脊髓性肌萎缩症SMN基因检测和其表达的研究

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二、材料 １．试剂：
（１）基因组ＤＮＡ提取试剂：１．５％ＥＤＴＡ，低渗ＲＢＣ裂解液（０．７％ＮＨ。 ＣＬ，７．１２％ＮＨ。ＨＣ０３），ＤＮＡ提取缓冲液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，ｔＯｍｍｏＬ／Ｌ ｎａＣＬ，１０ｉｎｍｏｌ／Ｌ ＴｒｉｓＣＬ，０．５％ｓｏｓ），２０ｍｇ／ｍｌ蛋白选择： 基因诊断确诊为ＳＭＮＩ外显子７纯合缺失的ＳＭＡ患者５７例（Ｉ型２１ 例，Ⅱ型２５例，Ⅲ型１１例）。患者父母１１４例；正常对照４０例，均为本院检 验科职工，个体问无亲缘关系。 ２．标本留取： （１）分离白细胞：受试者外周静脉血５ｍｌ，用１．５％ＥＤＴＡ ０．５～１．０ｍｌ抗
．２·
和酚（上海生工公司），氯仿，异戊醇，无水乙醇。 （２）电泳试剂：琼脂糖（ＴａＫａＲａ公司），１００ ｌａｄｄｅｒ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ（ＴａＫａＲａ
公司），载样缓冲液（９８％甲酰胺，０．０５％澳酚兰，０．０５％二甲苯氰，ｌＯＭｍ ＥＤＴＡ）、冰乙酸、０．２％ＡｇＮ０３，３％Ｎａ２Ｃ０３，０．４％甲醛。聚丙烯酰胺，甲叉双 丙烯酰胺（上海生工公司），过硫酸铵，ＴＥＭＥＤ，超纯尿素（Ｓｉｇｍａ公司）
凝，３０００ｒｐｍ／ｍｉｎ，１０ｒａｉｎ，弃去血浆，剩余ＲＢＣ加２倍体积的低渗ＲＢＣ裂攥 液，震荡，放置４０ｒａｉｎ，离心（操作同上），弃去上清，重复一次，提取的ＷＢＣ
置一２０℃保存。 （２）外周血淋巴细胞：受试者外周静脉血５ｍｌ，用１．５％ＥＤＴＡ０．５—１．０
ｒｒＩｌ抗凝，加入等量生理盐水稀释、混匀，然后轻轻加到等量｝｝｝巴细胞分离液 上。离心２２００ｒｐｍ／ｍｉｎ，１３分钟，取中间白色絮状淋巴细胞层置于ＥＰ管中， 一８０ｑＣ保存。
论文作者签名： 指导教师签名：
（玉亟函
脊髓性肌萎缩症ＳＭＮ基因检测及其表达的研究
目
的
脊髓性肌萎缩（ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ，ＳＭＡ）是以脊髓前角运动神经元 退化变性为特征，临床表现为进行性、对称性肢体近端和躯干肌肉萎缩、无 力和瘫痪的一种常染色体隐性遗传病。发病率约１／１００００。根据其发病年 龄及严重程度在临床上将其分为三种类型（Ｉ—ｌＩｌ型）：Ｉ型（Ｗｅｒｄｎｉｎｇ— Ｈｏｆｆｍａｎｎ病）是最严重型，一般６个月之内发病，不能坐，通常在２岁之内 死亡。ＩＩ型（中间型）：常在１８个月前发病，无独立行走能力，其存活时间２ 年以上。ＩＩＩ型（Ｋｕｇｅｌｂｅｒｇ—Ｗｅｌａｎｄｅｒ病）一般在１８个月之后发病，能独立 行走，但行走无力。ＳＭＡ致病基因定位于染色体５ｑ１１．２～５ｑ １３．３区域。 该区域的运动神经元生存基因（ｓｕｒｖｉｖａｌ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ，ＳＭＮ）为ＳＭＡ的决定 性基因。该基因存在两个高度同源的拷贝，端粒拷贝（ＳＭＮｌ）和着丝粒拷 贝（ＳＭＮ２）。９６％的ＳＭＡ患者有ＳＭＮＩ基因外显子７的纯合缺失或突 变旧１。以往根据ＳＭＮＩ和ＳＭＮ２之间的核苷酸差异和患者ＳＭＮＩ基因外显 子７或８纯合缺失，多采用限制性片段长度多态（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）、单链构象多态性（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒ－ ｐｈｉｓｍ，ｓｓｃＰ）等方法进行ＳＭＡ基因诊断。但上述方法需费用高、操作繁杂、 耗时长，所以有必要探讨更为简便、快速的ＳＭＡ基因诊断方法。为此本研 究第一部分建立了检测单碱基突变的等位基因特异性扩增ＡＳ—ＰＣＲ（Ａｌ— ｌｅｌｅ—Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）方法，用以检测ＳＭＮＩ基因外显子７缺失。由于 正常人群中有１／４０—１／６０携带ＳＭＮｌ基因缺失，所以对于ＳＭＡ携带者的 检测在遗传咨询中尤为重要。但ＡＳ—ＰＣＲ法与以往定性ＰｃＲ—ＲＦＬＰ等方 法一样均不能将正常人与ＳＭＡ携带者区分开。为此本研究第二部分应用 ＴａｑＭａｎ技术并采用ＭＧＢ（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ，ＭＧＢ）探针建立了定量检测 ＳＭＮ基因拷贝的实时荧光定量ＰＣＲ方法，检测了正常人及ＳＭＡ患者父母 的ＳＭＮｌ基因拷贝数，根据其ＳＭＮｌ基因拷贝数之间差异的特点判定ＳＭＮＩ
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基因缺失携带者。迄今为止，ＳＭＡ临床表型变化的遗传学基础还不是十分 清楚，有研究表明增加ＳＭＮ２基因拷贝数可以部分补偿ＳＭＮｌ基因缺失，从 而减轻ＳＭＡ的严重程度。因此，本研究应用荧光定量ＰｃＲ方法检测了不 同类型ＳＭＡ的ＳＭＮ２基因拷贝数的变化，旨在探讨ＳＭＮ２基因拷贝数与 ＳＭＡ临床分型之间的相关关系，为基因治疗本病提供可监测的指标。本课 题研究结果已表明ＳＭＮ２基因拷贝数与ＳＭＡ临床分型有关，但部分ＳＭＮ２ 基因可以产生少量（２０％一３０％）含有外显子７的全长ＳＭＮ基因转录本。 因此，推测不同类型ＳＭＡ患者ＳＭＮ２基因表达全长转录本的量可能不同。 所以本研究的第三部分采用ＲＴ－ＰＣＲ方法分析不同类型ＳＭＡ患者ＳＭＮ基 因ｍＲＮＡ的表达，旨在探讨ＳＭＮ基因表达与ＳＭＡ临床分型的相关关系。