冰冻切片漂片

免疫荧光操作步骤（漂片，冰冻切片）

免疫组化步骤：

1.将脑片放到，6 孔板（或12 孔板），按照二抗说明书，加3%双氧水封闭10min（如果是从切片保护液取出，则要用PBS 洗一遍）；（二抗不同，操作步骤有差别），本实验室使用的二抗试剂盒为中杉金桥超敏二步法试剂盒；

2.吸去双氧水，PBS 洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；

3.然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50 微升一抗稀释液，小鼠脑片为30 微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；

4.然后，4℃，过夜（18h 或者24h），不建议使用37℃；

5.然后，PBS 洗净两遍；剩下步骤见二抗试剂盒说明书。

6.DAB 配方为：10mg DAB 固体加到20ml 0.01MPBS，临用时加100-200 微升30%双氧水，注意避光。

7.显色10min，看片子染色深浅情况适当调整显色时间。一般3 分钟显色就比较明显，如果20 分钟仍未显色，则看下面的参考。

8.然后PBS 洗两遍，转移到载玻片，自然晾干。干燥天气2-3h，潮湿天气3-4h。

9.脱水：70%酒精3min，95%酒精3min，100%酒精3min，100%酒精2min，二甲苯2min，二甲苯3-5min。如果片子上盐分较多，在70%酒精前在双蒸水1min。

免疫荧光步骤及注意事项：

1， 将脑片放到 6 空板的山羊血清封闭液中，封闭20-40min；（如果是从切片保护液取出，则要用PBS 洗一遍）

2， 吸去山羊血清，PBS 洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；

3， 然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入PBS 稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50 微升一抗稀释液，小鼠脑片为30 微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；

4， 4℃，过夜（18h 或者24h），不建议使用37℃，如果荧光亮度不强，可以延长孵育时间到48 或72 小时；

5， 然后，PBS 洗净两——三遍，按照二抗说明书稀释的荧光二抗，室温孵育2小时。注意避光操作。

6， 0.01M PBS 洗两遍，转移到载玻片上，避光自然晾干；

7， 滴加防淬灭剂后，盖上盖玻片镜下观察。

常见问题：

1， 荧光太暗：可能蛋白表达少；可能一抗孵育时间短；二抗孵育时间短；清洗次数过多；溶液pH 不合适；荧光萃灭；一抗浓度过低或过高；二抗浓度过低或过高；激发波长不在抗体适用波段。

2， 背景荧光太深：一抗浓度过高，清洗不彻底；二抗浓度过高，清洗不彻底；封闭时间过短，非特异性过强；一抗非特异性过强；二抗非特异性过强；显微镜荧光强度过强。总之实验是喜欢强阳性，不喜欢假阴性，呵呵。任何实验都需要花时间摸索才能找到其最佳的工作条件。

另附免疫组化常见问题解析。原理是相同的，只是最后的显色方法不一样，有些问题有启发作用。

免疫组织化学

1. 边缘效应?

原因: 1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试 剂洗尽所致. 解决办法：制备优质的胶片（APES 或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4 微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。

2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。

2. 产生组织切片非特异性染色的原因有哪些？如何解决？

1. 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。解决办法: 这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。

2. 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。

3. 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；

4. 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；

5. DAB 孵育时间过长或浓度过高；

6. PBS 冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP 孵育之后的浸洗尤为重要；

7. 标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。

3. 免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些？

1、抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。不知抗体是进口的还

是国产的工作液，怎么这么高稀释度也没能做出阳性结果？另外不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必须摸索最佳浓度。

2、抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合;建议微波修复用高火4 次*6min 试试。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。若不行，还可高压修复。

3、组织切片本身这种抗原含量低；

4、血清封闭时间过长。

5、DAB 孵育时间过短。

6、细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。

7、开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。

4. 背景强的原因?1, 考虑一抗浓度高；2,然后调整DAB 孵育时间；3,也要考虑血清封闭时间是否过短

4,适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。

5. DAB 显色真的需要3-10 分钟吗？我之前做的显色40 秒就够了，再多本底就太深，现在

做另一个显色3 分钟也不出，真的有必要延长显色时间吗？

1. DAB 显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；

2. DAB 显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；

3. 此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；

4. DAB 显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4 度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。

6 . 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？，

1 烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度

二，用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做

三，有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲 PBS 不要直接冲到组织上，冲

到组织上方，

让它流下冲洗组织，四，用高温修复时，温度骤冷也可能引起。