酶抑制法和

Ag *
Ab ：Ag *
（2）、间接ELISA原理
Ag
Ag：Ab Ab* Ab*
S P Ag ：Ab： Ab*
Ag
Ag ：Ab
4、农药抗体制备
Antibody（Ab）：动物肌体某些活性
细胞在某些物质（抗原）刺激下产生， 并能与这些物质特异性结合的一类活性 物质。
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5、ELISA法的特点
辽农职院 工程系 质检中心
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第六章 酶抑制法和 免疫测定技术
本章目录 学习指南 演示文稿 复习自测
2014年3月14日
目的要求：生物测定技术以其简单、快速、特异性强、 样品量少而得到迅速发展，应用酶抑制技术、酶联免 疫技术、生物技术等快速测定农药残留，已成为一定 的市场需求，但此类方法仍只能达到定性和半定量的 水平。 通过本章的学习，目的是使学生掌握酶制技术、酶联 免疫技术等常用的快速测定农药残留的方法，了解与 免疫法相关的一些知识。 学习要点 1、一般了解：农药残留生物检测技术的问题和展望。 2、一般掌握：生物传感器在农药残留检测中的应用。 3、重点掌握：酶抑制技术；酶联免疫技术；生物技术 等快速测定农药残留方法等。
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(2)对胆碱酯酶的抑制作用
① 假阳性 胆碱酯酶根据其水解基质的专一性和速度 不同分真性胆碱酯酶和假性胆碱酯酶，前 者又称乙酰胆碱酯酶(AchE)，后者包括丁 酰胆碱酯酶(BuchE)和丙酰胆碱酯酶 (PrchE)。 假阳性：水果、蔬菜的提取物中含有对有 抑制作用的杂质，如氯代烟碱类物质。
培 养
仪器测定
（3）、酶片法
酶片为浸渍有胆碱酯酶的或其他敏感 酯类的滤纸片或类似载体物质，其基 本技术原理与比色法相同。
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6、技术问题
（1）分析对象：有机磷、氨基甲酸酯类 （2）灵敏度不高，需用GC进一步定性和定 量、重现性不好 （3）农药含量影响酶抑制程度
（4）影响因子：酶的浓度、温度、pH

第六章 酶抑制法和免疫测定技术
一、酶抑制分析测定法 1、酶法概述
2、酶法检验原理
3、酶原 4、底物与显色剂 5、测定方法
二、免疫检测技术 1、免疫反应 2、免疫分析 3、酶联免疫吸附测定 法 4、农药抗体制备 5、ELISA法的特点
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一、酶抑制分析测定法
1、酶法概述
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② 产生假阳性的作用机理
AchE
CCl2 OCH P CH3O CH O O 3
乙酰胆碱
敌敌畏
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3、酶 原
蜜蜂头的脑酯酶液 条件：3日龄，-20℃ 0.24g/ml磷酸缓冲液 （pH7.5） 保质期：3个月
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4、底物与显色剂
（1）乙酰胆碱-溴百里酚蓝
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3、酶联免疫吸附测定法
ELISA（Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) 原理：在测定过程中，样品提取液中的农药 与已知数量的酶联剂竞争有限数量的抗体吸 附位点。（加入显色剂）
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（1）、直接ELISA原理
Ag
Ab ：Ag Ab
S P
乙酰胆碱+H2O→胆碱+乙酸 pH为6.2（黄） →7.6（蓝色）
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（2）乙酸-β-萘酯固蓝B盐
乙酸-β-萘酯固蓝B盐+H2O→ wenku.baidu.com-萘酚+乙酸（紫红色）
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（3）乙酸羟基吲哚显色法
乙酸羟基吲哚+H2O→吲哚酚+乙酸 吲哚酚+O2 →靛蓝（蓝色）
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（4）乙酸靛酯显色法
乙酸靛酯+H2O→靛酚蓝（蓝色）+
乙酸
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5、测定方法
（1）测定原理
水解
显色剂
无农药
显色 未水解
显色剂
有农药
不显色
加酶
5、测定方法
（2）、比色法
取 样 提 取 抑制反应
取2g样品（非叶菜类取4g），切碎 加入20ml提取试剂 振荡1~2min
将上清液倒入试管中，静止3min， 加入50ul酶，3ml样品提取液，50ul 显色剂 倒入比色杯测定
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(1)神经性毒剂对AchE的抑制机理
神经性毒剂分子中含有亲电子的正磷原子(Pδ+)，它 与Ach分子中的正碳原子(Cδ+)同样具有亲电子性质。 但神经性毒剂的亲电子能力此Ach强，这是因为毒剂分 子中，P＝O和P-F键上的O、F原子相对电负性比P原子 大得多(相对电负性P＝2.1，O＝3.5，F＝4.0，C&S＝ 2.5)。因此，相对电负性大的O、F原子吸收电子成为 负极，使P成为低电子密度的正极，即P原子带有较多 的正电荷和更强的亲电子能力。所以神经性毒剂对 AchE有更大的亲和力和抑制力。
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二、免疫检测技术
Pathogen
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1、免疫反应
免疫反应：细菌、病毒→入 侵→抵御的抗体，即识别和 排除进入体内的抗原性异物 的保护性反应。
抗原：外来物
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2、免疫分析
免疫分析：以抗原和抗体的特异性、可 逆性结合反应为基础的分析方法。 免疫反应特点：高度选择性。
2、酶法检验原理
真性胆碱酯酶与胆碱能神经的生理功能极为密切。 其生理功能是，当神经冲动到达胆碱能神经末梢 时，突触小泡内的Ach外排至突触间隙，作用于 突触后膜的胆碱能受体，引起下一级神经元或效 应器的激发。在正常生理条件下，Ach完成传递 冲动作用后，随即被突触后膜上的AchE在数毫秒 内水解，生成乙酸和胆碱。
（1）适用于常规方法无法测定的农药 （2）适用于环境监控 （3）适用于单一农药品种残留检测
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复习思考题
1、酶抑制法测定农药残留的基本原理是什么？ 2、免疫分析法应用于农药残留检测的关键问 题是什么？ 3、农药快速检测技术的检测原理是什么？
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