高效液相色谱法备课资料
高效液相色谱分析实验讲义
高效液相色谱分析实验一、实验目的1．了解HPLC仪器的基本构造和工作原理，掌握HPLC的基本操作2．学习苯-甲苯混合物的定性分析方法3．评价色谱柱效4．了解色谱定量操作的主要方法以及各自特点；5．学习未知样品的定量分析方法。
二、实验原理不同组分因在互不相溶的流动相与固定相中的分配比不同，当两相做相对运动时，组分在两相之间反复进行多次分配，最终实现不同组分的分离。
色谱仪器的构成：包括高压输液系统、进样系统、分离系统，检测系统等1．色谱定性分析方法（1）利用保留值与已知物对照定性A 保留时间定性 b 峰高增量定性 C 其他方法定性（保留值经验规律定性，文献保留数据定性）2．色谱定量分析方法⑴校正因子：a绝对校正因子；b 相对校正因子。
⑵常见的色谱定量分析方法主要有：a 归一化法。
特点：简单、方便、准确，但要求所有组分必须全部出峰。
b内标法。
特点：使用相对校正因子定量，结果准确，但操作繁琐，由于需要增加内标物，增大分离的难度。
c 标准曲线法（外标法）。
简单、方便，由于采用绝对校正因子定量，结果受到操作技术因素以及具体色谱条件影响较大。
d 内标标准曲线法。
三、仪器与试剂LC-1000型高效液相色谱仪P3000A-UV3000型高效液相色谱仪甲醇(色谱纯) 二次去离子水苯甲苯苯－甲苯四、高效液相色谱仪操作步骤1. 流动相的预处理用甲醇和二次去离子水配成500 mL (V/V=90:10)的甲醇溶液，用0.45μm 有机滤膜过滤，超声波清洗器脱气10～20 min，装入流动相贮液瓶。
2. 苯-甲苯混合试样和苯、甲苯标样的准备3. P3000A-UV3000型高效液相色谱仪操作a 依次打开六通阀控制电路、高压输液泵和检测器电源开关；b 打开CHTX3000色谱工作站，在仪器控制面板中，设置波长，点击！，并开灯；c打开三通阀，在仪器控制面板中，设置流速为5ml/min, 启动高压泵，排除流路中的气泡。
排气结束后，点击停止按钮，停止高压泵。
《高效液相》课件
蛋白质分离与纯化
蛋白质分离
高效液相色谱技术可以用于蛋白质的分离和纯化，通过不 同的分离模式和固定相选择，实现对蛋白质的快速分离和 纯化。
蛋白质性质分析
通过高效液相色谱技术可以对蛋白质的性质进行分析，如 蛋白质的分子量、等电点等，为蛋白质的结构和功能研究 提供有力支持。
蛋白质相互作用研究
高效液相色谱技术可以用于研究蛋白质之间的相互作用， 如蛋白质与配体、抑制剂等之间的相互作用，有助于深入 了解蛋白质的功能和作用机制。
原理
利用不同物质在固定相和流动相之间 的分配系数差异进行分离，通过检测 器进行检测，收集各个组分，达到分 析样品组分的目的。
发展历程
01
02
03
04
起源
20世纪初，俄国植物学家茨 维特发明了色谱法。
1940年代
气相色谱法（GC）出现，并 逐渐发展成熟。
1960年代
高效液相色谱法（HPLC）开 始发展，并逐渐取代气相色谱
02
高效液相色谱仪
仪器组成
进样器
将样品注入色谱柱，是 色谱仪的重要部件之一
。
色谱柱
用于分离样品中的各组 分，由固定相和流动相
组成。
检测器
检测色谱柱流出的组分 ，并将其转换为电信号
。
数据处理系统
用于采集、处理和显示 检测器输出的信号。
重要部件介绍
01
02
03
色谱柱填料
常用的填料有硅胶、氧化 铝、活性炭等，根据不同 分离需求选择合适的填料 。
《高效液相》ppt课件
目录
• 高效液相色谱法简介 • 高效液相色谱仪 • 高效液相色谱分离技术 • 高效液相色谱在生物医药领域的应用 • 高效液相色谱实验技术 • 高效液相色谱技术前沿与展望
《高效液相色谱培训》课件
3 柱温控制及常见问题解决方法
详细介绍柱温控制的重要性以及常见问题的解决方法。
二、方法优化
1
流动相的优化与选择
教授流动相的组成与优化方法，以及选择
色谱条件的优化与调整
2
合适流动相的技巧。
分享优化色谱条件和调整方法，以提高分
离效果和分析效率。
3
常见问题与解决方法示例
样品的制备和处理
详细介绍高效液相色谱实验中样品制备和处理的关键步骤。
谱条件设置与调整
指导合理设置色谱条件和对色谱图进行调整，以获得最佳结果。
岗位操作流程及安全要求
说明高效液相色谱岗位的操作流程和实验室安全要求。
五、实验结果分析
1
峰形参数与定量分析
2
探讨峰形参数在定量分析中的作用以及如
何优化峰形。
3
《高效液相色谱培训》 PPT课件
# 高效液相色谱培训
液相色谱是一种广泛应用于化学和生物分析领域的分离技术。本课程将带您 深入了解高效液相色谱的基础知识、方法优化、常见应用、实验操作以及实 验结果的分析与报告撰写。
一、基础知识
1 高效液相色谱简介
介绍高效液相色谱的基本原理、仪器设备和常见术语。
2 色谱柱类型与选择
提供一些常见问题及相应的解决方法示例， 帮助您更好地处理实际应用中的困难。
三、常见应用
药物分析应用
讨论高效液相色谱在药物分析领域 的应用案例和技术要点。
生物大分子分离及分析应用
介绍高效液相色谱在生物大分子分 离和分析方面的重要应用。
环境监测应用
探讨高效液相色谱在环境监测中的 关键应用和技术趋势。
四、实验操作
高效液相色谱法指导培训讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
高效液相色谱法指导培训 讲义
胶束色谱(micellar chromatography)
• 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
• 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。
过滤——用滤膜 脱气——采用
过滤或垂熔漏斗 超声或过滤的方
过滤
法
冲洗
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
▪进样阀
高效液相色谱法指导培训 讲义
定量圈 1
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
大学高效液相教案模板
教学目标：1. 理解高效液相色谱技术的原理和基本操作步骤；2. 掌握高效液相色谱仪的结构和主要部件；3. 学会高效液相色谱法的应用和数据处理方法；4. 培养学生独立操作和解决问题的能力。
教学内容：1. 高效液相色谱技术的基本原理2. 高效液相色谱仪的结构和主要部件3. 高效液相色谱法的应用4. 高效液相色谱法的数据处理教学过程：一、导入1. 引入高效液相色谱技术在我国科研、工业等领域的重要性；2. 引导学生思考高效液相色谱技术在食品、药品、环境等方面的应用。
二、高效液相色谱技术的基本原理1. 介绍高效液相色谱法的原理，如吸附色谱、分配色谱等；2. 讲解高效液相色谱法的操作步骤，如样品制备、流动相选择、柱温控制等；3. 分析影响高效液相色谱法分离效果的因素，如柱子、流动相、检测器等。
三、高效液相色谱仪的结构和主要部件1. 介绍高效液相色谱仪的组成，如泵、进样阀、色谱柱、检测器等；2. 讲解各部件的功能和作用；3. 分析高效液相色谱仪的工作原理。
四、高效液相色谱法的应用1. 介绍高效液相色谱法在食品、药品、环境等领域的应用实例；2. 分析实际应用中高效液相色谱法的优势和局限性。
五、高效液相色谱法的数据处理1. 讲解高效液相色谱法的数据处理方法，如峰面积积分、保留时间等；2. 介绍数据处理软件的使用方法；3. 分析数据处理结果在科研、工业等领域的应用。
六、实验操作与练习1. 安排学生分组进行实验操作，如样品制备、高效液相色谱仪操作等；2. 指导学生解决实验过程中遇到的问题；3. 鼓励学生总结实验结果，撰写实验报告。
七、总结与拓展1. 总结高效液相色谱技术的原理、应用和数据处理方法；2. 拓展高效液相色谱技术在其他领域的应用前景；3. 引导学生思考高效液相色谱技术的发展趋势。
教学评价：1. 学生对高效液相色谱技术的原理、应用和数据处理方法的掌握程度；2. 学生在实验操作中的独立操作能力和解决问题的能力；3. 学生撰写实验报告的质量和深度。
高效液相色谱法培训课件
进样方法
整个定量圈体积进样——为获得好的精密度， 进样量应大于定量圈量的2-5倍以上。由于
层流影响，需要有过量的样品液来取代管
壁上的流动相（见下图）。
Sample
Mobile phase
部分定量圈体积进样——当样品量少时， 采用部分体积进样，进样量由微量注射器 手动控制，要求：
不得超过定量圈体积的1/2量
最高操作温度60 ℃，最佳温度 ﹤40℃。
分离碱性物质，所用流动相pH值应高于被 测物pKa一个单位。
ZORBAX RP-HPLC系列柱的使用条件
柱
pH范围
最高温度
SB C18
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
C8
C3 苯基
腈基
XDB
Extend-C18
90℃ 60℃ 60℃ 60℃ 60℃ 60℃ 60℃
喷雾 蒸发 检测
色谱柱流出物
N2
组分的 气溶胶
溶剂 光 源
泵
pH
酸若性注 。调的意
节，： 不流
可能动 用含相 氨缓必 水冲须 、盐是 醋，挥
发
质 谱 检 测 器
Flu
10%
Ms
1%
other 4%
Conduc 5%
Elec 7%
Refra 8%
DAD 22%
检
测
器
UV-VIS
使
43% 用
统
计
色谱柱
注意！
一旦柱压升高，应停止测定，用水 冲洗数小时或更长时间，待压力下降后 再测定，如果不清楚堵在哪一段，则应 逐级检查，换泵头上滤芯，保护柱等。
柱效低的原因 频繁更换流动相组成——加速柱效降低。
《高效液相色谱分析》课件
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成
高效液相色谱法教案
高效液相色谱法教案
一、课时安排
课时安排| 教学内容
1 | 液相色谱基础知识介绍
2 | 实验工艺要求及操作细节介绍
3 | 数据分析与结果评价
二、教学目标
1. 掌握高效液相色谱的原理及实验步骤；
2. 学会如何用高效液相色谱检测物质的实验方法；
3. 能够正确评价液相色谱的结果和数据分析；
4. 掌握液相色谱在实际生产中的应用。
三、教学内容
1. 高效液相色谱的原理及实验步骤：
介绍高效液相色谱的操作原理，建立色谱柱，确定检测射入方式，调节pH值，控制升温排量率，调节流速等步骤；
2. 实验工艺要求及操作细节介绍：
通过理论讲解及实际操作，让学生熟练掌握操作和实验注意事项；
3. 数据分析与结果评价：
通过给出的数据让学生灵活分析，结合实际情况，来判断实验的成果是否达到要求，进行正确评价。
四、活动组织
以理论讲解结合实实操作的方式，依次完成操作过程和检测结果，批改数据分析结果，综合实验结果判断实验成果。
高效液相色谱法教学精【全】ppt课件
§1-3 色谱柱的分离效率
一、塔板理论 塔板理论认为: 一根柱子可以分为n
段，每段内组分在两相间迅速达到平衡， 把每一段称为一块理论塔板。
设柱长为L，理论塔板高度为H，则
H=L/Ｎ
Ｎ为理论塔板数。
理论塔板数一N
①色谱峰对称 ： N 16(tR )2
说明：
tW
a. 在给定的操作条件下，N几乎相同
三、高效液相色谱法的特点
高压: 以液体作为流动相，液体流经色谱柱时，
受到阻力较大 必须对流动相施加高压。 一般可达到150～300kg／cm2， 甚至可达700kg／cm2以上。
高速:
分析时间较经典液相色谱少得多（交 换速度快），一个复杂样品的分析仅需几 分钟到几十分钟。
高效:
气相色谱的分离效能很高，高效液相 色谱的柱效则更高（化学键合相），一般 约可达 6000理论塔板／米
②一定色谱条件下，对k’有差异的组
分，则柱效愈高，分离效果愈好。
塔板理论的特点和不足：
(1)当L一定时，N 越大(H 越小)，被测组
分在柱内被分配的次数越多，柱效越 高，所得色谱峰越窄。 (2)柱效不能表示被分离组分的实际分离
效果：如两组分的分配系数K 相同，
无论该色谱柱的柱效多大，都无法 分离。
① 柱效较高，ΔK(分配系数)较大，完全分离。 ② ΔK 不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。 ③ 柱效较低，ΔK 较大，但分离的不好。 ④ ΔK 小，柱效低，分离效果更差。
一．分离度的数学表达式：
Rs
2(tR 2 tR1 ) W2 W1
2(tR 2 tR1 )
1.699 [Y1/ 2(2) Y1/ 2(1) ]
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
安捷伦1260高效液相色谱培训课件
D、选择使用适宜的流动相（尤其是PH值），以避免固 定相被破坏。有时候可以在进样器前面连接一预柱， 分析柱是键合硅胶，预柱为硅胶，可是流动相在进入 分析柱之前预先被硅胶饱和，避免分析柱中的硅胶基 质被溶解。
概述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年 代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技 术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极 为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经 典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论， 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏 度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度 高、操作自动化的特点。
•9 •安捷伦1260高效液相色谱培训
E、避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接进入柱内， 需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一 个保护柱，保护柱一般是填有固定相的短柱，保护柱可以 经常更换。 F、经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质 G、保存色谱柱时应将色谱柱中充满乙腈或甲醇，柱接
•4 •安捷伦1260高效液相色谱培训
2、输液泵的使用和维护注意事项 A、防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其他任何杂质 微粒都能磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先 除去流动相中的任何固体微粒； B、流动相不应含有任何腐性物质含有缓冲液的流动相不应 保留在柱内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如 果含有缓冲溶液的流动相在柱内，由于蒸发或泄漏，甚至 由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体。这些晶粒将 损坏密封环和柱塞等。因此，仪器在关机前必须将泵清洗 干净，再换成适合色谱柱保存的和有利于泵维护的溶剂。 C、泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空 泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。 D、输液泵的最高压力不要超过规定的最高压力值，否则会 使高压密封环变形。 E、流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的 稳定。
高效液相色谱法 教案
高效液相色谱法教案一、课程目标：了解高效液相色谱法的基本原理、操作方法及其在实验室中的应用；通过实验操作，掌握高效液相色谱法的基本操作技能，能够熟练操作仪器，准确分析样品。
二、教学内容：1. 高效液相色谱法的基本原理2. 高效液相色谱法的仪器及其组成3. 高效液相色谱法的操作方法4. 高效液相色谱法在实验室中的应用三、教学步骤：1. 高效液相色谱法的基本原理（1）讲解高效液相色谱法的基本原理，包括样品制备、进样、柱填充材料、色谱柱等。
（2）讲解高效液相色谱法的优点，如高分离效率、分析速度快、适用范围广等。
2. 高效液相色谱法的仪器及其组成（1）讲解高效液相色谱法的仪器及其组成，如进样器、柱、泵、检测器、计算机等。
（2）讲解各部分仪器的作用和原理。
3. 高效液相色谱法的操作方法（1）实验前准备工作，包括仪器的开机、检查仪器状态等。
（2）样品的制备和进样操作，包括样品的选取、制备、进样量的确定等。
（3）柱的调试和运行，包括柱的选择、柱效的调试、柱的平衡等。
4. 高效液相色谱法在实验室中的应用（1）讲解高效液相色谱法在实验室中的应用，如药物分析、食品安全检测、环境监测等。
（2）介绍高效液相色谱法的局限性和未来发展方向。
四、教学要点：1. 理解高效液相色谱法的基本原理和优点。
2. 掌握高效液相色谱法的仪器及其组成，了解各部分仪器的作用和原理。
3. 掌握高效液相色谱法的操作方法，包括样品制备和进样、柱的调试和运行等。
4. 了解高效液相色谱法在实验室中的应用和局限性，了解未来发展方向。
五、教学方法：1. 理论讲解与实验演示相结合的教学方式。
2. 重视实验操作技能的培养，强调实验操作的规范性和精确性。
3. 运用多媒体教学手段，加强教学效果。
六、教学评价：1. 实验操作成绩：考核学生实验操作技能的熟练程度和实验数据分析能力。
2. 课堂测试：考核学生对高效液相色谱法基本原理、仪器及其组成、操作方法等方面的掌握程度。
第十一章高效液相色谱法教材
➢ 高效：柱填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀，传质 阻力小，因而柱效高，数分钟完成数百物质的分离；
➢ 高灵敏度：紫外检测器最小检测量 10-9g，荧光检测器灵
敏度可达10-11g。
操作条件：室温、高压。
11.3 HPLC的分类与基本原理
14.3.1高效液相色谱法的分类
HPLC
按固定 相分类
按分离 机理分类
液液色谱法LLC 液固色谱法LSC
分配色谱法 吸附色谱法 离子交换色谱法 分子排阻色谱法 化学键合色谱法 亲合色谱法 胶束色谱法
7
一、液液分配色谱法（LLC） 二、液固吸附色谱法（LSC） 三、化学键合相色谱法（CBC） 四、离子对色谱法 五、离子色谱法
内梯度: 2台高压泵, 每台泵输送一种溶剂，配比由设定的程序控制。多种 溶剂混合前分别由泵增压入梯度混合室，混合后进入柱系统。
34
35
3．进样系统
手动进样
36
自动进样器进样
自动进样的样品量可连续调节，进样重复性 高，适合做大量样品分析。
37
4. 分离系统——色谱柱
➢ 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。
激发波长(ex)和发射波长(em)的
选择；如菲、芘和苯并a芘的激发波长
：280、333 和365 nm；发射波长
350、390和410 nm
44
11.6 高效液相色谱的应用
➢ 在食品研究中的分析应用
食品中的天然成分
✓ 碳水化合物
✓ 类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇
✓ 脂肪酸和有机酸
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
高效液相色谱--仪器分析实验教案
Agilent HPLC仪
色谱柱：
流动相：甲醇：水=8：2
流速：1.0 mL/min
检测波长：254nm
进样体积：10μL
4进样、采集色谱图。
1）三组分混标液
2）标准溶液系列
3）未知样品
5色谱数据分析，打印色谱图及分析报告。
6更换甲醇流动相，清洗色谱柱。
7关闭仪器。
（五）提问
1、高效液相色谱溶液配制需要注意哪些操作？
三组分混标液：每mL溶液分别含5 uL苯、甲苯和丙酮。
分别准确移取0、2.50、5.00、10.00和20.00 uL甲苯容易溶于1.00mL甲醇中。
2流动相的配制、过滤和除气。
标准苯测试液。
未知样品1号、2号、3号和4号。
B、上机测定
1更换流动相。
2按操作规定开动仪器，排气后让色谱柱平衡（流动性为80%甲醇，速度1.0 mL/min）。
答：药品需要色谱纯的；配制好的溶液需要抽气处理——这步操作有些高效液相色谱能自动完成。
2、利用高效液相色谱进行定量和定性分析的依据有哪些？
答：定性分析根据相同色谱系统下同一物质的保留时间相同；定量分析的依据是在一定浓度范围内，浓度与峰面积(或峰高)成正比。
（六）数据记录与结果处理
确定样品内的物质，确定样品中甲苯的浓度。
三、主要仪器和试剂
主要仪器：安捷伦1260液相色谱仪，配有紫外检测器，Phenomenex ODS柱]；1自动进样器。
试剂：色谱纯甲苯、苯、丙酮、甲醇、超纯水；
未知样品1、2、3、4。
教学内容及过程
（一）检查实验预习报告
（二）上次实验存在的问题
（三）高效液相色谱操作
（四）实验内容及步骤
高效液相色谱法备课资料
⾼效液相⾊谱法备课资料第⼆⼗章⾼效液相⾊谱法Chapter 20 High performance liquid chromatography本章讨论⾼效液相⾊谱法的主要类型和原理、固定相和流动相及其选择、⾼效液相⾊谱仪、⾼效液相⾊谱分析⽅法。
本次课将重点讨论前半部分的内容，并注重与常规液相⾊谱、薄层⾊谱以及⽓相⾊谱的⽐较复习。
本章的结构编排⽐⽓相⾊谱法合理、流畅。
⽅法基本构架：经典LC【1964年Giddings发明了⾼效液相⾊谱法】理论参考：GC传统TLC：1、缺乏强劲驱动⼒，达不到“HP”；2、重现性较差；3、缺乏通⽤灵敏的检测器；4、由此造成的研究、⽣产投⼊的不⾜。
仪器化、⾃动化差，普及认知率相对低，恶性循环HPLC：1、以⾼压泵产⽣强劲驱动⼒，有了“HP”的基础；2、ODS的问世（50％以上的应⽤）3、仪器化、⾃动化，认知程度不断提⾼，良性循环（导致更多的优良的SP的诞⽣、更灵敏更强⼤适⽤⾯更⼴的检测器的诞⽣、仪器性能更稳定更智能）HPLC cf经典LC1、以⾼压泵产⽣强劲驱动⼒，快速⾼效（分钟计/⼩时计）2、SP颗粒细、均匀，C项⼩，柱效⾼（<10um/>100um）*：TLC都是“离线检测”的⽅法，结果较粗，效率较低。
GC都是“在线检测”的⽅法，结果较精密，效率较⾼。
3、在线检测器种类更多、更灵敏、功能更强⼤、适⽤⾯更⼴HPLC cf GC1、适⽤样品种类多（80％的有机化合物）【2、柱效、分析速度稍逊于GC】3、不受试样挥发性低、热稳定性差的限制4、HPLC选择MP的余地相对⼤，GC选择SP的余地相对⼤⽬前HPLC已发展为分析领域⼀项最重要的分离分析⽅法，涉及各⼤⾏业的各类样品。
在药学领域中，在⽣物样品、中药等复杂体系分析等⽅⾯举⾜轻重！随着与MS、NMR等联⽤技术的发展，HPLC的应⽤将愈加⼴泛。
第⼀节⾼效液相⾊谱法的主要类型和原理Classification and principles of HPLCⅠ、Classification of HPLC⾊谱法分类【幻灯】HPLC分类：⼿性⾊谱法-CC是从应⽤⾓度分类的，机理上包括分配、吸附或亲和⾊谱等；胶束⾊谱法-MC，电⾊谱法-EC的机理不属于常规的⾊谱机理，⽅法也不常⽤（见）。
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第二十章高效液相色谱法Chapter 20 High performance liquid chromatography本章讨论高效液相色谱法的主要类型和原理、固定相和流动相及其选择、高效液相色谱仪、高效液相色谱分析方法。
本次课将重点讨论前半部分的内容，并注重与常规液相色谱、薄层色谱以及气相色谱的比较复习。
本章的结构编排比气相色谱法合理、流畅。
方法基本构架：经典LC【1964年Giddings发明了高效液相色谱法】理论参考：GC传统TLC：1、缺乏强劲驱动力，达不到“HP”；2、重现性较差；3、缺乏通用灵敏的检测器；4、由此造成的研究、生产投入的不足。
仪器化、自动化差，普及认知率相对低，恶性循环HPLC：1、以高压泵产生强劲驱动力，有了“HP”的基础；2、ODS的问世（50％以上的应用）3、仪器化、自动化，认知程度不断提高，良性循环（导致更多的优良的SP的诞生、更灵敏更强大适用面更广的检测器的诞生、仪器性能更稳定更智能）HPLC cf经典LC1、以高压泵产生强劲驱动力，快速高效（分钟计/小时计）2、SP颗粒细、均匀，C项小，柱效高（<10um/>100um）*：TLC都是“离线检测”的方法，结果较粗，效率较低。
GC都是“在线检测”的方法，结果较精密，效率较高。
3、在线检测器种类更多、更灵敏、功能更强大、适用面更广HPLC cf GC1、适用样品种类多（80％的有机化合物）【2、柱效、分析速度稍逊于GC】3、不受试样挥发性低、热稳定性差的限制4、HPLC选择MP的余地相对大，GC选择SP的余地相对大目前HPLC已发展为分析领域一项最重要的分离分析方法，涉及各大行业的各类样品。
在药学领域中，在生物样品、中药等复杂体系分析等方面举足轻重！随着与MS、NMR等联用技术的发展，HPLC的应用将愈加广泛。
第一节高效液相色谱法的主要类型和原理Classification and principles of HPLCⅠ、Classification of HPLC色谱法分类【幻灯】HPLC分类：手性色谱法-CC是从应用角度分类的，机理上包括分配、吸附或亲和色谱等；胶束色谱法-MC，电色谱法-EC的机理不属于常规的色谱机理，方法也不常用（见）。
Ⅱ、Bonded phase chromatography（BPC）BPC：普适，应用最广化学键合相优势：固定相不易流失，均一稳定，柱寿命长（GC）柱效高，分离选择性好重现性好化学键合相（chemical bonded phase, 以防止固定液流失），通常以硅胶为载体，表面化学键合了各种极性或非极性的基团，如极性的氨基、氰基，非极性的苯基、十八烷基（著名的C18或ODS）1 NPCSP极性[氨基、氰基、二醇基硅胶] > MP极性[有机溶剂]色谱机理：分配否？吸附否？分配：把有机键合层看作一层液膜，与MP之间进行分配吸附：把有机键合层看作硅胶上的“硅醇基类似物”，同样有诱导、氢键等吸附色谱的作用*：好在两种机理解释的物质洗脱顺序是一致的。
NPC Elution sequence：固定相极性>流动相极性，根据“相似相溶”，极性大的组分在SP中的溶解性大，在MP中的溶解性小，所以更容易滞留在SP 上，后洗脱。
LSC Elution sequence：强极性组分的占位能力强，与MP竞争SP吸附点位的能力强，即保留时间长，不易被洗脱。
洗脱规律：MP极性增大，竞争分配（吸附）的能力增大，组分k减小，t R 减小适用范围：溶于有机溶剂①的极性较大②的分子型③化合物①：如果不溶解则无法用有机溶剂洗脱③：如果是离子型则强烈吸附于（或分配进）SP，无法洗脱②：极性较大则易保留，达到选择性分离的效果；如果化合物极性较小，则难保留，宜用RPC。
2 RPCSP极性[C18，C8，C2，C1，Phen基硅胶] < MP极性[水-有机溶剂]色谱机理：分配否？吸附否？各种假设、各种理论，并不重要，关键是理解其洗脱规律！疏溶剂理论（Δ，了解）非极性组分或组分中的非极性部分受极性溶剂的排斥→与非极性烷基缔合“疏溶剂缔合”组分中的极性部分受极性溶剂的吸引→与非极性烷基“解缔合”→“疏溶剂缔合”与“解缔合”的竞争平衡Horvath公式（经验公式，Δ，了解）洗脱规律：（1）溶质结构溶质极性越弱，“疏溶剂缔合”越强【或“相似相溶”】，k增大，t R增大溶质引入极性基团，“解缔合”增强，k减小，t R减小（2）MP①有机溶剂比例NPC：MP极性增大，与SP竞争分配（吸附）的能力增大，组分k减小，t R减小RPC：与NPC相反！MP极性增大【甲醇或乙腈量减小而水量增加】，与SP竞争分配（吸附）的能力减小，k增大，t R增大*：教材阐述的表面张力、介电常数乃一家之言，仅作参考。
“实验表明，k的对数值与流动相中有机溶剂的含量通常是线性关系，有机溶剂含量增加，k值变小”★lg k∝1/C有机，t R=t0(1+k) 【“预测有机溶剂比例改变之后的保留值变化”有用！】②pH值变化pH值变化影响可解离物质的离解状态。
离解程度越高，极性越大，k越小，t R越小∴常用弱酸、弱碱、缓冲溶液调节pH值，抑制其解离，增加其与SP的作用，提高分离选择性和保留时间→ISCISC适于3≤pKa≤7的弱酸及7≤pKa≤8的弱碱。
提问：弱酸的pKa若<3，则抑制其解离需要的pH值太小，键合相易被破坏；同理，弱碱的pKa若>8，则抑制其解离需要的pH值（相对）太大，键合相易被破坏；提示：键合相的稳定pH偏酸，碱性条件相对易被破坏！（3）SP键合烷基长度↑（或浓度↑），疏水作用↑，溶质的k↑载体（适于在填充柱GC中使用）的钝化：为了去除表面活性作用点，防止拖尾【酸洗法：适于分析酸性化合物；碱洗法：适于分析碱性化合物；硅烷化法（去硅醇基）：适于分析易形成氢键的化合物】提问：立体位阻，残余硅醇基的吸附作用导致拖尾？适用范围：非极性至中等极性的组分提问：强极性组分根本不保留！据不完全统计：HPLC解决约80％的化合物分析；RPC解决HPLC中的约80％的化合物分析（总约64％）ODS解决RPC中的约80％的化合物分析（总约50％）3 PIC（esp RP－PIC）色谱机理：离子对模型方法核心：给有机酸、碱、盐添加一个疏水的尾巴！洗脱规律：（1）离子对试剂的种类和浓度分析酸或带负电物质：季铵盐，如四丁基季铵磷酸盐分析碱或带正电物质：烷基磺酸盐，如正戊烷基磺酸钠离子对试剂的烷基碳链长度↑，形成的离子对极性↓，溶质k↑离子对试剂的浓度↑，溶质k先↑后↓（形成胶束聚集）（2）流动相的pH值pH值使组分完全解离，最有利于完全形成离子对，k最大。
流动相的pH值对弱酸、弱碱的影响大，对强酸、强碱的影响小。
适用范围：有机酸、碱、盐，药物分析中的应用范围广泛，如生物碱、有机酸、维生素类、抗生素类等。
cf 离子交换、离子抑制、离子对色谱IEC：完全离子化的、离子型化合物ISC：可离子化的，但离子化程度偏小可抑制的PIC：可离子化的，且离子化程度偏大难抑制的Ⅲ、Other kinds of HPLC1 Ion chromatography（IC）IC是IEC相同机理的延伸。
许多无机或有机离子无紫外可见吸收，改用电导检测。
单纯用分离柱（即IEC）：亮背景中检测暗线，灵敏度低分离柱－抑制柱（IC常用模式）：暗背景中检测亮线，灵敏度高2 Chiral chromatography（cHPLC）三种方法：CSP、CMP、衍生化最常规CSP：CD（cyclodextrin），手性柱昂贵！药物手性普遍存在手性药物临床意义重大手性药物分离（制备）与手性药物合成同样挑战3 Affinity chromatography（AC）本方法在“色谱概论”章已简单讨论过，分离机理类似免疫反应（抗原－抗体的识别），是所有色谱模式中选择性最高，回收率和纯化效率都很高的方法，是生物大分子分离分析的重要手段。
*：以上IC、cHPLC、AC的固定相在下一节p430有一些描述，有兴趣的可以自行参阅，本课程不再展开，但可以作为综述、述评的内容的一部分！第二节固定相与流动相Stationary Phase and Mobile PhaseⅠ、Bonded phase（BP）of BPC固定相基本要求：（1）颗粒细而均匀（涡流扩散A＝2λd p，λ为不规则因子，d p为颗粒直径）（2）传质快（后面详细讨论）（3）机械强度高，耐高压（4）化学稳定性好，不与流动相或组分发生反应LLC的SP已基本不用（经典LC中还有使用）；LSE的SP（多孔硅胶与高分子微球）较少用；∴本节主要讨论BP（不包括“IC、cHPLC、AC的固定相”）1 Types of bonded phase（1）non－polar BP：RPCC18，C8，C2，C1，Phen基硅胶键合烷基长度↑（或浓度↑），疏水作用↑，溶质的k↑言下之意：长链烷基可使溶质的k↑（分离时间长），分离选择性改善，稳定性也更好；短链烷基使分离时间短（快速分离），当然选择性下降苯基键合相较适合于选择性分离芳香化合物（2）weak polar BP：RPC or NPC醚基或醇基，较少用（3）polar BP：NPC（RPC）氰基、氨基硅胶氰基：氰乙硅烷基，选择性与硅胶类似，更适合于选择性分离双键化合物(苯基键合相较适合于选择性分离芳香化合物)。
∵氰基硅胶极性>硅胶，∴某些硅胶不能分离的极性化合物可能可以在氰基硅胶上分离。
氨基：偏碱性，不同于酸性的硅胶，适合于选择性分离多功能基化合物，如糖类化合物；在弱酸性介质中具有弱阴离子交换能力，能分离核苷酸。
∵氨基能与醛、酮反应，∴不宜分离羰基化合物，MP中也不得含羰基化合物。
2 Characteristics of bonded phase（1）bonding reaction二甲基氯硅烷与硅胶进行硅烷化而制得[高碳ODS键合相]：*：甲基二氯硅烷产生二硅氧烷键[中碳ODS键合相]三氯硅烷产生三硅氧烷键[低碳ODS键合相]提问：哪种键合相的碳含量高？高碳ODS键合相！提问：高碳ODS键合相的载样量？大！吸附/分配能力？大！组分的保留时间？长！（2）含碳量(carbon load)和覆盖度(coverage)单/二/三硅氧烷键：高/中/低碳ODS键合相：40%——5%含碳量表面覆盖度：p424提问：哪种键合相的表面覆盖度高？低碳ODS键合相！Why？空间立体位阻小！残余硅醇基：降低非极性SP的疏水性，使分离机理复杂化（次级吸附），且影响SP的性能稳定性。
封尾：三甲基氯硅烷。
（3）固定相颗粒形状（geometry）（Δ，了解）（4）ODS的不同类型（Δ，了解）（5）键合相特点：①柱子不“娇”，耐溶剂冲洗，不易流失②化学稳定性、热稳定性好③表面改性灵活，容易获得重复性产品④载样量大注意：（1）MP的pH值应维持在2 ~ 8*：<2(2.5)硅氧烷键水解；>8（酸性的）硅胶溶解*：ISC适于3≤pKa≤7的弱酸及7≤pKa≤8的弱碱*：某些型号的ODS经过特殊处理，适应的pH值范围宽些（2）不同厂家、不同批号的同一类型键合相可能有不同的色谱特性*：硅胶来源及其处理、键合反应、封尾率等工艺无法完全重复*：报批数据实验应购置同厂家、同批号、同类型的色谱柱备用*：文献报道的色谱实验条件仅供参考ISC：常用弱酸、弱碱、缓冲溶液调节pH值，抑制可解离物质的解离，增加其与SP的作用，提高分离选择性和保留时间。