜绿假单胞菌
霉菌各种菌落形态
白色念珠菌
形态特征： G＋、圆形或卵圆形、着色不均匀、
在玉米培养基中可产生假菌丝和厚膜孢子。
培养特性：在玫瑰红钠琼脂培养基上形成灰白色、
表面光滑、带有浓重酵母气味的典型的类酵母菌 落。培养稍久，菌落增大。在改良马丁培养基中 呈沉淀生长。 分离培养：快速显色培养基
白色念珠菌—显色平板的形态
烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧 灼，往返通过三次。 4.右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口 在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种 环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后 再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将
菌种管口移至火焰上方。
5.塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼 脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，照 上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至 琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从 底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面 顶端，使细菌接种在斜面的表面上。 6.取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上 塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰 上烧灼灭菌。 7.将已接种好的细菌管置35～37℃细菌培养 箱培养22 ～24h，霉菌管置23～28℃霉菌 培养箱培养7天。
严格控制菌种的传代
避免频繁购买菌种及复壮等费时、耗力的工作。 1.复溶菌种并转种 按菌种说明书要求复溶所转 菌种并转接于适当的增菌培养基内（为第一代） 2.鉴定菌种后制甘油冷冻管 经菌种特性鉴定后， 挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管 ， 保存管（为第二代）同时挑取纯菌落接斜面，工 作用菌种（为第三代） 3.将第二代保存，第三代以适当温度培养后用于 试验
菌种保藏标签的规范与要求
菌种保藏标签必须规范、清晰，所有保藏 的菌种容器表面均应贴有相应的标签，标 签必须字迹清晰可见，应注明：菌种的名 称，系列号，传代次数，接种时间等。一 旦新一代菌种制备成功，上一代菌种务必 处理掉处理过程应记录。
严格菌种的质量控制，确保菌种的质量 菌种的质量对检验至关重要，对实验式储 备的菌种而言，除了在起始阶段要对菌种 进行纯度和属性确认外，还应对每一次传 代都进行确认的质量控制系统。因为微生 物菌种从上一代传到下一代时，很可能发 生污染或变异，因此每次传代中至少要对 菌种进行形态学观察和革蓝染色检查，必 要时应做菌种鉴定试验，所有被确认受到 污染的菌种应及时销毁，不得用于常规实 验。
如上图，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂 色；斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。 转种完毕的冻存管和使用过的器具应经121℃湿热灭菌30 分钟再作处理。
菌种的保藏
菌种是重要的生物资源，研究和选择良 好的菌种保藏方法具有重要的意义。
一、菌种保藏的目的
菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有 性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不 被污染，以达到便于研究、
沙门菌—血清凝集试验结果
枯草芽孢杆菌
形态特征： G＋直杆菌、多呈链状排列，有鞭毛、有芽胞，
位于菌体中心或次极端，不小于菌体。
培养特性：为需氧或兼性厌氧，营养要求不高，在普通营 养琼脂培养基上形成较大的圆形或不规则的、表面粗糙、 可有皱褶、菌落下面可形成红色色素的灰白色菌落。在营 养肉汤培养基中形成菌膜,很少混浊或不混浊。 分离培养：营养琼脂平板 血琼脂平板
二. 穿刺接种法： 用接种针取细菌少许，从培养基的中央垂 直刺入，接近管底但不接触管底，然后接 种针沿穿刺线原路退出。 主要用于生孢梭菌的传代。 三.液体接种法： 用接种针取菌少许，在试管内壁与液面交 界处的管壁上轻轻研磨，使菌混合于培养 液中。
黑曲霉接种方法：
黑曲霉孢子悬液，可以保存在4℃环境，并应在一个月内 尽快完成转种操作。转种操作应在超净工作台（或相当此 环境）中进行，关闭风机，靠近酒精灯，拧开瓶盖，用无 菌吸管吹吸管内液体，取1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面， 用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7日，培养斜面形 态可参照下图。
铜绿假单胞菌—琼脂平板的形态
铜绿假单胞菌—鞭毛染色形态
生孢梭菌
形态特征： G＋粗大芽胞杆菌、但在陈旧培养物中菌体 革兰染色为阴性 ，芽胞正圆形或卵圆形，直径大于菌体， 位于军体中央或近端，有周身鞭毛，能运动。 培养特性：专性厌氧，但要求不严格。一般培养时不易 形成芽孢，在普通营养琼脂培养基形成不规则菌落。在
培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养 琼脂培养基上可生长，形成圆形、光滑、湿润、 半透明、边缘整齐的菌落。在营养肉汤培养基中 呈均匀混浊生长。
分离培养：沙门菌属志贺菌属琼脂(S.S)琼脂培养 基 生化反应：三糖铁琼脂反应：碱/酸，葡萄糖产 气，H2S阳性
沙门菌—SS平板菌落形态
沙门菌—显微镜下菌体形态
环境
1、洁净工作室：环境洁净度10000级下的局部100级的单向流空气区 域内，全过程必须无菌操作，防止微生物污染。 2、无菌隔离舱
工具
1、接种环 2、接种针 3、接种铲 4、接种钩 5、酒精灯及其他玻璃器械
培养所用器具
1、玻璃器皿：如各种规格培养皿。 2、微生物实验室常用的设备，如高压灭菌锅、恒温培养箱等

生孢梭菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６４９４１］ 大肠埃希菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）４４１０２］ 金黄色葡萄球菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）２６００３］ 沙门菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）５００９４］ 枯草芽孢杆菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）６３５０１］ 白色念珠菌［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００１］ 黑曲霉［ＣＭＣＣ（Ｆ）９８００３］
硫乙醇酸盐流体培养基加琼脂制成的培养基上形成圆形、
光滑、湿润、不透明的菌落。在硫乙醇酸盐流体培养基 中常在其表面形成菌膜。
大肠埃希菌
形态特征： G-直短杆状杆菌、无芽胞、有周身鞭毛，能 运动。有菌毛。
培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养琼脂培养
基上生长良好，形成较大的圆形、光滑、湿润、灰白色的 菌落。在营养肉汤培养基中呈均匀混浊生长。
菌种的传代、保藏 及菌液制备
标准菌种的概念及其管理
标准菌种是指由国家授权机构制备的具有 稳定的生物学特性并用妥善方法保藏的菌 种。 我国的标准菌种统一由中国菌种保藏管理 委员会（CCCCM）管理，涉及药品微生物 检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中单胞菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）１０１０４］
培养基的选择
细菌一般用营养琼脂培养基，特别指
出的是生孢梭菌用硫乙醇酸盐流体培 养基加琼脂制成的培养基进行传代。 真菌一般用改良马丁培养基。
菌种的传代
菌种的复苏
菌种的确认 菌种的接种
菌种的保藏
菌种的复苏
《中国药典》2005版规定，所用标准菌种 的传代次数不得超过5代。 从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为 第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种 后为第1代，直至到第3代为工作菌种。
白色念珠菌—显微镜下菌体形态
黑曲霉
形态特征： 单层和双层瓶梗、孢子头球形
放射状、褐至黑色、孢子梗无色至褐色。
培养特性：在玫瑰红钠琼脂培养基上形成
菌落初为白色羊毛状 ，继而黑色或黑褐色，
粗绒状。
分离培养：快速显色培养基
黑曲霉—显微镜下菌体形态
黑曲霉—电镜下菌体形态
菌种传代的工作环境、工具及其他器皿
枯草芽孢杆—琼脂平板的形态
枯草芽孢杆—显微镜下菌体形态
真菌的初步鉴定试验