无抗生素选择系统综述

无抗生素选择系统的发展现状

摘要

在我国，滥用抗生素的现象十分普遍，导致抗生素耐受基因基因的泛滥。其实，不止抗生素的滥用，在一些食品菌的生产、质粒DNA的生产、DNA疫苗的生产等多方面都会使用含抗生素的选择系统，这些都会导致抗生素耐受基因的传播。尤其是在生物药品领域，一种含有抗生素耐受基因载体的重组生物药物是完全不可取的，因此，无抗生素选择系统的发展是势在必行的。本文简介了无抗生素选择系统的发展现状。

关键词：无抗生素选择；耐受基因；DNA疫苗；质粒DNA；重组

The development of Antibiotic-free selection system

Abstract

In China, the widespread abuse of antibiotics leads to the spread of antibiotic resistance genes. In fact,not only the abuse of antibiotics, some bacteria in food production, the production of plasmid DNA and DNA vaccine,all of them will use the antibiotic selection system which can lead to the spread of antibiotic resistance genes. Especially, in the field of bio-medicine, an recombinant biological drug containing antibiotic resistance gene vector is unacceptable totally, and therefore, the development of antibiotic-free selection system is imperative. This article introduced the development of the antibiotic-free selection systems.

Keywords：antibiotic-free selection;Tolerance gene; DNA Vaccine; Plasmid DNA; Restructuring

前言

细菌的每一种耐药机制都由不同的耐药基因所控制，这些耐药基因可由突变产生，也可以通过增殖过程垂直传播，或者通过质粒、噬菌体、转座子等可移动的遗传物质在相同或不同种属细菌间水平传播。环境中细菌耐药基因的存在和抗菌药物的使用是影响细菌耐药性形成和发展的两个主要因素。抗生素耐药性基因的完全缺失是确保在环境中抗生素抗性基因不传播或转化到致病菌株中产生抗性的唯一方法[1]。目前已经试验成功的无抗生素选择系统主要在DNA疫苗和基因药物、食品菌和转基因植物的生产研究等方面。

技术方法

1.DNA疫苗和基因药物

DNA疫苗和基因药物正在成为一种重要的药品类，然而，这种从细菌质粒衍生出来的药物在质粒DNA的分离纯化方面一直是工业化生产的难题，而且由于各种理论安全问题，监管机构一直不建议使用抗生素抗性标记的DNA疫苗。因此，新的无抗生素选择系统的研发已经势在必行。

1.1自溶系统分离质粒DNA

为了解决DNA疫苗在下游纯化方面的难题，Aaron E. Carnes等人研发了一种新颖的宿主菌株在细胞质中表达噬菌体內溶素的自溶大肠杆菌系统。这种系统在发酵过程中通过热诱导启动子诱导表达內溶素。內溶素保留在细胞质中，在细胞壁中肽聚糖基板上分离；因此细胞保持完好，可用通常的方法收获。然后回收的质粒DNA在微酸性环境下自溶提取，低盐缓冲液条件下用低浓度的无离子型去垢剂处理。在这些条件下，大肠杆菌的基因组DNA与不溶性的细胞碎片仍连在一起，然后由固液分离法分理出质粒DNA[2]。

1.2 利用RNA-OUT的系统

为了解决DNA疫苗的抗生素安全问题，Luke等人[3]提出了一种新方法，此方法设计并合成抗原基因克隆到RNA-OUT上编码无抗生素DNA疫苗载体，同时优化提高蛋白的表达和免疫原性，以替代其他卡那霉素抗性的载体。其简要过程为，首先在抗原免疫反应背景下考虑抗原靶向问题，其方法为通过主要组织相容性复合体（MHC）I类或II类基因指导抗原表达；例如ntc868系列RNA-OUT载体系统允许同时克隆到多个载体细胞内的不同的转基因目的地上。然后设计密码子优化和基因合成的详细流程图。最后就是克隆转基因到NTC868系列RNA-OUT载体系统上。最后得到的无抗生素DNA疫苗载体是更有效的卡那霉素抗性标记编码载体的安全替代品。

1.3基于营养缺陷型的新型无抗生素选择系统

1.3.1NAD合成缺陷系统

针对抗生素选择系统的安全问题，不同类型的无抗生素选择系统被不断突出，其中，Dong, WR等人[4]提出了一种新型营养缺陷型互补系统,可以在无抗生素使用的情况下有效地选择宿主细胞和质粒。其基本流程为，在一个大肠杆菌菌株中的染色体上移除喹啉酸尿嘧啶磷酸核糖转移酶(QAPRTase)基因，这样大肠杆菌就携带了NAD合成缺陷基因。质粒中的抗性基因被大肠杆菌的QAPRTase基因取代。结果,只有表达了QAPRTase基因的大肠杆菌宿主细胞可以在基本培养基上生长繁殖。这是第一次一个脊椎动物基因被用于构造无抗生素选择系统,并且它可以广泛应用于DNA疫苗和基因治疗。QAPRTase基因广泛存在于从细菌到哺乳动物的不同物种当中，因此基因的水平转移引起的潜在的环境生物安全问题可以被消除。

1.3.2甘氨酸营养缺陷型互补选择系统

Vidal, L 等人[5]在2008年提出了一种基于甘氨酸营养缺陷型互补原理在大肠杆菌中构建重组质粒来替代抗生素选择标记的方法。利用PCR方法构建一个大肠杆菌M15衍化物的甘氨酸营养缺陷型菌株。这个菌株包含了一个缺失的甘氨酸基因，该基因编码丝氨酸羟甲基转移酶，这是一种在大肠杆菌甘氨酸主生物合成途径中的酶。同时构建一个在弱启动子P3控制下的含有甘氨酸同源基因的pQEαβrham质粒，这样就成功构建了一个互补系统，该系统允许转话体生长在基本培养基中而不需要补充甘氨酸，成功的替代了抗生素选择标记系统。

2.食品菌

在目前形形色色的食品菌当中，乳酸菌是一类生产应用非常广泛的食品菌。作为一种安全型(GRAS)微生物，乳酸菌已经被应用于大量表达一些有价值的酶、抑菌素、次级代谢产物。但是应用于乳酸菌的质粒载体常带有一些氯霉素、红霉素等抗生素抗性基因，带来较大的生物安全隐患，美国FDA等权威机构禁止对GRAS微生物使用抗生素类抗性标记，因此，乳酸菌非抗生素抗性选择标记已成为该领域研究的热点。目前已经研究出了多种不同类型的无抗生素选择系统，根据筛选时质粒和受体菌之间的表型关系及特征，可分为显性选择标记、互补性选择标记、显性/互补型选择标记和双质粒选择标记[6]。

显性选择标记是通过转入带有选择标记基因的质粒，赋予受体菌新的特性，使其能够在相应的选择压力下生长繁殖，从而达到筛选转化子的目的。在乳酸菌分子技术的非抗生素抗性标记的相关研究中主要涉及了细菌素类、重金属抗性、热激蛋白三大类显性选择标记[7]。互补型非抗生素抗性质粒选择标记的受体菌株通常带有代谢途径相关基因的突变，导致突变株在基本培养基上不能生长，只有补充相应的外源营养物质或是转入含有特定选择标记基因的质粒，菌株才能生存。研发成功的主要有糖类营养缺陷互补型选择标记、胸甘酸营养缺陷互补型选择标记和嘌呤、嘧啶营养缺陷互补型选择标记[8]。显性/互补型选择标记，就是既可以作为显性也可以作为互补型的选择标记.，主要有α-半乳糖苷酶选择标记和D-丙氨酸消旋酶选择标记[9]。双质粒选择标记系统含有两种质粒，一种是带有所要表达