光合细菌的分离与特性研究

光合细菌的分离与特性研究摘要：从华南农业大学水田土壤中经过富集培养和分离筛选，得到 4 株光合细菌，编号为B1~B4。

采用不同培养条件对菌株进行了菌株生长和色素合成情况的观察检测，结果表明，以 3 000 lx 为最优生长光照强度，以厌氧+光照为促进光合色素合成的最佳组合条件。

通过对菌株 B2 的菌落形态、培养特征、菌体形态学观察及生理生化特性测定，初步鉴定其为胶状红长命菌（Rubrivivax gelatinosus），该菌株发酵液对茄子、辣椒的促生作用已初有效果。

关键词：光合细菌；分离；色素合成；生理生化特性Isolation and characteristics study on photosynthetic bacteriasAbstract： Four strains of photosynthetic bacteria numbered from B1 to B4 were isolated from the paddy soil of South ChinaAgricultural University through enrichment culture, isolation and screening. Condition of the growth and pigment synthesis was observed,which showed 3000 lx was the optimum light intensity for growth and anaerobic condition with light had greatest impact on pigmentsynthesis. By enrichment and purification, colonial morphology, culture characteristic and thallus morphology and the determination ofphysiological and biochemical characteristics, strain B2 was identified to be Rubrivivax gelatinosus. Contrast with compound fertilizer,there was an early effect in promoting the growth of eggplant and chili by fertilizing fermentation liquor of strain B2.Key words： photosynthetic bacteria; isolation; pigment synthesis; physiological and biochemical characteristics光合细菌(Photosynthetic bacteria，PSB)是地球上最早出现、自然界中普遍存在、具有原始光能合成体系的原核生物[1]，包括产氧光合细菌(蓝细菌等)和不产氧光合细菌(红螺菌等)，是一类具有相同功能———光合作用的混合菌群。

不同自然环境下，光合细菌具有固氮、脱氮、固碳、硫化物氧化等多种功能[2]，每一种功能都使光合细菌的研究既具理论意义，又具实用价值。

已有研究表明，光合细菌发酵液中含有多种生理活性物质，如叶绿素 a、b，类胡萝卜素，维(尤其是 B 族维生素)，植物激素(如 IAA、GA3、ABA、乙烯、细胞分裂素)和核酸、水杨酸、氨基酸以及单细胞蛋白质、辅酶 Q 和抗病毒因子等[3]。

由于菌体本身无毒，又含有这些营养物质和生理活性物质，使其具有调节微生态平衡、促进动植物生长、增加产量和提高质量等独特的生理功能，光合细菌在农业生产方面有很好的应用价值[4]。

本试验从水田土壤中分离4 株光合细菌进行生长影响因素检测，并对其中能在琼脂平板上快速生长的兼性需氧株B2 进行了基本特性的鉴定，研究此菌株发酵液对农作物的促生作用，以进一步研制光合菌肥制剂。

1 材料与方法1.1 培养条件分离培养基每1 000 mL 水中加入 KH2PO40.5 g，K2HPO40.6 g， (NH4)2SO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaCl22H2O 0.075 g，乙酸钠 1.5 g，酵母膏 0.1 g，微量元素液 1.0 mL (H3BO30.28 g、NaMoO40.075 g、CuSO40.004 g、MnSO40.21 g、ZnSO40.024 g、水 1 000 mL)，pH 为 7.2（±0.2）[5]。

富集培养液设置为分离培养基各营养成分的3 倍。

培养温度选择28℃[6]。

1.2 光合细菌的富集与分离筛选分离源为华南农业大学教学试验农场的水田土壤。

称取水田土壤10 g，加无菌水 50 mL 充分振荡打散，制成悬浊液，与富集营养液按1∶5 比例装人三角瓶中，并覆盖一层无菌液体石蜡(高约 2 cm)，封口，静置于光照培养箱，28℃培养7~14 d，待瓶壁上长出黄、绿、红、紫红等多种不同颜色的菌株，取此菌悬液 1 mL 继续富集培养，持续培养至第 3 代。

采用梯度平板涂布法和梯度倾注厌氧法对光合细菌进行初步筛选，选取长势较好的菌落作进一步平板划线，直至菌株得以分离纯化。

1.3 光照强度对光合细菌生长的影响将光合细菌分离株的菌悬液等量接种于规格统一的富集培养液试管中使初始OD600约为0.2，分别于 1 000、3 000 和 5 000 lx 光照下静置培养，温度28℃；每隔 24 h取样测定OD600，绘制生长曲线。

1.4 光照与氧气对光合细菌合成色素的影响将分离株接种于富集培养液，在 3 000 lx 光照强度培收稿日期：2012-02-23基金项目：国家“973”基础研究发展计划项目（2010CB126502）；教育部新世纪优秀人才支持项目（NCET-07-0315）；高校博士点专项基金项目（206）；广东省科技计划项目（2010B060200017，2010B090400450）作者简介：张茜（1986-），女，在读硕士生，E-mail：zhangqianfsl@通讯作者：彭桂香（1968-），女，博士，副教授，E-mail：gxpeng@sc 广东农业科学2012 年第 9 期112（下转第128 页）表1 不同光照、氧气组合下光合细菌生长过程颜色变化培养条件厌氧光照好氧光照好氧黑暗厌氧黑暗B1澄清→淡黄→黄绿澄清→浅黄→浅绿澄清→黄白澄清B2澄清→红→深粉红澄清→淡红→红澄清→红澄清→淡红B3澄清→浅褐→褐澄清→浅黄→黄褐澄清→黄白澄清B4澄清→红→红褐澄清→黄→红澄清→浅黄→浅黄澄清分离菌株颜色变化养箱和遮光培养箱中分别静置和摇床培养，温度28℃。

于接种后1、3、7 d 观察菌体及培养物颜色变化。

1.5 菌株 B2 的鉴定和基本特性研究参照文献[7-8]，对菌落的形态、细胞形状进行观察，以鉴定分离株；利用本实验室生产的Bio-BIQA 碳源利用板对碳源利用进行测定[9-10]；利用本实验室生产的Bio-BIQB板对抗生素、NaCl 及 pH 的耐受性测定[10]；吲哚试验、明胶液化试验与生长素分泌定性试验参照文献[11-12]。

1.6 菌株 B2 发酵液促生效果研究以普通复合肥为对照，菌株 B2 发酵液为处理，施用在茄子及辣椒作物上，考察菌株 B2 发酵液对作物的促生长作用。

2 结果与分析2.1 光合细菌菌株的筛选选择10-4~10-6 稀释度的平板筛选菌株。

倾注厌氧法平板中的菌株种类多，色泽鲜明，但不易挑取；平板涂布法平板中菌落种类较少，颜色较淡，其中具有不同菌落特征的4 株菌得以分离纯化，保存并分别命名为 B1 (淡绿，点状)、B2(浅红，点状)、B3(浅褐，点状)、B4(红色，饼状)。

2.2 光照强度对光合细菌生长的影响试验结果显示(图 1)，菌株 B1 在 3 种光照强度下均生长欠佳；菌株 B2、B3 则均表现出较高的生长速率，且弱光条件下B2 也能达到较高水平；B4 长势稍差，且不喜强光。

表明光合细菌在不同光照强度下，生长活性有较大差异，且适宜光合细菌生长繁殖的光照强度为3 000 lx，在该光照强度下，菌体对数生长期较长，细胞增殖达到较高数值。

2.3 光照和氧气对光合细菌合成色素的影响由2.1 可知，倾注法厌氧光照培养，菌落具有色泽，说明光照、厌氧是光合细菌合成色素的要素，因此，本试验继续探讨了形成色素的优化培养条件，结果见表1。

表1 显示，光合细菌在黑暗条件下培养，不形成色素物质，且无氧黑暗条件下长势更差；而在光照条件下，长势、色泽均优于黑暗培养，且厌氧培养能使菌株更具光合细菌颜色特征。

光照和厌氧对光和色素合成的影响原因可能是：光照条件下，菌株在生长初始阶段先进行好氧生长并逐渐消耗基质中的氧气，而后在厌氧条件合成色素物质(叶绿素和类胡萝卜素)[13]，这可从这些菌株培养时间越长、菌液颜色越深的现象中证实。

菌株 B1 显色情况差，认为该菌株合成色素可能要求较低的氧化还原电位，只有在严格厌氧和光照下才能合成色素。

由此表明部分光合细菌在厌氧光照条件下由光合磷酸化得到能量，在好氧和黑暗条件下，以有氧呼吸的有机物氧化磷酸化中取得能量，代谢途径可随着环境的变化而进行转换。

2.4 菌株 B2 菌体形态及特征菌株B2 为革兰氏阴性，单个细胞为短杆状(图 2，封三)，二分分裂繁殖。

在光照厌氧、好氧，黑暗好氧及微好氧条件均能生长，光照厌氧液体培养物由最初的浅黄色变为深粉红色，瓶底、瓶壁及液面上形成一层深红色隔氧膜，不随震荡散开而集聚成团。

琼脂平板上菌株也能较快生长，呈浅红至深红色点状菌落，菌落表面微光滑、突起、湿润、有光泽、透明，菌落边缘整齐。

2.5 菌株 B2 理化性质Bio-BIQA 96 孔板中(图 3，封三)，B2 能利用的碳源有吐温40、吐温 80、D-葡萄糖、D-甘露糖、L-果糖、D-果糖、α-酮戊二酸、琥珀酸钠和水杨酸钠。

Bio-BIQB 板结果(图 4，封三)显示，B2 喜碱不喜酸，耐pH 4~10；耐 NaCl 浓度达 4.0%；对300 μg/mL 的氨苄青霉素仍有耐受性；耐庆大霉素、新霉素可达50 μg/mL；而对卡拉霉素、链霉素仅能在5 μg/mL 浓度下生长；低浓度的氯霉素、四环素、红霉素就能抑制菌株 B2 生长。

菌株 B2 的吲哚反应呈阳性，且能分泌生长素IAA，能液化明胶。

2.6 菌株 B2 发酵液促生效果由于未至结果期，尚未开始测量菌株B2 发酵液促生1.21.00.80.60.40.2OD6B1B2B30 24 48 72 96 120时间（h）1.21.00.80.60.40.2OD61.21.00.80.60.40.2OD6B1B2B3B4B1B2B3B40 24 48 72 96 120时间（h）0 24 48 72 96时间（h）A B CA：1000lx；B：3000lx；C：5000lx1 不同光照强度下 4 株菌生长曲线113（上接第 113 页）效果的具体数值。