基因工程实验讲义

实验一已知序列基因的克隆

【实验目的】

掌握已知序列基因克隆的原理、流程及操作方法，包括目的基因的分离，与载体的连接，重组DNA的转化及重组子的鉴定。

【实验原理】

1973年Cohen等人发明了基因克隆技术，其中一项关键技术是重组DNA技术。该技术是用酶学方法，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割、重新连接，组成新的杂合DNA分子。这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。基因克隆的路线包括以下几个基本程序：1.分离制备待克隆的外源DNA片段；2.外源DNA及载体的限制性酶切；3.将靶DNA片段与载体连接，组装成杂合DNA 分子；4.重组DNA分子转入宿主细胞；5.筛选重组子；6.目的基因的确认和分析。

1．已知序列基因的分离――分

对于已知序列的基因主要采用化学合成和生物化学两种方法合成目的基因。化学法是将要合成DNA片段3’端的第一个核苷酸固定于不溶性的载体上，然后核苷酸开始与另一个核苷酸进行缩合反应，不断重复进行。该方法虽然准确性高，但反应速度慢，且合成的成本高、合成的片段小，所以主要用于合成PCR反应的引物。

而实验室合成已知序列基因的主要方法是聚合酶链式反应（PCR）技术。在四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以寡聚核苷酸为引物及单链DNA为模板，经DNA聚合酶催化合成DNA互补链的过程谓之聚合酶链反应。PCR的基本反应步骤和原理：

（1）变性：将反应系统加热至94℃左右，使模板DNA完全变性成为单链；

（2）退火：将温度下降至50℃左右，使引物与模板DNA退火结合；

（3）延伸：将温度升至72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。

上述三个步骤为一个循环，经25～30次循环后，可将模板DNA扩增达百万倍。

2．目的基因和载体的限制性酶切――切

目的基因定向克隆到质粒载体，首先要将目的基因与载体经过特定的限制酶消化后，形成匹配末端。虽然在基因克隆时，也可采用平末端方式连接，甚至是不匹配末端也可通过一定的处理进行连接，但匹配末端的连接是最有效的，而且连接效率要高于平末端的连接。

限制酶是能特异性结合并切割特殊DNA序列的核酸内切酶。在基因工程中主要应用II类限制酶，因其能识别特异的DNA序列，并在识别位点内进行切割。在进行限制性酶消化时，由于反应条件的变化容易产生星号活性，所以酶切反应要使用与酶配套的缓冲液，加入酶的量应控制在总体系的1/10之内，以防止甘油浓度过高。

3．目的基因和载体片段的连接――接

限制酶切割后的目的基因片段和载体片段经回收纯化后，可以用连接酶进行连接。连接酶能催化DNA片段3'-OH和5'-P反应，脱去水分子形成磷酸二酯键，把DNA片段连接起来。进行匹配粘性末端的连接时，两种连接酶（DNA连接酶和T4 DNA连接酶）都可以使用。

4．连接产物的转化――转

在体外组装的DNA重组分子只有转入合适的受体细胞，才能进行大量地复制、增殖和表达。转入方式随载体的不同而不同，转移技术包括：转化、转导、杂交、细胞融合及脂质体介导转移等。质粒DNA导入细菌的过程为转化，主要有两种方法：化学法转化和电击法。化学转化法的转化效率低于电击法，但足以

处理宿主细胞使其处于感受态，与连满足实验室要求。其原理是使用低温CaCl

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接产物混合，冰上30min，42℃水浴90s，使外源DNA进入宿主细胞。将转化后的细胞涂于平板上，过夜培养后会有菌落出现，即可进行重组子的鉴定。

5．重组子的鉴定

在实验室中，鉴定重组子最简单有效的方式是提取质粒，用限制酶消化检测是否有目的基因片段，并辅助以PCR方法。

DNAMarker

空质粒单酶切

重组质粒单酶切

重组质粒双酶切

重组质粒的PCR扩增片段

鉴定出的重组质粒通常还用进行DNA序列的测定，确定插入的外源DNA 片段是否为目的基因片段。

【实验步骤】

一．已知目的基因的PCR扩增、纯化及限制性酶切实验

(一)实验仪器、耗材和试剂

1.实验仪器和耗材：PCR仪，电泳仪，电泳槽，水浴锅，无菌超净台（每个超净台上酒精灯，酒精棉球各一套，枪头（1000 µl、200µl）各一盒），低温高速离心机，凝胶成像仪，称量天平，移液器，PCR管，0.5 ml离心管（灭菌），1.5 ml 离心管（灭菌）。

2.试剂：Taq DNA聚合酶，dNTP，引物，BamH I和Nde I，无菌去离子水，DNA 片段凝胶回收试剂盒，琼脂糖，50×TAE电泳缓冲液100 ml（24.2 g Tris碱，

5.71 ml 冰乙酸，10 ml 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0））

(二)实验流程

1.目的基因的PCR扩增

PCR体系：100 ul

Taq DNA聚合酶缓冲液 10 ul

Taq DNA聚合酶 1 ul

dNTP 2 ul

模板DNA 1 ul

上游引物 1 ul

下游引物 1 ul

无菌去离子水 84 ul

混匀后，加50 ul石蜡油，放入PCR仪进行PCR反应。

94℃ 3 min

94℃ 30 s

52℃ 45 s 30个循环

72℃ 60 s

72℃ 10 min

4℃

2.目的基因的电泳检测

称取0.12 g琼脂糖，加入10 mlTAE电泳缓冲液中。微波炉加热使琼脂糖溶解。待凝胶冷至60 ℃时，加入溴乙锭至终浓度为0.5 µg/ml，快速倒入制胶盒中，插入梳子。待凝胶凝固后，拔出梳子。将凝胶放入电泳槽中，准备上样。取4.5 µl样品与0.5 µl 10×上样载样液混匀，点入上样孔中。连接电源线，恒压100 V，电泳方向为负极向正极。待电泳前沿至凝胶中部时，停止电泳。将凝胶取出，在紫外灯下检测。

3.目的基因的纯化

将凝胶中含目的基因的胶条在紫外灯下切下，放入1.5 ml离心管中，用DNA 片段回收试剂盒回收。

4.回收目的基因的电泳检测

取回收后的样品4.5µl，经琼脂糖凝胶电泳检测回收效果。

5.目的基因与质粒载体的双酶切

将回收后的目的基因及质粒载体分别用Bam HI和NdeI进行同时双酶切，酶切体系如下：

总体系：100 µl

目的基因或质粒待定

Buffer K 10 µl

BamH I 5 µl

Nde I 5 µl

无菌水待定

37℃水浴过夜。

二．目的基因及载体片段的回收与连接

(一)实验仪器、耗材和试剂

1.仪器和耗材：电泳仪，电泳槽，恒温水浴，无菌超净台，低温高速离心机，凝胶成像仪，移液器，恒温摇床，称量天平，0.5 ml离心管，1.5 ml离心管，，枪头（1000 µl、200µl），试管，50 ml离心管（灭菌），250 ml三角瓶，培养皿（灭菌）。