膜片钳技术培训
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膜片钳技术原理与基本操作
膜片钳技术原理与基本操作(总7页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--膜片钳技术原理与基本操作1976 年Neher 和Sakmann 建立了膜片钳技术（Patch clamp technique），这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的或多数的离子通道分子活动的技术。
1981 年Hamill, Neher 等人又对膜片钳实验方法和电子线路进行了改进，形成了当今广泛应用的膜片钳实验技术。
该技术可应用于许多细胞系的研究，也是目前唯一可记录一个蛋白分子电活动的方法，膜片钳技术和克隆技术并驾齐驱给生命科学研究带来了巨大的前进动力，这一伟大的贡献，使Neher 和Sakmann 获得1991 年诺贝尔医学与生理学奖。
一、膜片钳技术的基本原理二、用一个尖端直径在~μm 的玻璃微电极接触细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端与细胞膜之间形成千兆欧姆以上的阻抗封接，此时电极尖端下的细胞膜小区域（膜片，patch）与其周围在电学上分隔，在此基础上固定（钳制，Clamp）电位，对此膜片上的离子通道的离子电流进行监测及记录。
三、基本的仪器设备有膜片钳放大器、计算机、倒置显微镜、示波器、双步电极拉制器、三轴液压显微操纵器、屏蔽防震实验台、恒温标本灌流槽、玻璃微电极研磨器。
膜片钳放大器是离子单通道测定和全细胞记录的关键设备，具有高灵敏度、高增益、低噪音及高输入阻抗。
膜片钳放大器是通过单根电极对细胞或膜片进行钳制的同时记录离子流经通道所产生的电流。
膜片钳放大器的核心部分是以运算放大器和反馈电阻构成的电流-电压（I-V）转换器，运算放大器作为电压控制器自动控制，使钳制电位稳定在一定的水平上。
四、二、操作步骤1.膜片钳微电极制作(1) 玻璃毛细管的选择：有二种玻璃类型，一是软质的苏打玻璃，另一是硬质的硼硅酸盐玻璃。
软质玻璃在拉制和抛光成弹头形尖端时锥度陡直，可降低电极的串联电阻，对膜片钳的全细胞记录模式很有利；硬质玻璃的噪声低，在单通道记录时多选用。
膜片钳实验技术(高级生理课程,201310)
Sutter公司微电极拉制器
P-97
P-2000
日本成茂公司微电极拉制器和抛光仪
软件系统：目前的数据采集和分析软件系统主要是 Axon公司的Pclamp软件和HEKA公司的Patch Master 软件。在实验后期文章发表中还涉及到一些图形处 理软件，如Origin等软件。
MDC公司Pclamp采集和分析软件
膜片钳放大器的工作模式： (1).电压钳模式：在钳制细胞膜 电位的基础上改变膜电位，记 录离子通道电流的变化，记录 的是诸如通道电流；EPSC;IPSC 等电流信号。是膜片钳的基本 工作模式. (2).电流钳模式:向细胞内注入 刺激电流，记录膜电位对刺激 电流的反应。记录的是诸如动 作电位，EPSP;IPSP等电压信号。
AXON200B
MultiClamp700B
EPC10
数据采集、分析系统
光学部件和光电接口：膜片钳实验是一 个微操作实验，需在显微镜下进行玻璃 电极和细胞的封接，因此需要高质量的 显微镜和成像系统，如果所用的细胞是 培养的单个细胞，需要一台倒臵相差显 微镜，而如果所用的标本是脑片或其他 组织片，所用的光学系统必须是红外微 分干涉差成像系统，这样才能“看”到 组织中的单个的细胞，才能在可视条件 下进行组织膜片钳的操作。
膜片钳记录模式
————————
细胞吸附模式
Cell-attached mode; on-cell mode 细胞内环境保持正常条件下可对离子通道的活 动进行观察记录。 到达与电极接触的膜片外部，如果刺激浴液中 加入刺激物质不能有效，则说明刺激物质是经 过细胞内第二信使介导间接起作用。 不能人为直接控制细胞内环境条件，不能确切 判定细胞内电位，不清楚膜片上的实效电位。
+
浙江大学-刘振伟教授高级培训班-膜片钳技术数据处理与分析.ppt
Patch clamp training class
Apr. 23-25, 2014
26
膜片钳实验数据的处理
EI所需最少数据点的计算举例 滤波器所需最少数据点＝ （采样频率/ 50 Hz）× Cycles to average 若采样频率＝ 10 kHz， 则一个50 Hz正弦波周期的采样点数＝ 10 kHz / 50 ＝200 点 若设定Cycles to average ＝ 10，则需要的最少采样点数＝ 2,000点
Patch clamp training class
Apr. 23-25, 2014
18
膜片钳实验数据的处理
Lowpass 最为常用。 Clampfit根据采样定理与Nyquist定理自动算出f-3dB范围并显示 在该框底部。 7种类型： （1）8-pole Bessel：数据失真小，普遍用于时域数据。 （2）Boxcar：数码滤波器，用于时域数据。当前数据点及其前 后一些数据点（取决于Smoothing points，取3-99中的奇数） 的平均值赋予当前数据点，完成滤波。 Smoothing points值越大，数据幅度削减越大。 （3）Gaussian：数码滤波器，同Boxcar，但当前数据点在平均 值中所占的比例较大。 （4）RC (8-coincident-pole)：用于时域数据。 （5）RC ( single-pole)：用于时域数据。 （6）8-pole Butterworth：用于频域数据。 （7）8-pole Chebyshev：用于频域数据。
2
膜片钳实验数据的处理
一、基线的调零
二、坏点的去除
三、滤波 四、数据文件内部/之间的数学运算
Patch clamp training class
武汉大学医学部膜片钳安装培训V剖析
configuration
细胞膜内侧暴露在浴槽溶液中 用于单通道记录（single-channel recording) 可方便地通过改变浴槽灌流液（此时相当于细胞 内液）来了解药物对离子通道的影响 常用于研究钙、细胞内源性物质及第二信使对离 子通道的影响
外面向外式
计算机控制的微电极放大器 双电极探头
MultiClamp Commander
液接电位调零 电极电容补偿 细胞膜电容 膜电阻补偿
电极电阻补偿
Sutter公司
MP-225
电动式微操
$6,500
美国TMC公司
什么是膜片钳（Patchclamp）？
膜片钳技术是一种通过微电极与细胞 膜之间形成紧密接触的方法，采用电 压钳或电流钳技术对生物膜上离子通 道的电活动进行记录的微电极技术。
内尔(Neher) （1944-） （德国细胞生理学家）
萨克曼(Sakmann) （1942-）
（德国细胞生理学家）
一个典型的实验过程
四种经典记录模式 (Cell-attached or On cell mode)
贴附式
全细胞记录模式
细胞
负压吸
拉并暴露于空气中
细胞 拉
细胞 内面向外式
细胞 外面向外式
膜片钳电生理技术与设备
神经元
微电极
FBR
_
+ Amplifier
Technical The high gain operational amplifier is connected in the circuit so that the current flowing through the ion channel is measured as a voltage drop across the feedback resistor (FBR). The FBR has a resistance of 50 G allowing very small currents (10-12 A)
细胞膜内侧暴露在浴槽溶液中 用于单通道记录（single-channel recording) 可方便地通过改变浴槽灌流液（此时相当于细胞 内液）来了解药物对离子通道的影响 常用于研究钙、细胞内源性物质及第二信使对离 子通道的影响
外面向外式
计算机控制的微电极放大器 双电极探头
MultiClamp Commander
液接电位调零 电极电容补偿 细胞膜电容 膜电阻补偿
电极电阻补偿
Sutter公司
MP-225
电动式微操
$6,500
美国TMC公司
什么是膜片钳（Patchclamp）？
膜片钳技术是一种通过微电极与细胞 膜之间形成紧密接触的方法，采用电 压钳或电流钳技术对生物膜上离子通 道的电活动进行记录的微电极技术。
内尔(Neher) （1944-） （德国细胞生理学家）
萨克曼(Sakmann) （1942-）
（德国细胞生理学家）
一个典型的实验过程
四种经典记录模式 (Cell-attached or On cell mode)
贴附式
全细胞记录模式
细胞
负压吸
拉并暴露于空气中
细胞 拉
细胞 内面向外式
细胞 外面向外式
膜片钳电生理技术与设备
神经元
微电极
FBR
_
+ Amplifier
Technical The high gain operational amplifier is connected in the circuit so that the current flowing through the ion channel is measured as a voltage drop across the feedback resistor (FBR). The FBR has a resistance of 50 G allowing very small currents (10-12 A)
关于电压钳制和膜片钳制技术 (2)课件
误差 变
。
时引起的电容电流 。
将一定的电压加入到刺激信
(4)指令信号控制部分：号中，形成一指令信号的保
持电压。进行电压钳制时， 它决定膜电位值，作电流钳
四种经典记录模式 (Cell-attached or On cell mode)
贴附式
全细胞记录模式
细胞
负压吸
拉并暴露于空气中
细胞 拉
细胞 内面向外式
Cm
Rm Rm 膜电阻
+
-
Em 离子平衡电位 Em
Ro 细胞外液的纵向电阻（Ω/cm）
Ri 轴浆的纵向电阻（Ω/cm）
inside
膜电位等效电路的简化图
离子通道等效电路
细胞膜的等效电路是一个并联的阻容 电路，膜活动时既有电压的改变，同时又 有电流的改变。电位的改变可引起电容器 的充、放电，也可用于电阻器上的电流流 动。通过电容器的电流为Ic ，通过电阻 的电流为Ir。
(二)电压钳方法
电容器电流
电阻器上电流
Ic=d（CmV）/dt
IR
流过膜的电流总量 I
dv / dt = 0
所有的电流将都是流过 膜电阻的，这种电流将能反 映离子的流动。
电压钳技术的基本原理
电压源（SG）使膜电位固定在特定的水平，并以放 大器（AV）记录，该放大器与一个反馈放大器（AFB）连 接，这一反馈电流通过膜，正好抵消因加电压而引起的离 子电流，通过电流监视器测量电流。
膜片钳技术原理示意图
Rs是膜片阻抗相串联的局部串联电阻（输入阻抗），Rseal是 封接阻抗。Rs通常为1～5MΩ，如果Rseal高达10GΩ（1010Ω）以 上时，IP/I=Rseal/(Rs+ Rseal)-1。此Ip可为在I－V转换器（点线） 内的高阻抗负反馈电阻(Rf)的电压降而被检测出。
膜片钳技术及其应用
细胞信号转导的研究
膜片钳技术可以用于研究细胞信号转导过程中离子通道和受体的变 化，了解信号转导的机制。
细胞功能调控的研究
膜片钳技术可以用于研究细胞功能调控的机制，例如细胞兴奋性的 调节和细胞内离子浓度的变化。
04 膜片钳技术的优势与局限 性
膜片钳技术的优势
高灵敏度
细胞无损
膜片钳技术具有高灵敏度，能够检测单 个离子通道的活动，从而提供关于细胞 膜电位和离子通道功能的重要信息。
膜片钳技术可以在保持细胞完整性的 情况下进行实验，不会对细胞造成严 重损伤或干扰细胞的正常功能。
实时监测
膜片钳技术可以对细胞膜电位进行实时 监测，从而了解离子通道的动态变化， 有助于深入理解细胞生理和病理过程。
膜片钳技术的局限性
1 2 3
实验条件要求高
膜片钳技术需要高精度的实验设备和条件，包括 低温、低噪声和低阻抗等，这增加了实验的难度 和成本。
03
04
05
膜片钳放大器
微操纵器
细胞培养皿或显 微镜载玻片
电极溶液
细胞内和细胞外 灌流液
用于放大细胞膜电信号， 提高信号的检测灵敏度。
用于精确控制电极的移动 ，以便在细胞膜上定位和 进行膜片钳实验。
用于培养和固定细胞，以 便进行膜片钳实验。
用于填充电极，以保持电 极的湿润和导电性。
用于维持细胞内外环境的 稳定，并排除干扰实验的 物质。
03
在单细胞水平上研究细胞信号转导和离子通道功能，深入了 解细胞生理和病理过程。
膜片钳技术与其他技术的联合应用
结合光学成像技术，利用膜片钳技术对神经元电生理特性进行同时监测和成像，实现多参数的同时测 量。
与基因编辑技术结合，利用膜片钳技术对特定基因表达的离子通道进行功能研究，深入了解基因与离子 通道的关系。
膜片钳技术可以用于研究细胞信号转导过程中离子通道和受体的变 化，了解信号转导的机制。
细胞功能调控的研究
膜片钳技术可以用于研究细胞功能调控的机制，例如细胞兴奋性的 调节和细胞内离子浓度的变化。
04 膜片钳技术的优势与局限 性
膜片钳技术的优势
高灵敏度
细胞无损
膜片钳技术具有高灵敏度，能够检测单 个离子通道的活动，从而提供关于细胞 膜电位和离子通道功能的重要信息。
膜片钳技术可以在保持细胞完整性的 情况下进行实验，不会对细胞造成严 重损伤或干扰细胞的正常功能。
实时监测
膜片钳技术可以对细胞膜电位进行实时 监测，从而了解离子通道的动态变化， 有助于深入理解细胞生理和病理过程。
膜片钳技术的局限性
1 2 3
实验条件要求高
膜片钳技术需要高精度的实验设备和条件，包括 低温、低噪声和低阻抗等，这增加了实验的难度 和成本。
03
04
05
膜片钳放大器
微操纵器
细胞培养皿或显 微镜载玻片
电极溶液
细胞内和细胞外 灌流液
用于放大细胞膜电信号， 提高信号的检测灵敏度。
用于精确控制电极的移动 ，以便在细胞膜上定位和 进行膜片钳实验。
用于培养和固定细胞，以 便进行膜片钳实验。
用于填充电极，以保持电 极的湿润和导电性。
用于维持细胞内外环境的 稳定，并排除干扰实验的 物质。
03
在单细胞水平上研究细胞信号转导和离子通道功能，深入了 解细胞生理和病理过程。
膜片钳技术与其他技术的联合应用
结合光学成像技术，利用膜片钳技术对神经元电生理特性进行同时监测和成像，实现多参数的同时测 量。
与基因编辑技术结合，利用膜片钳技术对特定基因表达的离子通道进行功能研究，深入了解基因与离子 通道的关系。
武汉大学医学部 膜片钳安装培训 V
膜片钳技术发展简介
1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进， 引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使 该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm 的空间分辨率和10μs的时间分辨率。
1983年10月 《Single-Channel Recording》一 书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获 1991年诺贝尔奖。
Capillary Top channel Casptiollapry stop-extracellular Breather
Breather
Breather
Waste
REF
MEAS
BoRtetaorm(intrcahceallnulnare) l -intrfalocweclhluanlanerl
to be measured.
Patch of cell membrane with ion channel
刺激器 示波器
屏蔽网
监视器
显微镜
微操
放大器 A/D转换器
headstage
防震台
刺激电极 headstage 微操作器
微机
pClamp10软件
MultiClamp700B 电阻反馈膜片钳和高速电流钳放大器
电压钳-电容的充放电波形
全细胞模式下等效电路
全细胞电压钳的各个电流波形
补偿原理：提供另一支路
快电容(电极电容)补偿
慢电容(膜电容)补偿
电流波形补偿全图（200B）
电流波形补偿全图（700B）
串联电阻??
串联电阻引起的钳位误差
串联电阻补偿(200B)
串联电阻补偿(700B)
膜片钳实验技术入门---基本原理与操作
膜片钳实验技术入门------基本原理与操作关兵才 李国华 刘理望按：本文乃于2003年根据较旧型号的仪器写成，后被《机能实验科学》 （郑先科主编，北大医学版，2006）收入。
因新旧仪器基本原理和操作步骤大同小异，现对原文略作修改和标注，供同学们参考。
【实验目的】1. 了解膜片钳技术的基本原理和操作。
2. 初步学习电压依赖性离子通道电流的基本记录方法。
【实验原理】一、膜片钳技术原理简介膜片钳(patch clamp)是一种主要用于检测细胞膜离子通道活动的电生理技术，按工作方式可区分为电压钳(voltage clamp)和电流钳是最基本的工作方式，即对细胞膜电位进行人为控制，如将膜电位钳制于某一固定水平，或在此基础上再施以阶跃(step)式或斜坡式(ramp)电压刺激，同时记录跨膜电流，从而分析细胞膜通道的活动。
电流钳即人为控制经微电极对细胞进行注射的电流（等于离子通道电流与细胞膜电容电流之和），同时记录膜电位及其变化。
若注射电流为零即常用的零位钳流，用于测量细胞膜静息电位，若注射方波脉冲刺激电流，用于诱发、观测动作电位。
另外，膜片钳技术还常用于观测细胞膜电容, 从而推测分泌细胞的活动情况。
下面主要介绍其电压钳工作方式的基本原理。
（注：在电生理资料中，因通常将细胞外液和记录系统的“地”点相连作为参考点即零电位点，所以电位和电压两个概念经常混用。
）根据膜片钳实验中受检细胞膜的型式（configuration）不同，又可将膜片钳分为全细胞式(whole-cell)、细胞贴附式(cell-attached 或on-cell)、内面朝外式(inside-out)、外面朝外式(outside-out)等四种模式。
(一)全细胞式1．电压钳制和电流记录的实现图9-9为全细胞式膜片钳工作原理示意图。
图9-9 全细胞膜片钳实验原理示意图A1：运算放大器；A2：单倍增益差动放大器；R f：反馈电阻；V p：电极电位（A1反向输入端电位）；V c：A1同向输入端电位；C in：输入端杂散电容；C p：电极电容；Rs：串联电阻；C m：细胞膜电容；R m：细胞膜电阻；E m：细胞膜内在电位(指钳压时的细胞膜诸通道状态决定的内在Goldman-Hodgkin-Katz平衡电位)；V o：A2输出端电位；V-offset：偏移电位补偿电位；C c：用于电容补偿的电容；V c(app)：表观钳制电压即欲施加于受试膜片的电压；图中⊕和表示求和电路将充有电解质溶液的玻璃微电极（glass microelectrode或 recording pipette）利用负压紧密吸附于细胞表面，形成吉欧即千兆欧（109Ω）级高阻封接，进一步对微电极内施加负压、将放大器（以下简称运放）A1在深度负反馈工作状态下的“虚短路（virtual short circuit）”原理实现，即只要A1工作于线性范围内，其反向输入端的电位V p总是等于同向输入端的电位V c，这两个输入端之间虽非短路却类似于短路。
膜片钳实验与技术PPT课件
21
电压门控钠离子通道
钠离子通道（sodium channels，简称钠通道），是选择性 地容许Na+跨膜通过的离子通道。根据其对钠通道阻滞剂河豚毒素 （tetrodotoxin, TTX）和μ-食鱼螺毒素（μ-conotoxin,μ- CTX） 的敏感性不同分为神经类、骨骼肌类和心肌类钠通道三类。
精品ppt
20
2、电压门控离子通道
电压门控离子通道（voltage-gated ion channels）又称电压依赖性离子通道，这
一类通道的开启或关闭受膜电位的变化决 定，具有电压依赖性和时间依赖性。电压 门控离子通道一般以最容易通过的离子命 名，如钠离子通道、钙离子通道及钾离子 通道等。
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2
然而，你是否知道？有一篇论文，它的作者 当时还不太有名，刊登的杂志也不算顶级，可是论文发 表20年来，已神话般地被世界各地的科技工作者引用了 一万二千余次，遍及生物医学的众多领域，而且近年来 还在以平均每年约一千多篇的速度继续被引用，它就是 由Hamill，Marty，Neher，Sakmann和Sigworth等五人 于1981年发表在《欧洲生理学杂志》上的著名论文 <Improved Path-Clamp Technigues for HighResolution Current Recording from Cells and Cell-free Membrane Patches>。在此之前五年，身为 德国科学家的Neher和Sakmann共同发明了膜片钳技术 （1976），并于15年后共同荣获1991年诺贝尔 生理学 或医学奖。
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7
二、离子通道的分子结构
随着生物物理学和分子生物学的迅速发展，新的研究技术 的应用，特别是膜片钳片技术与分子克隆、基因突变和异体表达 等技术的结合，使离子通道的研究迅速进入到分子、亚分子水平， 人们已开始有能力从分子水平来确定通道的分子结构和解释离子 通道的孔道特性。
膜片钳技术原理及相关基本知识
内分泌系统研究
膜片钳技术可以用于研究内分泌系统的电生理特性，了解激素分泌的 调节机制。
其他领域的应用
肿瘤学研究
膜片钳技术可以用于研究肿瘤细胞的 电生理特性，了解肿瘤的发生和发展 机制。
免疫学研究
膜片钳技术可以用于研究免疫细胞的 电生理特性，了解免疫反应的调节机 制。
THANKS
感谢观看
膜片钳技术可以用于药物筛选， 快速筛选出具有潜在治疗作用的 药物。
膜片钳技术可以用于研究药物对 离子通道的影响，了解药物的副 作用和不良反应。
生理学领域的应用
心血管系统研究
膜片钳技术可以用于研究心血管系统的电生理特性，了解心脏和血 管的电活动和功能。
呼吸系统研究
膜片钳技术可以用于研究呼吸系统的电生理特性，了解呼吸肌的电 活动和功能。
膜片钳技术的应用领域
生理学研究
研究细胞膜离子通道的电生理 特征和功能，揭示生理状态下
细胞膜电活动的规律。
药理学研究
研究药物对离子通道的作用机 制和效果，为新药研发提供实 验依据。
神经科学研究
研究神经元和神经网络的电活 动和信息传递机制，揭示神经 系统的工作原理。
疾病机制研究
研究疾病状态下细胞膜离子通 道的异常变化，为疾病诊断和
数据采集
使用膜片钳系统记录细胞膜 电位变化，通过放大器和记 录器获取数据。
数据筛选
排除异常或噪声数据，确保 数据质量。
数据转换
将原始数据转换为适合分析 的格式，如电压值或电流值 。
数据分析方法
统计分析
对数据进行统计分析，如平均值、标准差、相 关性等。
频谱分析
对数据进行频谱分析，以了解信号的频率成分。
膜片钳技术适用于多种细胞 类型，包括神经元、肌肉细 胞、上皮细胞等，具有广泛 的应用范围。
膜片钳技术可以用于研究内分泌系统的电生理特性，了解激素分泌的 调节机制。
其他领域的应用
肿瘤学研究
膜片钳技术可以用于研究肿瘤细胞的 电生理特性，了解肿瘤的发生和发展 机制。
免疫学研究
膜片钳技术可以用于研究免疫细胞的 电生理特性，了解免疫反应的调节机 制。
THANKS
感谢观看
膜片钳技术可以用于药物筛选， 快速筛选出具有潜在治疗作用的 药物。
膜片钳技术可以用于研究药物对 离子通道的影响，了解药物的副 作用和不良反应。
生理学领域的应用
心血管系统研究
膜片钳技术可以用于研究心血管系统的电生理特性，了解心脏和血 管的电活动和功能。
呼吸系统研究
膜片钳技术可以用于研究呼吸系统的电生理特性，了解呼吸肌的电 活动和功能。
膜片钳技术的应用领域
生理学研究
研究细胞膜离子通道的电生理 特征和功能，揭示生理状态下
细胞膜电活动的规律。
药理学研究
研究药物对离子通道的作用机 制和效果，为新药研发提供实 验依据。
神经科学研究
研究神经元和神经网络的电活 动和信息传递机制，揭示神经 系统的工作原理。
疾病机制研究
研究疾病状态下细胞膜离子通 道的异常变化，为疾病诊断和
数据采集
使用膜片钳系统记录细胞膜 电位变化，通过放大器和记 录器获取数据。
数据筛选
排除异常或噪声数据，确保 数据质量。
数据转换
将原始数据转换为适合分析 的格式，如电压值或电流值 。
数据分析方法
统计分析
对数据进行统计分析，如平均值、标准差、相 关性等。
频谱分析
对数据进行频谱分析，以了解信号的频率成分。
膜片钳技术适用于多种细胞 类型，包括神经元、肌肉细 胞、上皮细胞等，具有广泛 的应用范围。
膜片钳技术及应用
膜片钳技术的应用领域
神经科学
研究神经元离子通道与动作电 位的产生和传播，以及药物对
神经元功能影响。
心血管
研究心脏离子通道与心律失常 的关系，以及抗心律失常药物 的作用机制。
药理学
研究药物对离子通道的作用机 制和效果，以及新药的开发和 筛选。
其他领域
膜片钳技术还可应用于内分泌 、免疫等领域，研究相关细胞
利用膜片钳技术，可以研究神经元在长期和短期内的电生理变化，了 解学习、记忆等认知过程的神经机制。
药物筛选与开发中的应用
药物作用机制的研究
膜片钳技术可以用于研究药物对离子通道或受体电流的影响，从 而揭示药物的作用机制。
药物筛选
通过膜片钳技术，可以在细胞或组织水平上快速筛选出具有特定 药理作用的药物候选物。
物或其他因素对细胞膜功能的影响。
03 膜片钳技术的应用实例
神经科学研究中的应用
神经元电活动的记录
膜片钳技术可以用来记录单个神经元在静息状态和刺激下的膜电位 变化，从而研究神经元的兴奋性和电生理特性。
突触传递的研究
通过膜片钳技术，可以记录突触后电位，研究神经递质释放、受体 激活和信号转导等过程。
神经可塑性的研究
在医学诊断与治疗中的应用
疾病诊断
膜片钳技术可用于检测细胞膜离子通道的异常变化，从而对某些 疾病进行早期诊断，如癌症、神经退行性疾病等。
药物研发
通过膜片钳技术可以研究药物对离子通道的作用机制，为新药研发 提供有力支持。
个体化治疗
根据患者的离子通道基因变异情况，膜片钳技术可以为个体化治疗 提供精准的用药建议。
高通量与高灵敏度
通过改进膜片钳技术的设计和材料，有望实现高通量和高灵敏度的检测， 从而能够同时记录多个细胞或同一细胞的不同活动，提高实验的效率和 精度。
1 膜片钳技术
钙电流 对分化的MN9D细胞进行突起切断
A) 突起切断前
50 μm
B) 突起切断后
返回
钙电流
突起切断与MPP+损伤后细胞钙电流
I-V 之对照
Normalized Currents
Normalized Currents
-70 -50 -30 -10 10 30 50 70 0.0
-70 -50 -30 -10 10 30 50 70 0.0
1 膜片钳技术
1.1 细胞膜离子通道 1.2 生物电信号测量基础 1.3 膜片钳实验的基本方法 1.4 膜片钳放大器
返回
1.1 细胞膜离子通道
1.1.1 一般结构模型 1.1.2 通道性质 1.1.3 主要种类和亚型
1.1.1 一般结构模型
离子通道模型: (a)、(b)组成离子通道的短杆菌肽A二聚体的结构 模型，(c)、(d)丙甲菌素螺旋六聚体所形成的通道结构模型。(a)、 (c)与膜垂直，两端的虚线表示膜的界面，(b)、(d)从膜外往内观。
1.1.3 主要种类和亚型
1.钠离子通道
钠离子通道广泛分布于可兴奋细胞中，现已克 隆出多种类型的钠通道，其中多数对钠通道 通透性的拮抗剂河豚毒素（TTX）较敏感， 而心肌中的主要钠通道（hI型）对河豚毒素 的敏感性较其他亚型低约200倍。钠通道主 要为电压门控通道，也有配体门控通道，如 N型胆碱受体偶联钠通道。
4. 机械敏感通道（mechanosensitive channel） 或机械门控通道（mechanogated channel），通 道的开关取决于由机械作用力所引起的细胞膜
变形、通道受其他分子的牵引或与其他分子相
对位置的改变，是触觉和听觉的感受换能机制 的分子基础。
培训学习资料-膜片钳技术-2022年学习资料
Patch Clamp 1976 ve-sonras1-a0.-10
第一次记录：-1.M-11
·1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50cmH0-的负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接 Giga-seal,大大降低了记录时的噪声，实-现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电-流的突破。-12
第一次记录：-A-改进：千兆欧G2封接-13
1981年Hamil1和Neher等对该技术进行了改-进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，-从而使该技 更趋完善，具有1pA的电流灵-敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分-辨率。-14
1983年10月-《Single--Channel Recording.》-一书问世，奠定了膜片钳技术的里 碑。-Sakmann和Neher也因其杰出的工作和突出-贡献，荣获1991年诺贝尔奖。-15
THE PATCH-CLAMP TECHNIQUE-Erwin Neher-Bert Sakmann-Ge many-1991 Nobel Laureates-gigaseal'-pipet-pipette-hum n hair-cell-16
Single-Channel-Recording-1983年10月第一版-Edited by Bert S kmann and Erwin Neher-KSingle-Channel Recording-封面
Isolated neuronal-cell body-maintained in-culture-Cel body-Patch pipette-patch-clamp-technique-for recordi g-electrical activity-DEET-50μm-Ejection
浙江大学-刘振伟教授高级培训班-膜片钳技术数据处理与分析
最大数目为20（对应于1 kHz），一般去除第1-3个就够了。 ➢Cycles to average：数目越大，-3dB频率宽度越窄，滤波效果越好，
但需时越长。 ➢Reference frequency：选50 Hz。
202P1a/t5c/h2c1lamp training class
Apr. 23-25, 2014
Apr. 23-25, 2014
16
膜片钳实验数据的处理
信号采集后的滤波
202P1a/t5c/h2c1lamp training class
Apr. 23-25, 2014
17
膜片钳实验数据的处理
Clampfit滤波类型
Lowpass
Highpass
Bandpass
Notch
Electrical Interference
202P1a/t5c/h2c1lamp training class
Apr. 23-25, 2014
19
膜片钳实验数据的处理
Clampfit演示Lowpass滤波
202P1a/t5c/h2c1lamp training class
Apr. 23-25, 2014
20
膜片钳实验数据的处理
Highpass ➢ 又称交流耦合（AC Coupling），可削弱低频信号
202P1a/t5c/h2c1lamp training class
Apr. 23-25, 2014
18
膜片钳实验数据的处理
Lowpass
➢ 最为常用。 ➢ Clampfit根据采样定理与Nyquist定理自动算出f-3dB范围并显示
在该框底部。
➢ 7种类型： （1）8-pole Bessel：数据失真小，普遍用于时域数据。 （2）Boxcar：数码滤波器，用于时域数据。当前数据点及其前
但需时越长。 ➢Reference frequency：选50 Hz。
202P1a/t5c/h2c1lamp training class
Apr. 23-25, 2014
Apr. 23-25, 2014
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膜片钳实验数据的处理
信号采集后的滤波
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膜片钳实验数据的处理
Clampfit滤波类型
Lowpass
Highpass
Bandpass
Notch
Electrical Interference
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膜片钳实验数据的处理
Clampfit演示Lowpass滤波
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膜片钳实验数据的处理
Highpass ➢ 又称交流耦合（AC Coupling），可削弱低频信号
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Apr. 23-25, 2014
18
膜片钳实验数据的处理
Lowpass
➢ 最为常用。 ➢ Clampfit根据采样定理与Nyquist定理自动算出f-3dB范围并显示
在该框底部。
➢ 7种类型： （1）8-pole Bessel：数据失真小，普遍用于时域数据。 （2）Boxcar：数码滤波器，用于时域数据。当前数据点及其前
膜片钳技术培训
HEKA EPC－10系列放大器
•EPC-10是EPC-9系列全自动膜片钳系统的升级产品，继 承了EPC9的全部功能。 适用于 大膜片记录 全细胞记录 传统细胞内记录 场电位记录 人工双分子层记录 离子选择性电极 电化学检测
HEKA EPC－10系列放大器概述
EPC-10是著名的EPC-9系列的升级产品。产品特 点： １放大器有１/２/３/４探头等多种配置选择。 ２采用光电耦合技术，彻底隔离电脑一侧的噪声， 放大器综合本底噪声<90fA。 ３ 可进行单通道记录、大膜片记录、全细胞记 录、传统细胞内记录、场电位记录、人工双分子 层记录、离子选择性测量以及电化学检测（伏安 法/安培测量法）。
Igor/DAC/TAC/MiniAnalysis/Clampfit
采集软件PatchMaster
采集软件Patchmaster
PatchMaster比EPCMaster增加的 部分
Configuration窗体
Configuration窗体
Configuration-LockIn
Configuration-PhotoMetry
EPC10系统的组成
EPC10(放大器)
EPCMaster控制软件 PatchMaster采集软件
放大器参数文件 SCALE-520248.EPC CFAST-520248.EPC
控制软件EPCMaster
控制软件EPCMaster
控制软件EPCMaster
EPC10放大器控制面板 (EPCMaster/PatchMaster)
PhotoMetry系统
Configuration窗体
Configuration窗体
Configuration窗体
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HEKA EPC系列膜片钳系统
HEKA EPC系列放大器
EPC7 EPC8 EPC9系列(已停产) EPC10系列
HEKA EPC－７放大器
•经典的膜片钳放大器，性能优异，是Neher and Sakmann使用的EPC5的升级版本。
•适用于单通道记录／全细胞记录／电化学记录／ 胞内记录／胞外记录
HEKA EPC－10系列放大器
•EPC-10是EPC-9系列全自动膜片钳系统的升级产品，继 承了EPC9的全部功能。 适用于 大膜片记录 全细胞记录 传统细胞内记录 场电位记录 人工双分子层记录 离子选择性电极 电化学检测
HEKA EPC－10系列放大器概述
EPC-10是著名的EPC-9系列的升级产品。产品特 点： １放大器有１/２/３/４探头等多种配置选择。 ２采用光电耦合技术，彻底隔离电脑一侧的噪声， 放大器综合本底噪声<90fA。 ３ 可进行单通道记录、大膜片记录、全细胞记 录、传统细胞内记录、场电位记录、人工双分子 层记录、离子选择性测量以及电化学检测（伏安 法/安培测量法）。
HEKA EPC－10系列放大器概述
5 所有的补偿操作(液结电位，快慢电容，串联电 阻等)均由软件方便快捷自动完成。 6 具有LockIn放大器，可进行膜电容检测，进行 与膜面积有关的研究，例如胞吞胞吐、细胞分泌 等。 7 通过软件Extension，可进行离子浓度荧光检测， 实现光电联合检测的集成。
分别对应于不同的电流测量范围。
放大器探头主要指标
放大器细胞模型(ModelCell)
1 10MΩ位置：模拟电极入液时的状态 2 6pF位置：模拟形成了高阻封接的状态，此时 快电容=6pF。 3 500MΩ位置：模拟形成了全细胞记录模式，此 时膜电阻=500 MΩ，膜电容Cm＝22pF，串联电 阻=5.1 MΩ 。
基于EPC10的应用系统
测量的位置：胞内/膜上/胞外
Recording Principle
Extracellular (Action potentials)
Patch-clamp Intracellular
(transmembrane potential)
Micro Electrode Array (MEA)
Igor/DAC/TAC/MiniAnalysis/Clampfit
采集软件PatchMaster
采集软件Patchmaster
PatchMaster比EPCMaster增加的 部分
Configuration窗体
Configuration窗体
Configuration-LockIn
Configuration-PhotoMetry
1; On Cell 5.0mV 5.0ms 50.00pF 20.0MOhm 10; 5.0 mV/pA -> medium range
TRUE
3 : WHOLE-CELL; E Mode 3; Whole Cell E Gain 11; 10 mV/pA E CSlow 50.00pF E RSeries 20.0MOhm E AutoCSlow E AutoCSlow E Bell
一个典型的实验过程
全细胞电压钳的各个电流波形
电流波形补偿全图
串联电阻??
串联电阻引起的钳位误差
串联电阻补偿
基于EPC10的应用系统
基于EPC10的应用系统
基本应用系统(HEKA系列) (EPC10放大器+EPCMaster)+PatchMaster
扩展应用系统(第三方系列) (EPC10放大器+EPCMaster)+定制开发的记录软件 Flyion Screen 8500 Ionovation Bilayer system Nanion Port-A-Patch system DL ExPatch System
这些分析结果可进一步去FitMaster中做曲线拟合。
数据Export
把原始的sweep的Trace输出。 把在线分析的结果输出。 输出到IGOR分析软件中进行作图等操作。
综合分析软件Igor/DAC/PPT
分析软件FitMaster
分析软件FitMaster
FitMaster的分析功能介绍
东乐科技有限公司
DL INSTRUMENTS, INC.
第七届膜片钳技术培训班
2010.8.1 南昌大学
测量的位置：胞内/膜上/胞外
Recording Principle
Extracellular (Action potentials)
Patch-clamp Intracellular
(transmembrane potential)
提供2个 OnlineWindow 提供最多12个坐标 轴
每个坐标轴中可提 供最多4个曲线图。
PGF窗体和OnlineAnalysis窗体
把PGF窗体中的Analysis和OnlineAnalysis窗体的 Analysis挂钩。实现数据采集和回放时的在线分 析。
或者直接使用OnlineAnalysis窗体的Analysis分析 回放的数据。
PhotoMetry系统
Configuration窗体
Configuration窗体
Configuration窗体
Replay窗体
PulseGenerator窗体
Protocol Editor窗体
OnlineAnalysis 窗体
Analysis Functions窗体
一个典型的实验过程
ห้องสมุดไป่ตู้
Micro Electrode Array (MEA)
(extracellular fieldpotential)
HEKA EPC10膜片钳放大器(含EPCMaster) 采集软件Patchmaster 分析软件Fitmaster 综合应用:分析软件 Igor/DataAccess/MiniAnalysis/TAC/
(extracellular fieldpotential)
膜电容测量和微碳纤电化学测量
膜电容测量法和微碳纤电化学测量：时间分辨率高 （ms级）。
荧光测钙技术-PhotoImage系统
光解释放技术
EPC10配套的软件
放大器控制软件 EPCMaster(放大器自带) 采集软件PatchMaster 分析软件FitMaster 第三方分析软件
8 探头主机自校准匹配。万一发生故障，可用备用 探头，故障探头可单独返厂维修。
EPC－10功能特点介绍
１放大器面板 ２探头/电极夹持器 ４细胞模型 ５软件控制面板
6 配套的软件
放大器前面板
放大器前面板
放大器探头(Headstage)
１内部包含I/V转换器(电压钳)和 电压跟随器(电流钳) ２探头与放大器主机现场匹配。 ３50 GΩ／500 MΩ／5 MΩ三档切换，
FitMaster的菜单与PatchMaster大致相同。 提供了一个TraceFit窗体。 对若干个Sweep提取特征值，提取的方法 有OnlineAnalysis/多种类型的拟合函数(多 项式/指数/反指数/高斯函数/功率谱/单通道/ 动作电位等等)
TraceFit
FitMaster的分析功能介绍
单通道数据分析软件TAC
综合分析软件Igor/DAC/PPT
谢谢
全局变量：全局变量在整个实验过程中都起作用，使用一 系列全局变量可以完成复杂的计算，然后对如放大器进行 调整，调节采集参数。 。
使用ProtocolEditor实现实验自动化
在线分析OnlineAnalysis
设置在线分析/OnlineAnalysis 窗体
Automatic Stimulus Control: 在采集数据和回放数据时,将检 查其PGF文件中是否指定了对应的OnlineAnalysis方法。如果 定义了且在OnlineAnalysis窗体中有同名的方法，就调用该方 法。如果找不到同名的分析方法，将使用OnlineAnalysis窗体 中高亮的方法。 Use Selected Method：在采集数据或回放任何数据时，忽略 掉PGF文件中指定的方法。无条件调用当前OnlineAnalysis窗 体中高亮的方法。 No Online Analysis : 则将没有在线分析操作。
设置刺激波形/PulseGenerator窗体
实验自动化
使用Macro实现快捷设置
Macro：
可以把操作步骤 能记录下来，类 似于批处理命令。 可以用于调整系 统，完成特殊的 实验，实现某种 程度的自动化。
MACRO-FILE 1 : SET-UP; E Reset E Mode E PulseAmp E PulseDur E CSlow E RSeries E Gain E AutoZero E PulseOn E SaveRpip E Bell 900
使用ProtocolEditor实现实验自动化
ProtocolEditor： 更强大自动化方案。 采用标准方式自动完成各个实验步骤。在每一个步骤中， 可从外部输入、放大器控制、在线分析的结果或用户输入 的数据中反馈得到满足某个条件的结果，来调节实验参数。 这种自适应反馈可通过条件描述“if -then”和全局变量引入。 条件描述：用“if -then”对某个测量结果或外部输入信号进 行逻辑判断，然后决定下一步的执行。这使实验流程更加 智能化，功能也更强大。
2 在TraceFit的基础上，打开“SeriesFit”窗 体。对提取出来的特征数据点进行拟合分 析，例如得到失活曲线/激活曲线/IV曲线等 等。
3 这个级别的拟合函数有：自编公式/多项 式/指数/反指数/波尔滋曼/量效曲线/高斯函 数/I-V曲线/谱拟合等等)
SeriesFit
分析软件Fitmaster