冰冻切片漂片
各种组织冰冻切片、取材,染色等具体操作方法(连载一 脑、肠、眼球)
各种组织冰冻切片、取材，染色等具体操作方法(连载一脑、肠、眼球）1.做脑组织的冰冻切片在前期的处理过程中很重要，因为脑组织非常软。
不但要做前固定，最好是做全身灌注固定后，如果不做全身灌注固定，很难取出一个完整的大脑组织。
再段头取脑置4度4％多聚甲醛（或西奈山环保组织固定液）中后固定24小时，然后依次置入剃度PB蔗糖溶液脱水，剃度可以设为15%，20%，30%分别过夜沉底即可。
设剃度脱水是为了避免组织块冰晶的产生。
冰晶在组织片上表现为圆形或椭圆行的空洞，影响实验结果。
在做切片时可以做简单的HE染色即可分辨出是否有冰晶。
防止冰晶的另一实验注意点是在做切片前的包埋过程，要求速冻，一般放-20度下15分钟即可，温度高如室温或者4度是达不到速洞效果的，温度太低如放在液氮罐中又导致组织块的碎裂。
而且产生冰晶。
2.如果想要作出满意的漂亮的实验结果，特别是免疫双标共聚焦，那就要求更高，实验的每一步都要很严格，不是我说法夸张，是因为做共聚焦要避免自发荧光的问题，而实验的每一步都可能产生自发荧光，比如4％多聚甲醛灌注液，PB蔗糖等都可以产生让我们头痛的自发荧光问题，根据我的实验经验，国产的多聚甲醛作实验很容易产生自发荧光，难以避免，不过据我导师讲，他在国外做共聚焦不存在这些问题，所以我个人认为你不妨先做单标试试看，能避免自发荧光，那最大的难题就解决了。
西奈山环保组织固定液可以降低自发荧光背景。
3.是否做漂片还是贴片的问题，脑组织两种方法都可以，唯独共聚焦例外，做共聚焦要求片子一般为30-50um，厚片才能达到三维重建的效果。
一般的贴片文献上提到的是20-30um用漂片，此法要求抗体用量较大，最好买国外原装的浓缩液。
不过我做的脑片切过4um的做一般的普通免疫荧光可以。
楼上的几位同仁说得不错。
就我们实验室的操作方法以及个人的体会说上几点：1.如果灌注固定较好的话，完全可以省去后固定这个步骤。
神经组织常规的固定液为4%的多聚甲醛，如果在其中再加入0.25-0.5%的戊二醛增加其固定时的交联作用，那么固定的效果就会更好些，脑或脊髓标本就会更硬些；我们一般用1000ml多聚甲醛固定至少2小时。
冰冻切片技术各流程常用方法和试剂
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以前做冰冻切片只是分享
冰冻切片与漂片免疫组化以前做冰冻切片,总是遇到问题,后来查文献,自己又做实验比较,总算找到了又快又好地办法, 拿出来和大家分享一下.1. 取脑一定要在冰上操作,液体也一定用冷的2. 30%蔗糖一定要充分,最好中间换液一次, 20%的可以不做3. 沉淀后冻存,一定要快冻, 最好在干冰上操作.4. 最重要的一点, 灌注的时候, 不要用0.1M PB, 用0.01M PBS. 以前不知道,很多书上写的都是0.1M PB,后来自己用了发现还是有洞. 为了这个,我还专门作了对照实验,结果0.01M PBS更好一些, 原因不知道为什么, 但是事实如此. (理论上高浓度液体更利于保护细胞不会因为冰冻损伤)5. 如果做磷酸化的抗体,一定记得在灌注液里加一定的抑制剂,如NaF等.蔗糖俺用25%/PBS 的，不用换液，只要过夜12个小时就能沉下去了。
包埋的时候不用冲洗，但是要注意一定要用吸水纸擦干蔗糖溶液，否则切片有麻烦我做切片的时候，先用20％蔗糖（PB配）沉底，再用30％蔗糖沉底，这样脱水比较充分。
一般是等切片机温度达到-22度之后，再将包埋好的脑组织放入。
脱水不充分也会导致切片有洞，而且片子容易向内卷，很不好贴。
一直这样做了很久，效果都还不错。
取脑后，直接投到液氮？？我试过，由于脑组织水分多，下液氮后直接就碎了～～防止脑袋冻碎办法：先准备好一个保温杯，倒入适量的液氮，然后在杯身中放一个纸杯（塑料或玻璃杯禁用），再在杯中放一金属片，以防止纸杯翻倒，动物脑袋取好后，先放在一张小锡箔纸上，然后连锡箔纸一起转移至杯中的金属片上面，盖上保温杯盖，3-5分钟后，见大脑表片颜色变白，表示冷冻完全，随即将大脑用锡箔纸包好，转入-80度冰箱长期保存。
脑片切好后保存方法：1、先用手指在玻片（已挂好胶）后均匀轻轻过一下，将脑片组织贴在玻片上。
2、37度干燥箱中烘干。
3、放入切片盒中，盖紧盒盖，并用胶带将切片盒封严，外用样品袋包扎严实，即可防止水汽进入。
一种简便_可靠的免疫组化双重标记新方法_崔白苹
化物酶（ horseradish peroxidase，HＲP） 双酶显色系统［4 － 7］，碱 性磷酸酶的底物多选用 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐 / 硝基四唑 氮蓝（ BCIP / NBT） ，HＲP 的 底 物 多 选 用 3-氨 基-9-乙 基 咔 唑 （ 3-amino-9-ethylcarbazole，AEC） 或二氨基联苯胺 （ 3，3'-diaminobenzidine，DAB） 。上述双标方法中，底物 BCIP / NBT 与 AEC 的呈色反应存在一定程度的相互干扰［6］，使染色结果 反差变小； 由于 AEC 等底物的反应产物［8］在二甲苯中可溶， 故只能采用水性封片，加之 BCIP / NBT 和 AEC 的反应产物 容易扩散，使染色结果也不能长期保存。另一方面，早期文 献中有将金属离子增强 DAB 与 DAB 试用于免疫组化双标 的报道［9］，而后又有研究者将 DAB 和镍增强 DAB 方法加以 改变或发展，用于特定的实验目的，如免疫组化与原位杂交 杂合双标［10］、免疫电镜双标［11］。然而，已报道的 DAB 与金 属离子增强 DAB 明场双标方法存在一个共同的缺点，即未 设计有效的处理以阻断双标之间潜在的交叉反应，进而使双 标信号的颜色反差有所下降。另外，已有的明场双标方法所 用的试剂和 操 作 步 骤 常 较 复 杂。 实 际 上，由 于 方 法 学 的 限 制，发表文献中很难见到清晰、高反差的明场双标结果。因 此，建立一种简单可靠的明场免疫组化双标记方法，并产生 高质量的双标染色结果，将有十分重要的应用价值。
本文将介绍一种简便的免疫组化双重标记方法，其特点 是： （ 1） 采用单一的 HＲP 酶系统； （ 2） 第一次免疫组化标记后， 通过短暂煮沸完全灭活第一标残余的 HＲP 酶活性，阻断其与 第二次免疫组化染色产生交叉反应； （ 3） 底物依次使用 DAB 和镍增强 DAB，次序不宜颠倒； （ 4） 双标信号棕黄色与紫蓝色 对比鲜明，背景清晰。此外，可采用常规的二甲苯和中性树胶 封片，染色结果可以长期保存； 染色时间较同类方法短，连接 HＲP 的二抗可以与免疫印迹实验通用，经济实用。 1 材料与方法 1． 1 试剂和实验动物 抗体： 见 Tab 1。
脑组织冰冻切片漂片法与石蜡切片贴片法的免疫组化效果比较
脑组织冰冻切片漂片法与石蜡切片贴片法的免疫组化效果比较钟琴;张燕翔;钱锋;杨波;任伯绪【摘要】目的：：比较脑组织冰冻切片与石蜡切片免疫组化的效果。
方法：健康雄性昆明小鼠20只，腹腔注射匹罗卡品诱导癫痫持续状态模型。
24h后成功模型小鼠脑灌注固定，断头取脑，随机分别取8只行冰冻切片40μm (A组)与石蜡切片4μm (B组)，采用羊抗鼠 DCX (1：200)抗体，以 SABC 法进行免疫组化染色。
结果：A组阳性神经元数目与B组比较差异有统计学意义(P<0.05)，且 A组镜下视野切片染色更加清晰，对比良好。
结论：脑组织切片免疫组化染色采用冰冻切片漂片法效果更为可靠。
【期刊名称】《长江大学学报（自然版）理工卷》【年(卷),期】2015(000)036【总页数】3页(P95-97)【关键词】冰冻切片;石蜡切片;免疫组化;癫痫【作者】钟琴;张燕翔;钱锋;杨波;任伯绪【作者单位】长江大学医学院，湖北荆州 434023;长江大学医学院，湖北荆州434023;长江大学医学院，湖北荆州 434023;长江大学医学院，湖北荆州434023;长江大学医学院，湖北荆州 434023【正文语种】中文【中图分类】R361随着神经科学的不断发展，脑组织免疫组化技术越来越多地应用于神经学研究。
由于脑组织本身具有柔软、含水量大等特点，其石蜡切片的免疫组化染色结果易出现切片染色不清楚、脱片、假阳性、假阴性等问题[1]，很难得到高质量的脑组织免疫组化切片。
本实验采用癫痫持续状态模型(status epilepticus, SE)，用免疫组化的方法检测海马齿状回下区编码微管相关蛋白(DCX)阳性神经元的表达，对比脑组织冰冻切片漂片法与石蜡切片贴片法免疫组化的效果，以期更好的开展实验研究工作。
1.1 对象健康雄性昆明小鼠20只，体质量(30±5)g，由湖北省实验动物研究中心提供；东莨菪碱、匹罗卡品由Sigma公司提供；免疫组化ABC试剂盒、DCX羊抗鼠一抗、驴血清、驴抗羊二抗由Santa cruze公司提供。
基础病理-漂片和捞片
漂片
1.漂片水温：一般为42-45℃之间，水温不可过低或过高；
2.漂片水的更换：漂片仪中的漂片水需每天更换，保持水面洁净，并每日清洁漂片水槽四周内壁残留石蜡组织，保持仪器清洁，用纱布清洁即可，注意动作轻柔，不要破坏内壁涂层；
3.漂片水的清洁：每切完一个蜡块后，必须认真清理水面，不得遗留其他病例的组织碎片，以免污染。
具体方法为：可将报纸裁成水槽内壁大小制成漂片纸，捞取切片完毕后，即将裁好的漂片纸贴附水面，顺一个方向拖动即可;
4.漂片成功标准：切片自然舒展、平整无残缺、无褶皱裂隙，易于捞片。
捞片
1.玻片的选择：常规染色、特殊染色、免疫荧光染色选用普通载玻片即可，要求，表面清洁，透光性好，易于书写号码；免疫组织化学染色需选用黏附载玻片，要求黏附性强，表面清洁，透光性好，便于书写号码；
2.捞片位置的选择：组织应捞在切片的中下1/3处中间位置；
3.捞片数量的选择：小组织捞取6-12个，大组织1个即可，特殊要求除外，并防止污染污染；
4.捞片方向的选择：组织方向应与载玻片长轴方向一致，总体应遵循易于显微镜观察为原则；
5.捞片安全要求：漂片仪中一次只可有一个蜡块的组织，严禁有两个不同蜡块的组织在同一个漂片仪内；
6.书写玻片号码应清晰，书写完毕应仔细核对，防止差错，有条件的尽量采用信
息化用打号机打号；
7.捞片完成按顺序放入染色架中，注意防入时尽量缓慢轻柔，防止染色架刮伤到组织影响切片质量。
免疫组织荧光染色法实验操作流程
5min
100%乙醇Ⅱ
5min
95%乙醇
2min
90%乙醇
2min
80%乙醇
2min
70%乙醇
2min
蒸馏水（浸洗）
3*2min
抗原
修复
高压锅柠檬酸盐缓冲液
3min
先将柠檬酸盐缓冲液加到洗盒里，加热高压锅，待柠檬酸盐缓冲液升温至60℃左右时放入水化后的标本，盖好高压锅，不加压力阀。加热高压锅，待压力阀处冒水蒸汽时，盖上压力阀，加热三分钟。压力降到正常大气压后打开锅盖，待玻片自然冷却。
含DAPI的封片液封片
冰冻切片（贴片）
操作步骤（贴片）
时间
备注
操作步骤（漂片）
时间
备注
标本
-80℃保存
标本
保护液-20℃保存
漂片最好要20um
复温
室温
10min
复温
PBS洗（24孔板）
3*5min
摇床
固定
4%PFA固定
30min
破膜
PBS洗
3*10min
破%PBST破膜
MBP兔抗体
4℃过夜
加Ⅰ抗
0.3%PBST浸洗
2*5min
在加Ⅰ抗的时候，要用吸水纸吸干周围的水，用pad笔画圈，防止Ⅰ抗流失，影响效果。
驴抗兔488
1h
加Ⅱ抗
1×PBS浸洗
3*5min
室温下1h，注意要避光。如果需要进行双标，在从封闭开始进行，
含DAPI的封片液封片
封片
因封片液中含有DAPI染细胞核（蓝色），所以不用做核的染色。
自然冷却
封闭
蒸馏水洗
2*3min
Ⅰ抗为兔抗鼠，Ⅱ抗就应该为**抗兔，所以我们封闭时选用被抗最少的物种，一般选用牛血清或者驴血清。再封闭时，为了防止封闭液流失，可以用pad笔在标本周围画圈，提高液体的利用度。
冰冻切片漂片
免疫荧光操作步骤（漂片，冰冻切片）免疫组化步骤：1.将脑片放到，6孔板（或12孔板），按照二抗说明书，加3%双氧水封闭10min（如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍）；（二抗不同，操作步骤有差别），本实验室使用的二抗试剂盒为中杉金桥超敏二步法试剂盒；2.吸去双氧水，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；3.然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4.然后，4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃；5.然后，PBS洗净两遍；剩下步骤见二抗试剂盒说明书。
6.DAB配方为：10mgDAB固体加到20ml0.01MPBS，临用时加100-200微升30%双氧水，注意避光。
7.显色10min，看片子染色深浅情况适当调整显色时间。
一般3分钟显色就比较明显，如果20分钟仍未显色，则看下面的参考。
8.然后PBS洗两遍，转移到载玻片，自然晾干。
干燥天气2-3h，潮湿天气3-4h。
9.脱水：70%酒精3min，95%酒精3min，100%酒精3min，100%酒精2min，二甲苯2min，二甲苯3-5min。
如果片子上盐分较多，在70%酒精前在双蒸水1min。
免疫荧光步骤及注意事项：1，将脑片放到6空板的山羊血清封闭液中，封闭20-40min；（如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍）2，吸去山羊血清，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；3，然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入PBS稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4，4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃，如果荧光亮度不强，可以延长孵育时间到48或72小时；5，然后，PBS洗净两——三遍，按照二抗说明书稀释的荧光二抗，室温孵育2小时。
四川大学华西医学院基础医学实验技能培训及考核(形态学)教学大纲
本科实验教学大纲一、课程基本信息课程名称：基础医学实验技能培训及考核（形态学）英文名称：Basic medical laboratory skills training and assessment (morphology) 教学专业：基础医学基地班（本科）课程类型：实践课学时：24（不含课外附加）学分：2二、教学目的及要求：本课程是针对基础医学专业的实验技能训练课程。
课程教学的目的是让学生掌握显微形态学关键技术环节的实验操作，并熟悉其技术原理。
包括组织灌注取材、常规显微制片、组织化学检测、体外培养等，要求学生能够在实验室独立进行相关操作。
三、教学内容1. 手术取材和组织固定（4学时）掌握：A.常用醛类固定液的配方和工作原理；B.经心脏灌注固定操作。
了解：A.特殊固定液的配方和原理；B.影响固定效果的因素。
2. 冰冻切片法（1学时）掌握：A.冰冻切片标本的预处理操作；B.冰冻切片操作。
了解：A.冰冻保护剂。
3. 石蜡包埋（6学时，不占课堂时间）掌握：A.常用标本脱水流程及原理；B.石蜡包埋操作。
了解：包埋石蜡制备。
4. 石蜡切片法（3学时）掌握：A.石蜡切片操作；了解：A.玻片防脱剂配方及工作原理；B.轮转式切片机和滑行切片机的工作原理。
5. H-E染色法（2学时）掌握：A.H-E染色的技术原理和影响染色结果的因素；B.H-E染色操作流程；了解：A.H-E染色法的替代性操作研究进展；B.其它常用广谱染色技术。
6. 特殊染色法（2学时）熟悉：A.Giemsa染色法原理和操作流程；B.尼氏染色法原理和操作流程；C.镀银和还原银染色的原理；D.活体染色的原理和常用方法了解：A.显示细胞器的特殊染色法；7. 组织化学术（4学时）掌握：A.免疫组织化学的原理和操作流程。
熟悉：A.常规组织化学的原理及其分类；B.常用组织化学反应；C.原位杂交组织化学的原理的操作流程；D.酶组织化学的原理和操作流程。
8. 形态学图像分析（2学时）掌握：A.显微图像的报告、描述和常规定量方法；B.卡瓦列里原理及应用；C.分子表达定量测定的正确方法。
冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理课件
加强操作人员技能培训与交流学习
总结词
加强操作人员技能培训和交流学习可以提高冰冻切片 制作和染色技术的水平。
详细描述
操作人员的技能水平对冰冻切片制作和染色结果具有 重要影响。因此，应加强操作人员的技能培训，使其 掌握正确的操作方法和技巧。此外，组织操作人员之 间的交流和学习，可以分享经验和技巧，提高整体技 术水平。同时，鼓励操作人员积极参与学术会议和技 术研讨会，了解最新的技术和进展，也是提高技术水 平的有效途径。
04
冰冻切片染色常见问题及 处理方法
染色不均匀
总结词
冰冻切片染色不均匀可能是由于染色时间不足或过长、染色液浓度不合适、切片温度不均匀等原因引 起的。
详细描述
染色不均匀的问题可以通过控制染色时间和浓度来解决。一般来说，染色时间不宜过长或过短，应根 据染色液的浓度和切片厚度来适当调整。同时，确保切片温度保持均匀，避免局部温度过高或过低。
详细描述
在冰冻切片制作过程中，组织固定 是关键步骤之一。如果固定不当， 会导致细胞结构变形、组织结构松 散等问题。
处理方法
应掌握组织固定的最佳时间和方法 ，根据组织类型和实验要求选择合 适的固定剂，并严格控制固定时间 。
切片温度不适宜
总结词
切片温度不适宜可能引起细胞结 构破坏，影响切片质量。
详细描述
感谢您的观看
THANKS
总结词
切片温度和厚度的调整对切片质量和染色效果具有重 要影响。
要点二
详细描述
在冰冻切片制作过程中，应根据组织类型和实验需求 ，选择合适的切片机和切片刀，并调整切片温度和厚 度。一般来说，较薄的切片更容易染色和观察，但过 薄的切片可能会导致组织结构破坏和细胞丢失。同时 ，应根据染液特性，选择合适的染色时间和温度，以 确保染色效果。
冰冻切片免疫荧光取材
冰冻切片免疫荧光取材2.1.5 免疫荧光技术检测PTEN 蛋白表达。
2.1.5.1 标本制备1) 取材：对照组和模型组分别随机选取15 只大鼠于0d、1d、3d、7d、14d时相点进行免疫荧光技术检测，每个时相点3 只，麻醉后（水合氯醛3.5%，1ml/100 克，腹腔注射)，先用生理盐水灌注（生理盐水的量不能少于250ml，最好300ml 以上），将血液冲净后用4%多聚甲醛灌注，0.1g/mol 磷酸缓冲液配制的4 C 4%多聚甲醛（PH=7.4）约250ml 灌注至肢体僵硬，待充分固定后断头取脑组织，组织厚度约为3~5mm。
灌注一定要充分，肝脏变硬呈瓷白色为最佳；2)固定：4℃4%多聚甲醛固定24h。
3)灌流固定好的脑组织不需后固定可直接脱水；脱水：用30%蔗糖（4%多聚甲醛配置）固定脱水10~24h，换新液继续脱水，组织沉底后即可包埋；4)包埋：包埋器（本实验采用奶片盒或大片剂含片盒替代包埋器）内先放入少量OCT，将组织块放入（放组织时动作要慢，轻轻下压，小心组织移位和产生气泡），放好后继续加入OCT 至全部包裹组织为止，将标注的纸条放于包埋块周边，以明确分组及定位大脑的前后切面位置。
将包埋好的组织块直接放入-80℃冰箱冷冻，冻好后用锡纸包好-80℃保存备用；5)切片：切片前先将恒冷箱切片机调至-20℃预冷20min，同时将组织从-80℃冰箱内取出，置于恒冷箱切片机内30min，将组织块用OCT 粘贴在托物台固定，冠状面连续切片，然后进行切片。
6)贴片染色标本切片厚度为15~20um，漂片染色（蛋白表达量低的采用）切片厚度为30~40um。
选用多聚赖氨酸预处理的载玻片进行贴片，贴片时玻片应从一侧贴附切片，如果不平可用小毛笔蘸少许纯水轻轻抚平。
7)将贴好的切片置于37℃温箱烤1h，烤干后即可进行染色或装入切片盒密封-80℃保存备用。
2.1.5.2 免疫荧光染色步骤1) 取出冰冻切片，室温放置30min，PBS 洗10min×3 次；2) 0.4%Triton-100 浸泡10min（1000ml PBS+4ml Triton-100）；3) PBS 洗10min×3 次；4) 抗原修复（高压锅限压阀冒气后计时1.5min，冷水降压，自然冷却）；5) PBS 洗10min×3 次；用组化笔在距离组织2mm 处划圈；6) 5%驴血清（与二抗源性相同）封闭1h；7) 一抗：甩去多余血清，不洗。
冷冻切片方法及注意事项
一、试验前预备清理试验台及仪器。
开启冷冻切片机并将冷冻切片机预降至所需温度〔- 15~-20 ℃*〕。
预备好处理好的载玻片、刀片、胶水以及药品。
二、取材解剖之后快速取出所需的颖组织，用干纱布或滤纸擦干后不需固定直接取材〔24×24×2mm*〕,以防形成冰晶造成切片中形成外形不一的空泡,使细胞内构造移位。
〔注：取材中目的标本既要明确也要确保其构造的完整性，应避开不必要的脂肪及坏死组织附着;要尽量剔除毛发、硬骨或钙化物;保乳手术切缘由于脂肪组织较多,取材厚度最好不要超过3mm，厚者冰冻费时，大者难以切完整。
甲状腺及淋巴结组织要带全组织被膜并除去多余的脂肪组织。
〕三、冷冻切片1、取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，用吸热器压住组织，至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片〔1~3 分种〕。
2、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。
3、调好欲切的厚度，依据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10μm 间。
4、调好防卷板。
制作冰冻切片，关键在于防卷板的调整上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。
切片时，以切出完整、平滑的切片为准。
切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向略微用力轻轻一带,可避开组织摊片过程中皱折,保证组织构造的完整及切片的美观。
注：①包埋剂的选用：包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素，包埋剂用量要适宜，过多或过少都会影响标本冷冻质量。
常用的有三种包埋剂OCT 剂、B 超藕合剂以及一般胶水。
B 超藕合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织,一般胶水或OCT 剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。
〔OCT 包埋剂骤冷时固化，其冷冻速度和软硬韧度与组织相近，其还具有水溶性，不影响染色等优点。
〕②组织块过小：先将少量胶挤在托架上预先放在冰冻机中冷冻,约30 秒钟左右待胶凝固时将小组织放上, 组织四周再加一些胶,再次置于冷冻机中冷冻,这样组织被垫高,就能快速切出高质量的切片。
冷冻切片法流程
冷冻切片法流程好的呀，那咱们就开始聊聊冷冻切片法的流程吧。
冷冻切片法呀，这可是个挺有趣的东西呢。
一、准备工作。
咱们先得把要用的东西都找齐喽。
要有一台冷冻切片机，这就像是厨师的炉灶一样重要。
然后就是刀片啦，这刀片可得锋利得很，就像侠客的宝剑，要是钝钝的，那可切不好。
还有冷冻剂，这可是让样本能被冷冻起来的关键呢。
样本当然也不能少啦，不管是组织还是其他的什么东西，都得准备好。
另外，像载玻片、盖玻片、固定液这些小玩意儿也得准备妥当，它们虽然看起来不起眼，但是缺了哪个都不行。
二、样本处理。
样本拿来之后呀，可不能就直接往切片机里塞。
要先处理一下的。
如果是组织样本，得把它修剪成合适的大小和形状，就像我们剪头发一样，要弄得整整齐齐的。
而且要尽量保证样本的新鲜度，如果放太久了，就可能会影响切片的质量啦。
这时候呀，就把样本放到冷冻剂里去，让它快速地冷冻起来，就像给它穿上了一层冰铠甲一样。
三、切片操作。
样本冷冻好了，就可以开始切片喽。
把冷冻好的样本放到冷冻切片机的样本台上，要放稳当哦，不然切的时候就会晃来晃去的，那切出来的片子可就歪歪扭扭的啦。
然后调整切片机的参数，这就像调整相机的焦距一样，要找到最合适的设置。
启动切片机，看着刀片慢慢地切过样本，一片薄薄的切片就诞生啦。
这切片可得薄厚均匀才行，要是有的地方厚，有的地方薄，就像人的头发有的地方长有的地方短一样奇怪。
四、切片处理。
切好的片子可不能就这么不管了。
要把它小心地取下来，放到载玻片上。
这时候呀，可能会用到一些固定液，把切片固定住，就像用胶水粘住一样，这样它就不会乱跑啦。
然后可以根据需要进行染色或者其他的处理。
染色就像是给切片穿上漂亮的衣服，让我们能更清楚地看到里面的结构。
五、观察与保存。
处理好的切片就可以放到显微镜下观察啦。
这时候就像是打开了一个微观世界的大门，能看到很多奇妙的东西呢。
观察完之后呀，如果想要保存切片，就得把它放在合适的地方，盖好盖玻片，避免它被弄脏或者损坏。
大鼠脑组织冰冻切片免疫组化漂片法的实验研究
【 Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄ ｓ 】 Ｂ ｌ ｅ ａ ｃ ｈ ｉ ｎ ｇ ｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ Ｉ Ｈ Ｃ Ｆ ｒ ｏ ｚ ｅ ｎ ｓ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ
免疫 组织 化 学 （ Ｉ Ｈ Ｃ）是 常规病 理诊 断 中不可 缺 少 的重要方 法 ，在神经 科研 中也至关重 要。常规 免疫 组化 采用 贴 片法 进行染 色 ，操作 步骤 中易发 生干 片 ， 试 剂使 用量较 大 ，染色组 织数量 较少 ，对需 要进行 大
例 ，应用漂片法进行免 疫染色。结果 组织切片 完整 ，染色背景干净 ，未见非特异 染色，Ｔ Ｈ￣ Ｅ Ｉ 性表达 明显 ，形 态正常。结论 应用漂 片法对
大鼠脑组织进 行免疫组化染 色，可优化染 色效果 ，提 高工作效 率。
大鼠冰冻切片
【操作步骤】
1．小鼠的灌注固定：动物经麻醉后开胸暴露心脏，经左心室先快速灌注生理盐水(50mL左右)至流出液变清亮，然后换4％多聚甲醛继续灌注大约100ml至组织变硬。
2．取材：小心剥离脑组织，置广口瓶中用4％多聚甲醛后固定12～24h。
3．脱水：将标本移入30%蔗糖溶液（用4％多聚甲醛配制），4℃放置至组织块沉底
4．将少量包埋剂OCT滴加到标本台，放入恒冷箱切片机内至变白，然后取出快速将表面用单面刀片修平。
5．用安全刀片将标本底部修平后迅速粘附于标本台，然后置入-24℃恒冷箱切片机的冷冻台。
待组织略微发白时用OCT在标本表面涂一薄层，继续冷冻20min。
6．调好切片厚度后开始切片。
如果是采用漂片，切片厚度一般20～30ìm，切好的片子可以连续收集也可以每隔5～6片收集一片，移入含4％多聚甲醛的6孔板、24孔板或别的容器。
如果是准备做贴片，片厚一般10ìm；可以连续裱片，也可以每隔5片或10片裱一片，贴好后放切片盒，50度左右烤片1小时使其贴牢.
7．将切好的片子放4℃保存备用。
做室旁核的话可以将脑袋反过来，在腹侧面，大概切掉视交叉前和下丘脑之后的部分、只保留中间部分然后连续切片就可以了。
如果是漂片，室旁核的部分切不了很多；如果贴片那切出来的要多一点。
做免疫组化的话漂片就可以了。
液氮或低温冰箱里的冻存必须要有防冻液，否则必然切片会碎掉。
冰冻切片的原理、流程和注意事项
冰冻切片的原理、流程和注意事项1冰冻切片的原理冰冻切片是指新鲜组织不经过任何固定、脱水、透明等处理，不需要石蜡包埋，直接在低温恒冷切片机冷冻后马上进行切片的一种方法。
冰冻切片具有操作简单、对环境污染小和对组织抗原损伤小的特点。
又因制作时间和材料有限，保证高质量的冰冻切片非常重要，直接影响病理诊断的正确率。
2冰冻切片的操作流程整体流程：送检和取材要求：•送检标本及时新鲜，组织无需固定，不能遇水，防止冰晶空洞等现象在切片过程中产生•取材的器械要保持干燥，取材时所取的范围应尽量避开出血坏死区域及脂肪区域•所取组织块大小应合适。
组织过大切片时阻力加大，难免产生刀痕及褶皱，加大了制片的难度包埋：•包埋剂一般使用OCT或普通胶水•包埋时将包埋剂涂抹均匀，并根据组织情况和医生的要求确定包埋方向，如管腔、皮肤、囊壁等要立埋•组织体积较小，可先挤入少许胶在包埋托上形成一个”平台“，再放入小组织进行包埋冰冻温度与时间：冰冻的温度与时间时制作冰冻切片的关键因素，需要根据组织的种类、厚度和大小来调节。
如果温度过低，会造成组织过硬、切片破碎；温度过高会造成组织硬度不够，难以切片切片和染色：•在组织和包埋机冻到发白后可以开始切片•是否使用防卷板可根据操作者的习惯，如使用防卷板，一般将其调整到与切片呈5度夹角•切片时右手摇轮转要力道均匀、柔和、缓慢，切片厚度掌握在5微米，左手持毛笔在切片形成时按住组织边缘，使其不发生卷曲•将切片展平粘贴在结晶载玻片上后，应当立即放入固定液中加以固定，如固定不及时，会发生细胞蜕变，切片中细胞核显示不清，呈”云雾状“表现冰冻切片HE染色流程：3冰冻切片的注意事项1. 组织取材要规范冰冻切片的组织要尽可能新鲜，不触碰谁，取材要及时，动作要迅速。
2.取材大小要厚薄适中在确保渠道主要病变的前提下，尽量避开钙化、坏死、脂肪等。
3. 保持取材台面和器材的干净，防止污染4. 组织表示及编号要明确5. 切片固定要及时制片过程要求快速冷冻、快速切片、快速固定。
一种冰冻切片漂片法免疫反应后再用石蜡切片的方法
一种冰冻切片漂片法免疫反应后再用石蜡切片的方法
邱建勇;刘惠玲;鞠躬
【期刊名称】《中国组织化学与细胞化学杂志》
【年(卷),期】1996(000)004
【摘要】本文采用组织冰冻切片５０μｍ进行双重标记的免疫组织化学漂片染色后，将其贴在塑料包埋盒内，脱水，经石蜡包埋切为１－３μｍ的薄片贴于载玻片上，干燥后脱水透明封片，最后进行切片观察，免疫阳性产物被准确定位于所观察的细胞或纤维上，得到满意的结果。
为免疫组织化学形态学研究工作提供了新的手段。
【总页数】3页(P476-478)
【作者】邱建勇;刘惠玲;鞠躬
【作者单位】第四军医大学全军神经科学研究所神经形态学研究室
【正文语种】中文
【中图分类】R361.2
【相关文献】
1.骨骼肌石蜡切片法与冰冻切片法Y小体出现率的比较 [J], 费青
2.一种快速石蜡切片方法与快速冰冻切片方法的比较 [J], 王双珠
3.脑组织冰冻切片漂片法与石蜡切片贴片法的免疫组化效果比较 [J], 钟琴;张燕翔;钱锋;杨波;任伯绪
4.冰冻切片后剩余组织制作石蜡切片与常规石蜡切片的比较 [J], 班翔;黄淇;田云云;赵瑞波
5.γ-GT酶组织化学染色中低熔点石蜡切片代替冰冻切片的方法 [J], 郭爱华;郭文君
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生物显微技术介绍——冰冻切片
生物显微技术课程论文（2010——2011学年，第一学期）冰冻切片摘要：1.1冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度, 然后进行切片的一种方法。
因其制作过程较石蜡切片相对简便、快捷, 都应用于手术中快速病理诊断。
我科于1975 年开展术中冰冻切片检查, 1995 年采用快速恒冷式切片机(德国LE2ICACM1850) , 作冰冻切片1100 余例, 其中包括乳腺、肺、喉、甲状腺、淋巴结、消化道、泌尿道、卵巢、子宫、皮肤等组织。
结果显示, 切片顺利,制作效果满意, 为病理诊断提供了可靠的依据。
既免除了患者多次手术带来的巨大痛苦, 又节约了患者的住院费用, 深受广大临床医生及患者的欢迎及好评。
关键词：冰冻切片方法及注意事项冰冻切片机1 冰冻切片简介1.1冷冻切片的种类冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。
这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。
当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。
1.2冷冻切片的目的1.2.1在手术进行中，突然发现病人的病变与原诊断，原定手术方案不相符合，或者怀疑时，需要病理确定。
1.2.2了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗措施。
1.2.3了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗措施。
1.2.4在做剖腹探查时所发现的肿块或者异样的组织。
1.2.5显示组织中的脂肪和脂类物质，这常见于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研组织等。
1.2.6某些酶的显示如ATP酶，琥珀酸脱氢酶等。
1.2.7神经病理学技术中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。
1.2.8对某些物质所进行的免疫荧光的研究。
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免疫荧光操作步骤（漂片，冰冻切片）免疫组化步骤：1.将脑片放到，6 孔板（或12 孔板），按照二抗说明书，加3%双氧水封闭10min（如果是从切片保护液取出，则要用PBS 洗一遍）；（二抗不同，操作步骤有差别），本实验室使用的二抗试剂盒为中杉金桥超敏二步法试剂盒；2.吸去双氧水，PBS 洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；3.然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50 微升一抗稀释液，小鼠脑片为30 微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4.然后，4℃，过夜（18h 或者24h），不建议使用37℃；5.然后，PBS 洗净两遍；剩下步骤见二抗试剂盒说明书。
6.DAB 配方为：10mg DAB 固体加到20ml 0.01MPBS，临用时加100-200 微升30%双氧水，注意避光。
7.显色10min，看片子染色深浅情况适当调整显色时间。
一般3 分钟显色就比较明显，如果20 分钟仍未显色，则看下面的参考。
8.然后PBS 洗两遍，转移到载玻片，自然晾干。
干燥天气2-3h，潮湿天气3-4h。
9.脱水：70%酒精3min，95%酒精3min，100%酒精3min，100%酒精2min，二甲苯2min，二甲苯3-5min。
如果片子上盐分较多，在70%酒精前在双蒸水1min。
免疫荧光步骤及注意事项：1， 将脑片放到 6 空板的山羊血清封闭液中，封闭20-40min；（如果是从切片保护液取出，则要用PBS 洗一遍）2， 吸去山羊血清，PBS 洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；3， 然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入PBS 稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50 微升一抗稀释液，小鼠脑片为30 微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4， 4℃，过夜（18h 或者24h），不建议使用37℃，如果荧光亮度不强，可以延长孵育时间到48 或72 小时；5， 然后，PBS 洗净两——三遍，按照二抗说明书稀释的荧光二抗，室温孵育2小时。
注意避光操作。
6， 0.01M PBS 洗两遍，转移到载玻片上，避光自然晾干；7， 滴加防淬灭剂后，盖上盖玻片镜下观察。
常见问题：1， 荧光太暗：可能蛋白表达少；可能一抗孵育时间短；二抗孵育时间短；清洗次数过多；溶液pH 不合适；荧光萃灭；一抗浓度过低或过高；二抗浓度过低或过高；激发波长不在抗体适用波段。
2， 背景荧光太深：一抗浓度过高，清洗不彻底；二抗浓度过高，清洗不彻底；封闭时间过短，非特异性过强；一抗非特异性过强；二抗非特异性过强；显微镜荧光强度过强。
总之实验是喜欢强阳性，不喜欢假阴性，呵呵。
任何实验都需要花时间摸索才能找到其最佳的工作条件。
另附免疫组化常见问题解析。
原理是相同的，只是最后的显色方法不一样，有些问题有启发作用。
免疫组织化学1. 边缘效应?原因: 1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试 剂洗尽所致. 解决办法：制备优质的胶片（APES 或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4 微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。
2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。
解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。
用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。
2. 产生组织切片非特异性染色的原因有哪些？如何解决？1. 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。
解决办法: 这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。
这是最重要的一条。
2. 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。
3. 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；4. 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；5. DAB 孵育时间过长或浓度过高；6. PBS 冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP 孵育之后的浸洗尤为重要；7. 标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。
3. 免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些？1、抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。
不知抗体是进口的还是国产的工作液，怎么这么高稀释度也没能做出阳性结果？另外不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必须摸索最佳浓度。
2、抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合;建议微波修复用高火4 次*6min 试试。
有人做过实验，这是最佳的时间和次数。
若不行，还可高压修复。
3、组织切片本身这种抗原含量低；4、血清封闭时间过长。
5、DAB 孵育时间过短。
6、细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。
7、开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。
4. 背景强的原因?1, 考虑一抗浓度高；2,然后调整DAB 孵育时间；3,也要考虑血清封闭时间是否过短4,适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。
5. DAB 显色真的需要3-10 分钟吗？我之前做的显色40 秒就够了，再多本底就太深，现在做另一个显色3 分钟也不出，真的有必要延长显色时间吗？1. DAB 显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；2. DAB 显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；3. 此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；4. DAB 显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4 度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。
6 . 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？，1 烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度二，用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做三，有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲 PBS 不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织，四，用高温修复时，温度骤冷也可能引起。
7. 年前爬的细胞片在-20 度放了半年（保鲜膜密封），现在取出来再作，做了两次，步骤均是按以前的作的，但今天做时，原来显色很强的片子现在显色很弱了，问什么呢？是不是片子放的时间太长了？抗体在 4 度放的时间也不长而且这次浓度比以前做的还高?1. 首先，抗体浓度和孵育时间在免疫组化中至关重要。
在抗原抗体反应并非抗体浓度越高，反应越强烈，这叫前带现象。
所以选择最佳的一抗浓度和孵育条件也是十分重要的，其实抗体浓度过高或过低均会引起阴性。
2. 我到认为你这片子的影响可能更大。
尽管在-20 度保存，但是时间一般超过3 个月就不能保证其中抗原的丢失，建议可以重新爬片，以排除方法和抗原的原因。
3. 你说抗体放在4 度保存是指未稀释还是稀释后抗体，存放多长时间？一般稀释后抗体不能保存很长时间的。
8. 为什么切片倾斜，抗体分布不均匀，就会造成一半阳性，一半阴性？我认为，即使切片倾斜，抗体覆盖少的那部分组织和其他部分抗体的浓度是一样的，只是抗体体积的大小差异！如果说抗体倾斜没覆盖好的地方是阴性，那为什么不是干片所导致的非特异性高背景的染色呢？当切片倾斜到有一半甚至都没液体时，就会出现阴阳脸样的着色。
你认为呢？9. 高温抗原修复后就没必要灭火内源性过氧化物酶?经过高温POD 已经灭活了，不错POD 是被被灭活了，但它仍有还原能力，仍能跟DAB发生氧化还原反应，使DAB 显色，我们用双氧水是耗竭POD 的还原能力，使之不能在跟DAB 反应。
所以无论修复与否都应该灭活POD，尽可能消除非特异性着色。
10. 冰冻切片有时会有小洞?冰冻切片有时会发现切片上会有空洞，这是因为组织在冰冻过程中形成冰晶，形成冰晶的原因一是组织冰冻时间太慢，或者冰冻的温度不够低，慢慢形成冰晶，二是有些组织在冰冻之前需要做适当的固定，如脑组织，然后放入30%的蔗糖4 度冰箱过夜以减少冰晶形成，并且能最大程度保持组织细胞形态。
另外在切片是组织块复温要在37 度速融，否则易造成组织块的破坏。
11. 常用免疫组化结果分析方法?1. 阳性着色细胞计数法。
在40*光镜下，随机选择不重叠的10 个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3~6 张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。
2. 灰密度分析法。
通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用image j 进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。
3. 评分法。
通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3 分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1~4 分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最终可以分数相加，再进行比较。
对于以上这几种方法，各有利弊，请细心选择。
要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。
12. DAB 呈色后到底什么样染色是特异性染色？阳性标记可以从色度特征，阳性标记细胞学特征来进行基本的判断。
色度特征：一般而言，抗原含量越多，分布密度越高，标记方法越敏感，阳性结果显色则越强。
根据阳性标记的显色程度分为：淡黄色，提示为弱抗原；棕黄色，提示为中等度抗原；棕黑色，示为强抗原。
在结果判断中，后两者较有意义，可作为判断依据。
细胞学特征：阳性表达必须在细胞特定的抗原部位，若不在抗原所在部位的阳性表达即使阳性也不应作为判断依据。
一般分为胞膜型，胞核型，胞质型，微绒毛型,复合型几种。
这是需要结合背景知识的。
同样，非特异性染色也有一定的特点：它首先是指抗原无明确定位，各种细胞累及一片，色度无深浅之分，这种标记组织片不能作为免疫组织标记结果判断的依据，造成非选民性染色的原因常为组织标本固定不佳，抗体质量问题或稀释度不合理及操作方法不规范等。
因此，免疫组化特异性染色定位非常重要，一般情况下，阳性细胞与阴性细胞相互交杂，阳性染色强度深浅不一。
如果缺乏细胞音的不均一性染色，即或呈阳性染色，常提示为非特异性染色。
另外，组织片边缘反应和出血坏死灶周围阳笥反应不能作为诊断依据。
13. 1. 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？我用组织芯片和普通切片在多种条件下进行了抗原修复实验，发现在热修复后，组织脱片最主要原因是组织脱水不良，肿瘤组织黏附性差在小块组织时也容易撕脱（减小热修复加热功率，PBS 冲洗时不要直对组织冲洗、可以有效防范）。