醛糖还原酶5’端(AC)n二核苷酸重复序列多态性与2型糖尿病合并冠心病相关性

醛糖还原酶5’端（AC）n二核苷酸重复序列多态性与2型糖尿病合并冠心病的相关性[摘要] 目的本研究旨在调查山东地区汉族人群醛糖还原酶（ar）5’端（ac）n二核苷酸重复序列多态性，探讨ar5’端（ac）n重复序列多态性与2型糖尿病（dm）、2型糖尿病合并冠心病（chd）之间的关系。

方法随机选取新诊断2型糖尿病患者74例，2型糖尿病合并冠心病者68例，正常对照组116例。

应用聚合酶链式反应（pcr）、琼脂糖凝胶电泳技术、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术及dna 测序检测ar等位基因，比较各组等位基因分布频率。

结果 3组均发现7种等位基因（z-6～z+6），各组间等位基因分布频率差异无统计学意义。

结论 ar基因5’端（ac）n二核苷酸重复序列多态性等位基因不是糖尿病、糖尿病合并冠心病发病的独立危险因素。

[关键词] 2型糖尿病；醛糖还原酶；基因；多态性；冠心病[中图分类号] r587 [文献标识码] a [文章编号] 2095-0616（2013）15-21-03relationship between an （ac）-n dinucleotide repeat polymorphic marker at 5’ end of the aldose reductase gene and type 2 diabetes mellitus with coronary heart disease xue yamei1 liu changshan2 wang xiujun2 lei peipei11.graduate faculty， weifang medical university， weifang 261053， china；2.department of endocrinology， weifang people’s hospital of shandong province， weifang 261041，china[abstract] objective to investigate ar 5’end （ac）n polymorphism in han nationality population in shandong district，and discuss its relationship between type 2 diabetes （t2dm），type 2 diabetes with coronary heart disease（chd）. methods 74 patients with newly diagnosed type 2 diabetes mellitus， type 2 diabetes mellitus with coronary heart disease in 68 cases， 116 cases of normal control group were randomly selected. polymerase chain reaction （pcr）， agarose gel electrophoresis， polyacrylamide gel electrophoresis and dna sequencing were used to detect ar alleles， allele frequency distribution in each group were compared. results three groups were found seven alleles （z-6～z+6）， there were no obvious difference of allele frequency distribution between groups. conclusion ar 5’end （ac）n polymorphisms may not the independent risk factors for diabetes mellitus，and diabetes combined with coronary heart disease.[key words] type 2 diabetes； aldose reductase； genes；polymorphism； coronary heart disease糖尿病是世界发病率最高慢性病之一。

长期高血糖可引起各种慢性并发症（dcc），包括各种大血管和微血管病变，如冠心病、视网膜病变、糖尿病肾病等，糖尿病性大血管病变是导致糖尿病患者死亡的重要原因之一。

dcc发病机制多种，以醛糖还原酶为限速酶的多元醇代谢途径[1]与dcc有着密切的关系。

微卫星dna具有高度多态性，常作为基因与疾病相关性研究标志，随着研究进展，ar基因5’端微卫星位点多态性与dcc关系受到关注。

大多数学者研究此位点多态性与糖尿病性微血管病变的关系，较少学者研究其与大血管病变的关系。

本研究旨在研究ar 5’端（ac）n二核苷酸重复序列的多态性，及其与糖尿病、糖尿病合并冠心病的关系，进而探讨基因变异在糖尿病导致大血管病变的可能作用。

1 资料与方法1.1 一般资料dm组：按1999年who糖尿病诊断标准，随机选取2012年3月～2013年3月于本院内分泌科新诊断的2型dm患者74例，男41例，女33例，平均年龄（56.1±11.3）岁，无冠心病史及糖尿病肾病、视网膜病变等合并史，心电图无st改变。

dm+chd组：选取2012年3月～2013年3月于本院内分泌科住院的2型糖尿病合并冠心病的患者68例，男39例，女29例，平均年龄（65.0±8.1）岁，糖尿病诊断标准如上，chd诊断标准为冠状动脉造影结果示左主干、左前降支、左回旋支、右冠状动脉至少一支狭窄≥50%。

正常对照组：为健康体检者116例，男59例，女57例，平均年龄（37.7±11.2）岁，口服75 g葡萄糖耐量试验正常。

以上所分3组对象具有对照可比性，均为山东汉族人，彼此之间无血缘关系，排除肝脏疾病、肾病综合征、脑血管病变、糖尿病急性并发症、感染、手术等应激情况，无其他代谢性疾病和恶性肿瘤等。

1.2 方法1.2.1 生化指标测定葡萄糖氧化酶法测定血糖，免疫比浊法测定hba1c，chod-pap法测定tc，gpo-pap法测定tg，spd法测定hdl-c，suk法测定ldl-c。

1.2.2 dna提取用solarbio人全血基因组dna提取试剂盒（离心柱型）从外周血白细胞中提取dna，于-20℃保存。

1.2.3 聚合酶链反应（pcr）（ac）n引物参照文献[2]，pr1（5’-gaatcttaacatgctctgaacc-3’）pr2（5’-gcccagccctatacctagt3’），均由上海生物工程技术服务有限公司合成。

pcr反应体系为25 μl，含dna模板2 μl，上下游引物各1 μl，tag酶0.25 μl，dntp 0.25 μl，10×buffer 2.5 μl，灭菌三蒸水18 μl。

反应参数：94℃始变性5 min，94℃变性30 s，56.3℃退火30 s，72℃延伸2 min，共32个循环，最后于72℃孵育10 min，产物置于4℃保存。

1.2.4 方法取5 μl pcr产物用2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统检测，证实扩增片段是否在预计132～144 kb之间。

然后取5 μl pcr产物进行8%变性聚丙烯酰胺电泳，硝酸银染色，凝胶成像系统检测。

选取基因型为纯合子的dna样本，pcr扩增产物送上海生物工程测序，并将其作为标准，与其他样品pcr产物进行变性聚丙烯酰胺电泳，确定基因型。

1.3 统计学处理统计分析用spss17.0软件完成，计量资料用（），等位基因频率比较用x2检验，p0.05），dm+chd组与dm组相比7种等位基因分布频率差异无统计学意义（p>0.05）。

见表2。

表2 ar基因（ac）n等位基因在各组中分布频率[n（%）]等位基因正常对照组（n=116）dm组（n=74）dm+chd组（n=68）z-6 6（2.59） 4（2.70） 4（2.94）z-4 14（6.03）10（6.76） 4（2.94）z-2 26（11.21） 16（10.81） 14（10.29）z 82（35.34） 54（36.49） 52（38.24）z+2 76（32.76） 50（33.78） 48（35.29）z+4 24（10.34） 18（12.16） 12（8.82）z+6 4（1.72） 2（1.35） 2（1.47）3 讨论ar属于还原性辅酶ⅱ（nadph）依赖型醛-酮还原酶家族，存在于神经、肌肉、肾脏、血管等组织中。

ar可催化多种亲水性的醛还原为相应的醇[3]。

高血糖状态下ar激活导致山梨醇在细胞内的蓄积，扰乱细胞内游离肌醇的利用。

高血糖的毒性以及随其改变的肌醇含量下降和多元醇活性增加、血管通透性改变等是冠脉粥样硬化发生、发展的重要原因，具体机制如下所述[4]：高血糖引起的多元醇活性增加抑制了组织肌醇池水平达到细胞外肌醇水平的能力，导致散在的磷脂酸肌醇池消耗，各种代谢和生物调节过程发生改变，造成血管平滑肌功能紊乱、血管内皮损伤；糖尿病早期出现毛细血管壁细胞损伤，病变血管扩张，邻近正常毛细血管流过的血液减少，细胞逐渐丧失，最后成为无功能血管，因而大血管壁的血液供应出现障碍，供氧不足，最终导致糖尿病大血管病变，尤其主动脉和冠状动脉粥样硬化。

1995年ko等[5]的研究确定了ar基因5’端微卫星位点，发现7种等位基因，其中z-2等位基因与糖尿病视网膜病变早发有关。

陆续有学者对此微卫星位点研究，同样有一些学者发现（ac）n重复序列与2型糖尿病视网膜病变有相关性[6-7]，也有一些学者认为与糖尿病肾病有相关性[8-9]。

多数研究此微卫星位点与糖尿病性微血管病变的关系，研究结果不一。

本研究通过pcr扩增、基因测序等技术对山东地区2型糖尿病患者ar基因5’端二核苷酸重复序列多态性分析，得出7种等位基因为z-6～z+6，这与ko等[5]研究一致。

比较正常对照组、糖尿病组、糖尿病合并冠心病组7种等位基因分布频率，各组间结果差异无统计学意义，说明ar基因5’端二核苷酸重复序列多态性等位基因不是糖尿病、糖尿病合并冠心病的独立危险因素。

糖尿病大血管病变是血糖控制不良、多元醇活性增加、肌醇数量减少，及生活习惯、环境等多方面因素共同作用的结果。

另外本研究ar基因5’端微卫星位点基因多态性与糖尿病性大血管病变无明显相关，可能与样本含量相对较小、人种、地域、环境等有关，我们需完善样本大小、选择不同人种等进一步探讨，以便为以后糖尿病合并冠心病临床治疗在基因水平方面提供更加有效途径。