高效液相色谱法备课资料

第二十章高效液相色谱法

Chapter 20 High performance liquid chromatography

本章讨论高效液相色谱法的主要类型和原理、固定相和流动相及其选择、高效液相色谱仪、高效液相色谱分析方法。本次课将重点讨论前半部分的内容，并注重与常规液相色谱、薄层色谱以及气相色谱的比较复习。

本章的结构编排比气相色谱法合理、流畅。

方法基本构架：经典LC【1964年Giddings发明了高效液相色谱法】

理论参考：GC

传统TLC：

1、缺乏强劲驱动力，达不到“HP”；

2、重现性较差；

3、缺乏通用灵敏的检测器；

4、由此造成的研究、生产投入的不足。

仪器化、自动化差，普及认知率相对低，恶性循环

HPLC：

1、以高压泵产生强劲驱动力，有了“HP”的基础；

2、ODS的问世（50％以上的应用）

3、仪器化、自动化，认知程度不断提高，良性循环（导致更多的优良的SP

的诞生、更灵敏更强大适用面更广的检测器的诞生、仪器性能更稳定更智能）HPLC cf经典LC

1、以高压泵产生强劲驱动力，快速高效（分钟计/小时计）

2、SP颗粒细、均匀，C项小，柱效高（<10um/>100um）

*：TLC都是“离线检测”的方法，结果较粗，效率较低。

GC都是“在线检测”的方法，结果较精密，效率较高。

3、在线检测器种类更多、更灵敏、功能更强大、适用面更广

HPLC cf GC

1、适用样品种类多（80％的有机化合物）

【2、柱效、分析速度稍逊于GC】

3、不受试样挥发性低、热稳定性差的限制

4、HPLC选择MP的余地相对大，GC选择SP的余地相对大

目前HPLC已发展为分析领域一项最重要的分离分析方法，涉及各大行业的各类样品。在药学领域中，在生物样品、中药等复杂体系分析等方面举足轻重！

随着与MS、NMR等联用技术的发展，HPLC的应用将愈加广泛。

第一节高效液相色谱法的主要类型和原理

Classification and principles of HPLC

Ⅰ、Classification of HPLC

色谱法分类【幻灯】

HPLC分类：

手性色谱法-CC是从应用角度分类的，机理上包括分配、吸附或亲和色谱等；

胶束色谱法-MC，电色谱法-EC的机理不属于常规的色谱机理，方法也不常用（见）。

Ⅱ、Bonded phase chromatography（BPC）

BPC：普适，应用最广

化学键合相优势：

固定相不易流失，均一稳定，柱寿命长（GC）

柱效高，分离选择性好

重现性好

化学键合相（chemical bonded phase, 以防止固定液流失），通常以硅胶为载体，表面化学键合了各种极性或非极性的基团，如极性的氨基、氰基，非极性的苯基、十八烷基（著名的C18或ODS）

1 NPC

SP极性[氨基、氰基、二醇基硅胶] > MP极性[有机溶剂]

色谱机理：分配否？吸附否？

分配：把有机键合层看作一层液膜，与MP之间进行分配

吸附：把有机键合层看作硅胶上的“硅醇基类似物”，同样有诱导、氢键等吸附色谱的作用

*：好在两种机理解释的物质洗脱顺序是一致的。

NPC Elution sequence：固定相极性>流动相极性，根据“相似相溶”，极性

大的组分在SP中的溶解性大，在MP中的溶解性小，所以更容易滞留在SP 上，后洗脱。

LSC Elution sequence：强极性组分的占位能力强，与MP竞争SP吸附点位的能力强，即保留时间长，不易被洗脱。

洗脱规律：MP极性增大，竞争分配（吸附）的能力增大，组分k减小，t R 减小

适用范围：溶于有机溶剂①的极性较大②的分子型③化合物

①：如果不溶解则无法用有机溶剂洗脱

③：如果是离子型则强烈吸附于（或分配进）SP，无法洗脱

②：极性较大则易保留，达到选择性分离的效果；如果化合物极性较小，则难保留，宜用RPC。

2 RPC

SP极性[C18，C8，C2，C1，Phen基硅胶] < MP极性[水-有机溶剂]

色谱机理：分配否？吸附否？

各种假设、各种理论，并不重要，关键是理解其洗脱规律！

疏溶剂理论（Δ，了解）

非极性组分或组分中的非极性部分受极性溶剂的排斥→

与非极性烷基缔合“疏溶剂缔合”

组分中的极性部分受极性溶剂的吸引→

与非极性烷基“解缔合”

→“疏溶剂缔合”与“解缔合”的竞争平衡

Horvath公式（经验公式，Δ，了解）

洗脱规律：

（1）溶质结构

溶质极性越弱，“疏溶剂缔合”越强【或“相似相溶”】，k增大，t R增大溶质引入极性基团，“解缔合”增强，k减小，t R减小

（2）MP

①有机溶剂比例

NPC：MP极性增大，与SP竞争分配（吸附）的能力增大，组分k减小，t R减小

RPC：与NPC相反！MP极性增大【甲醇或乙腈量减小而水量增加】，与SP竞争分配（吸附）的能力减小，k增大，t R增大

*：教材阐述的表面张力、介电常数乃一家之言，仅作参考。

“实验表明，k的对数值与流动相中有机溶剂的含量通常是线性关系，有机溶剂含量增加，k值变小”★

lg k∝1/C有机，t R=t0(1+k) 【“预测有机溶剂比例改变之后的保留值变化”有用！】

②pH值变化

pH值变化影响可解离物质的离解状态。离解程度越高，极性越大，k越小，t R越小

∴常用弱酸、弱碱、缓冲溶液调节pH值，抑制其解离，增加其与SP的作用，提高分离选择性和保留时间→ISC

ISC适于3≤pKa≤7的弱酸及7≤pKa≤8的弱碱。

提问：弱酸的pKa若<3，则抑制其解离需要的pH值太小，键合相易被破坏；

同理，弱碱的pKa若>8，则抑制其解离需要的pH值（相对）太大，键合相易被破坏；

提示：键合相的稳定pH偏酸，碱性条件相对易被破坏！

（3）SP

键合烷基长度↑（或浓度↑），疏水作用↑，溶质的k↑

载体（适于在填充柱GC中使用）的钝化：为了去除表面活性作用点，防止拖尾【酸洗法：适于分析酸性化合物；碱洗法：适于分析碱性化合物；硅烷化法（去硅醇基）：适于分析易形成氢键的化合物】

提问：立体位阻，残余硅醇基的吸附作用导致拖尾？

适用范围：非极性至中等极性的组分

提问：强极性组分根本不保留！

据不完全统计：

HPLC解决约80％的化合物分析；

RPC解决HPLC中的约80％的化合物分析（总约64％）

ODS解决RPC中的约80％的化合物分析（总约50％）

3 PIC（esp RP－PIC）

色谱机理：离子对模型

方法核心：给有机酸、碱、盐添加一个疏水的尾巴！

洗脱规律：

（1）离子对试剂的种类和浓度

分析酸或带负电物质：季铵盐，如四丁基季铵磷酸盐

分析碱或带正电物质：烷基磺酸盐，如正戊烷基磺酸钠

离子对试剂的烷基碳链长度↑，形成的离子对极性↓，溶质k↑

离子对试剂的浓度↑，溶质k先↑后↓（形成胶束聚集）

（2）流动相的pH值

pH值使组分完全解离，最有利于完全形成离子对，k最大。

流动相的pH值对弱酸、弱碱的影响大，对强酸、强碱的影响小。

适用范围：有机酸、碱、盐，药物分析中的应用范围广泛，如生物碱、有机酸、维生素类、抗生素类等。

cf 离子交换、离子抑制、离子对色谱

IEC：完全离子化的、离子型化合物

ISC：可离子化的，但离子化程度偏小可抑制的

PIC：可离子化的，且离子化程度偏大难抑制的

Ⅲ、Other kinds of HPLC

1 Ion chromatography（IC）

IC是IEC相同机理的延伸。

许多无机或有机离子无紫外可见吸收，改用电导检测。

单纯用分离柱（即IEC）：亮背景中检测暗线，灵敏度低

分离柱－抑制柱（IC常用模式）：暗背景中检测亮线，灵敏度高

2 Chiral chromatography（cHPLC）

三种方法：CSP、CMP、衍生化

最常规CSP：CD（cyclodextrin），手性柱昂贵！

药物手性普遍存在

手性药物临床意义重大

手性药物分离（制备）与手性药物合成同样挑战

3 Affinity chromatography（AC）

本方法在“色谱概论”章已简单讨论过，分离机理类似免疫反应（抗原－抗体的识别），是所有色谱模式中选择性最高，回收率和纯化效率都很高的方法，是生物大分子分离分析的重要手段。

*：以上IC、cHPLC、AC的固定相在下一节p430有一些描述，有兴趣的可以自行参阅，本课程不再展开，但可以作为综述、述评的内容的一部分！

第二节固定相与流动相

Stationary Phase and Mobile Phase

Ⅰ、Bonded phase（BP）of BPC

固定相基本要求：

（1）颗粒细而均匀（涡流扩散A＝2λd p，λ为不规则因子，d p为颗粒直径）（2）传质快（后面详细讨论）

（3）机械强度高，耐高压

（4）化学稳定性好，不与流动相或组分发生反应

LLC的SP已基本不用（经典LC中还有使用）；

LSE的SP（多孔硅胶与高分子微球）较少用；

∴本节主要讨论BP（不包括“IC、cHPLC、AC的固定相”）

1 Types of bonded phase

（1）non－polar BP：RPC

C18，C8，C2，C1，Phen基硅胶

键合烷基长度↑（或浓度↑），疏水作用↑，溶质的k↑

言下之意：长链烷基可使溶质的k↑（分离时间长），分离选择性改善，稳定性也更好；

短链烷基使分离时间短（快速分离），当然选择性下降

苯基键合相较适合于选择性分离芳香化合物

（2）weak polar BP：RPC or NPC

醚基或醇基，较少用

（3）polar BP：NPC（RPC）

氰基、氨基硅胶

氰基：氰乙硅烷基，选择性与硅胶类似，更适合于选择性分离双键化合物(苯基键合相较适合于选择性分离芳香化合物)。∵氰基硅胶极性>硅胶，∴某些硅胶不能分离的极性化合物可能可以在氰基硅胶上分离。

氨基：偏碱性，不同于酸性的硅胶，适合于选择性分离多功能基化合物，如糖类化合物；在弱酸性介质中具有弱阴离子交换能力，能分离核苷酸。∵氨基能与醛、酮反应，∴不宜分离羰基化合物，MP中也不得含羰基化合物。

2 Characteristics of bonded phase

（1）bonding reaction

二甲基氯硅烷与硅胶进行硅烷化而制得[高碳ODS键合相]：

*：甲基二氯硅烷产生二硅氧烷键[中碳ODS键合相]

三氯硅烷产生三硅氧烷键[低碳ODS键合相]

提问：哪种键合相的碳含量高？高碳ODS键合相！

提问：高碳ODS键合相的载样量？大！吸附/分配能力？大！组分的保留时间？长！

（2）含碳量(carbon load)和覆盖度(coverage)

单/二/三硅氧烷键：高/中/低碳ODS键合相：40%——5%含碳量

表面覆盖度：p424

提问：哪种键合相的表面覆盖度高？低碳ODS键合相！Why？空间立体位阻小！

残余硅醇基：降低非极性SP的疏水性，使分离机理复杂化（次级吸附），且影响SP的性能稳定性。

封尾：三甲基氯硅烷。

（3）固定相颗粒形状（geometry）（Δ，了解）

（4）ODS的不同类型（Δ，了解）

（5）键合相特点：

①柱子不“娇”，耐溶剂冲洗，不易流失

②化学稳定性、热稳定性好

③表面改性灵活，容易获得重复性产品

④载样量大

注意：

（1）MP的pH值应维持在2 ~ 8

*：<2(2.5)硅氧烷键水解；>8（酸性的）硅胶溶解

*：ISC适于3≤pKa≤7的弱酸及7≤pKa≤8的弱碱

*：某些型号的ODS经过特殊处理，适应的pH值范围宽些

（2）不同厂家、不同批号的同一类型键合相可能有不同的色谱特性

*：硅胶来源及其处理、键合反应、封尾率等工艺无法完全重复

*：报批数据实验应购置同厂家、同批号、同类型的色谱柱备用

*：文献报道的色谱实验条件仅供参考

ISC：

常用弱酸、弱碱、缓冲溶液调节pH值，抑制可解离物质的解离，增加其与SP的作用，提高分离选择性和保留时间。ISC适于3≤pKa≤7的弱酸及7≤pKa

≤8的弱碱。【<2(2.5)硅氧烷键水解；>8（酸性的）硅胶溶解】

PIC conditions（esp RP－PIC）

洗脱规律：

（1）离子对试剂的种类

分析酸或带负电物质：季铵盐，如四丁基季铵磷酸盐

分析碱或带正电物质：烷基磺酸盐，如正戊烷基磺酸钠

离子对试剂的烷基碳链长度↑，形成的离子对极性↓，溶质k↑

p430 表20－4

（2）流动相的pH值

pH值使组分完全解离，最有利于完全形成离子对，k最大。

（3）基本流动相的选择（同RP－HPLC）

有机溶剂（甲醇、乙腈）比例↑，组分k↓

组分疏水性↑，需要的有机溶剂比例↑

Ⅱ、Mobile phase of BPC

流动相基本要求：

（1）不与SP发生化学反应；

（2）对试样有适宜的溶解度，要求k在1～10之间，最好2～5之间（保证在选择性分离的前提下尽可能快地完成分析）；

（3）必须与检测器相适应：如用UV检测时，只能选用截止波长小于检测波长的溶剂；如用MS检测时，则MP中慎用非挥发性盐（污染检测器）

提问：溶剂的截止波长p209?

回答：例如乙醇（常用溶剂）的截止波长为215nm，则检测波长必须大于215nm （4）纯度高、粘度低、溶解气体量低

纯度高：截止波长的考虑（进口HPLC级、国产HPLC级、AR级）柱污染的考虑（微孔滤膜除去固体颗粒）

粘度低：柱压降的考虑

eg：乙醇的粘度（截止波长）>甲醇

溶解气体量低（低压后析出气泡的考虑）：

流速不稳定，保留时间不稳定

气泡干扰检测

严重的，泵空跑，影响使用寿命

1 Effect of MP on separation

HPLC分离条件选择的三个主要方面：固定相（包括填充质量）、流动相种类和配比的选择。

n主要由固定相（包括填充质量）决定；

α主要由溶剂种类决定，溶剂种类改变，分子间作用力不同，可能使两组分的分配系数K变化，使α≠1；

k主要受溶剂配比的影响，配比改变，洗脱强度也改变，组分的分配系数K和容量因子k也改变；

2 Solvent strength and selectivity

（1）Solvent polarity and strength

在BPC中，溶剂洗脱能力＝溶剂强度∽溶剂极性

在NPC中，溶剂极性↑，溶剂洗脱能力（溶剂强度）↑

在RPC中，溶剂极性↑，溶剂洗脱能力（溶剂强度）↓

溶剂极性的表示方法：P’与S（Δ，了解）

表20－1，20－2

在NPC中，水的洗脱能力最大；在RPC中，水的洗脱能力最小；

在RPC中，最常用的两种有机溶剂，乙腈的极性（洗脱能力）稍>（<）甲醇，基本相当。

（2）Strength of mixed solvents

加权和，其权重为体积分数

（3）Solvent selectivity（Δ，了解）

根据溶剂的受质子能力、给质子能力和偶极作用力，将常用溶剂分为8组，处于同一组中的溶剂作用力类型相同，色谱选择性类似。

言下之意：混合MP时，同组的溶剂一般只选1种！（多选基本上对优化无效）

3 MP optimization（Δ，了解）

液相色谱分离条件的优化一直是液相色谱领域比较引人注目的研究课题之一，是实现色谱分离分析智能化和自动化的关键。

由于实验条件与评价指标之间的关系十分复杂，寻找最佳实验条件十分困难，通常需要做大量的试探性实验来寻找尽可能好的实验条件，这样既花费大量的时间，也浪费了不少的材料。

如果能通过少量的试探性实验的分析，能找到最佳的实验条件则是非常有意义的。

优化的目的：

①高效分离（主要）；②快速（次要）

优化的方法：

①解析法和半解析法：窗口图解法、混合液设计统计技术、四面体优化法等等

②黑箱法：单纯形法、遗传算法、人工神经网络算法、模式识别法等等

第三节 分离条件的选择

Section 3 Selection of separation conditions

1 Rate theory in GC

GC 的发展与色谱速率理论的发展密切相关、相互促进。本节再次讨论速率理论在HPLC 的情况。

（1）eddy diffusion 涡流扩散项A

A 与填充物的平均直径dp 的大小和填充不规则因子λ有关，HPLC 一般使用3～10um 的小颗粒固定相，以5um 最常用。常采用球形硅胶，要求粒度均匀（RSD<5％）。

高压匀浆法填充，商品化为主。

s

m C C C +=

（2）longitudinal diffusion 纵向分子扩散项B

γ是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况。Dm 为组分在流动相中扩散系数（cm 2·s -1）。

∵液体中的分子扩散比气体中的扩散小约104，∴液体中的分子扩散忽略不计；

∵HPLC 中的u>u opt ，∴B 项可以忽略不计。

（3）Resistance to mass transfer 传质阻力项C

① 固定相传质阻力Cs 液相【固定相】传质阻力系数C l （填充柱－毛细管GC ）：

由上式看出，固定相的液膜厚度d f 越薄，组分在液相的扩散系数D 1越大，则液相传质阻力就越小。

BPC 的固定相为单分子层，d f 可忽略不计，所以C l （/C S ）可忽略不计。

p

d A λ2=m

D B γ2=

在HPLC 中：

由上式看出，流动相传质阻力与填充物粒度d p 的平方成正比、与组分在流动相中的扩散系数D m 成反比。

③ 静态流动相传质阻力Csm

固定相微孔内的流动相传质阻力Csm ∝d p 2/D m

于是HPLC 中的van Deemter （范氏）方程为：

H ＝A ＋C m u ＋C sm u

∵A ，C m ，C sm 均与d p 正相关，∴d p 越小，柱效越高【当然影响d p 更小的因素是过高的柱压降、更高的颗粒制备与装填工艺】。

∵C m ，C sm 均与D m 负相关，而D m ∝T/η，∴溶剂粘度越小，柱效越高。That’s why 甲醇（η＝0.54）乙腈（η＝0.34）常用而乙醇（η＝1.84）少用。又∴色谱系统的温度越高，柱效越高【当然温度过高，（？）会使k 值减小导致洗脱快而降低选择性，且热不稳定样品与不耐高温的固定相也有些问题！出气泡！】。

*：乙腈的洗脱能力稍<甲醇，乙腈导致的柱效稍>甲醇，基本相当。

综上所述，速率理论指导的HPLC 条件：

① 小而均匀的球形键合相

② 低粘度、适当快速的流动相

③ 适宜的色谱系统（esp 色谱柱）温度

在GC 中，“修正的范氏方程”指出，许多因素是互相制约、互相矛盾的，因此应全面考虑、综合平衡，才能达到较理想的分离效果。 m

p m m D d C /2

ω=

在HPLC中，“修正的范氏方程”指出，除了固定相颗粒越小越好以外，其他因素也是互相制约、互相矛盾的……

第四节HPLC仪器

Section 2 HPLC Instrument

GC：1 Carrier gas system HPLC：1 Carrier liquid system

2 Sample injection system 2 same

3 Column system 3 same

4 Detection system 4 same

5 Data/control system 5 same

Ⅰ、Mobile phase pumping system

? 贮液器

? 高压输液泵

? 梯度洗脱装置

1 MP reservior（补充，Δ，了解）

贮液器即存放洗脱液的容器。常用材料：玻璃、不锈钢等。容积：0.5~2.5升。

流动相脱气：低压脱气法、惰性气体脱气法、超声波脱气法。

2 High pressure pump

高压输液泵的作用是将洗脱液在高压下连续不断地送入柱系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。

高压输液泵基本要求：

?输出压力高且平稳、脉动小，最高压力500kg/cm2

?流量稳定，精度≤1%；流量范围宽，0.01~10ml/min范围内任选

?耐酸碱缓冲液腐蚀

?泵体易于清洗

色谱泵的类型：（补充，Δ，了解）

恒压泵、恒流泵等

图、双活塞泵、往复活塞泵3 Gradient elution apparatus 梯度洗脱装置又称溶剂程序。梯度洗脱中，在同一个分析周期中，按一定程序不断改变流动相的浓度配比或极性配比，可缩短分析周期，提高分析效能，使峰形得以改善，增加灵敏度。梯度洗脱相当于（？）气相色谱的程序升温。

梯度洗脱装置分为：低压梯度洗脱装置、高压梯度洗脱装置。

Ⅱ、Sample injection system

进样系统是将被分析试样导入色谱柱的装置。对进样阀的要求：? 重复性好，死体积小

? 保证中心进样

? 对色谱柱系统流量波动要小

? 便于实现自动化

进样系统包括：取样、进样两个功能。进样方式包括：? 注射器进样

? 阀进样（六通阀6-port-injection-valve进样最为常用）

? 自动进样器进样微量注射器（进样器）使用要点：平头针、排气泡Ⅲ、Separation system

色谱柱是系统的核心部件，一般要求：分离度高、柱容量大、分析速度快。

色谱柱按规格分类：

分析型：

常量：2~5mm(id)×10~30cm

半微量：1~1.5mm(id)×10~20cm

制备型：20~40mm(id)×10~30cm

色谱柱构造图、几种色谱柱图片

柱效检查：

硅胶柱、ODS柱、氰基与氨基柱的方法与要求各不同。

保护柱：（补充，Δ，了解）

用途：收集阻塞柱口的化学垃圾

位置：流路过滤器和分析柱之间

实验后色谱柱的冲洗：（补充，Δ，了解）

硅胶柱：先用甲醇洗去极性杂质，再用干燥的二氯乙烷、正庚烷各100-200ml依次活化

键合相柱：20倍体积的甲醇:氯仿，甲醇:水依次冲洗

Ⅳ、Detection system

基本要求：灵敏度高、稳定性好、线性范围宽、响应快。

1 sensitivity：灵敏度(sensitivity S，响应值)：单位物质的含量通过检测器时

所产生的响应信号变化率。

2 noise and shift：噪音（短时噪音、长时噪音）、漂移

3 detectability：检测限(detectability D，敏感度M):某组分的峰高恰好为噪

音的二倍时，单位时间内载气引入检测器中该组分的质量或单位体积载气中所含该组分的量称检测限。

检测器主要性能：教材p433

1 ultraviolet detector

紫外检测器的优点：

①灵敏度高；噪音低，最低检出量可达10-7~10-12g

②不破坏样品，能与其它检测器串联，可用于制备

③对温度及流动相流量波动不敏感，可用于梯度洗脱

紫外检测器的缺点：

①被测物必须有紫外吸收

②流动相选择有一定限制，流动相的截止波长必须小于检测波长

紫外检测器的类型：

①固定波长检测器

为光源波长固定的光度计，一般波长是254nm。多数芳香族、芳杂环、稠芳环类以及芳香氨基酸、核酸等在此处都有吸收，且e大，灵敏度高。

②可变波长检测器

是一台紫外分光光度计，波长可按需要任意选择。是当前HPLC仪器配置最多的检测器。

③光二极管阵列检测器

可在短时间内同时获得样品色谱图及每个组分的光谱图。

2 fluorescence detector(FD略)

*：灵敏度、选择性更高，体内药物分析的常用检测器。

*：无紫外亦无荧光。

3 electrochemical detector(ECD略)

*：灵敏度很高，体内药物分析的常用检测器。

*：稳定性不佳

*：只对有redox活性的化合物有响应，非通用检测器

*：勿与GC的“电子捕获检测器”混淆

4 evaporative light scattering detector(ELSD)

工作原理：散色光强度与气溶胶中组分的质量有相关关系。

*：通用检测器（相对于专属检测器）：无紫外、无redox活性的几乎所有化合物。

*：唯二要求：化合物挥发性低于流动相的组分（好在大部分化合物的挥

发性比甲醇、水等的挥发性低）

流动相挥发性，不得含缓冲盐

*：缺点：灵敏度较低（比UV低约一个数量级）

Ⅴ、Data/control system

记录仪→电脑（软件）记录→电脑控制（软、硬件）【色谱工作站】→智能化：色谱专家系统

→规范化：GMP/GLP规范、CFR21