六味地黄丸的血清药物化学研究_王喜军

收稿日期 2004 04 08
基金项目 国家留学归国人员科研基金 获奖项目 2002年国家科技进步二等奖
*通讯作者 王喜军:教授,博士生导师,黑龙江中医药大学副校长。

Tel:86 451 82110818,E mail:xijunw @sina com 六味地黄丸的血清药物化学研究
王喜军
1*
,张 宁,孙 晖,孙文军
黑龙江中医药大学药学院,哈尔滨150040
摘 要 目的:对六味地黄丸的血清药物化学进行研究。

方法:建立六味地黄丸及口服六味地黄丸后大鼠血清的HPLC 指纹色谱分析方法;分析比较六味地黄丸、缺味处方、单味生药以及各组分给药后所得血清样品,鉴定口服六味地黄丸后大鼠血中移行成分、来源生药及其代谢产物。

结果:口服六味地黄丸后从血中发现了11个入血成分,其中4个为新产生的代谢产物;7个成分为六味地黄丸所含成分的原型,其中有一成分虽为地黄中所含成分的原型,但其它两种药材也能代谢产生,对其体内的量变有共同的贡献。

结论:血中移行成分及代谢产物将成为六味地黄丸的体内直接作用物质,其来源生药为六味地黄丸的主要药物,对其进行深入的研究,将有助于阐明六味地黄丸的有效成分及作用机理。

关键词 六味地黄丸;血清药物化学;代谢产物;指纹图谱
中图分类号 R931.71,R917 文献标识码 A 文章编号 1672 3651(2004)04 0219 04
中药血清药物化学是以传统药物化学方法为基础,综合应用多种现代技术,分析鉴定口服中药后血清中移行成分,研究其药效相关性,确定中药药效物质基础的应用学科[1]。

应用本方法已经成功地完成了茵陈蒿汤的生物药学研究,首次阐明了该复方的作用机理[2,3];进行了地黄血清药物化学的初步研究[4]。

本实验进行了六味地黄丸的血清药物化学研究。

六味地黄丸出自宋朝钱乙 小儿药证直诀 ,是 滋阴补肾 之首方,现临床上广泛用于多种疾病的治疗。

目前,对六味地黄丸的成分及药效研究较多,但有关的成分研究大多只限于成分的定性、定量的分析,针对药效物质基础的研究很少;有关药效的研究也多只集中在免疫调节作用方面。

六味地黄丸在体内以何种成分、何种形式发挥作用以及作用机理如何,至今少有明确的研究报道。

因此,有必要对六味地黄丸的血中移行成分进行详细的分析,阐明其血中移行成分、代谢产物及方剂的配伍意义,从而有的放矢地改善其生产工艺,提高制备水平,提高临床疗效。

1 实验材料1 1 仪 器
Waters 高效液相色谱仪(Waters 600Controller,Waters 600Pump,Waters 996Photodiode Array Detec tor);Water Symmetry Shield C 18色谱柱(3 9mm 150mm,5 m);Nova Pak C 18Guard Pak 保护柱;80 2型离心机;H66MC 型超声震荡仪;sk 1型快速混匀器。

1 2 药品和试剂
丹皮酚(Paeonol)对照品(中国生物制品药品检定所提供);马钱素(Loganin)对照品(南京中医药大学提供);熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻(均购于哈尔滨市人民药店,经鉴定为正品);乙腈,色谱级(美国迪马(Dikma)试剂公司);其余试剂为分析纯。

1 3 动 物
健康Wistar 大鼠,体重为200 20g,6周龄,雌雄不限,黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

2 实验方法
2 1 六味地黄丸供试品溶液的制备
按药典六味地黄丸处方称取药材,采用2000年版药典方法分别制成六味地黄丸、缺味六味地黄丸及单味丸,各称取1g,用10ml 甲醇超声提取15min(2次),滤过,合并滤液,滤液干燥后加入甲
醇定容为10ml,溶液过0 45 m微孔滤膜即得;另精密称取丹皮酚及马钱素对照品1mg,分别置于10ml容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度摇匀得丹皮酚及马钱素对照品溶液;上述各样品液供HPLC分析使用。

2 2 空白血清及含药血清样品的制备
取Wistar大鼠,禁食12h(自由饮水),按照1 5ml/100g体重,分别灌胃给予蒸馏水、六味地黄丸、缺味六味地黄丸及单味丸的甲醇提取物的混悬液,给药60min后用1%戊巴妥钠麻醉,经肝门静脉取血5ml,血液在3000r/min条件下离心10min,取上清液1ml,加入0 2ml70%高氯酸,快速摇匀,3000r/min条件下离心10min,取上清液过0 45 m微孔滤膜,备HPLC分析。

2 3 HPLC分析色谱条件
Water Symmetry Shield RP18色谱柱(3 9mm 150mm,5 m);Nova Pak C18Guard Pak保护柱;柱温30 ;流速为1ml/min;检测波长200~400nm 扫描;流动相乙腈 0 15%磷酸梯度洗脱:0/100 0~60min
12/88
60~130mi n
30/70。

2 4 六味地黄丸及其血清中成分的分析
取10批六味地黄丸供试品溶液,以及5批六味地黄丸血清样品在相同的色谱条件下进行HPLC分析,建立HPLC色谱图,并比较分析确定进入血液的成分。

并通过缺味六味地黄丸及单味丸及其血清样品的分析测定,对相应的色谱图进行比较分析,确定入血成分的来源药物。

3 结果与讨论
3 1 六味地黄丸给药后血中出现了11个移行成分(图1),与体外样品比较,其中七个为体外成分直接吸收入血,即1、2、4、5、7、10、11号峰为六味地黄丸中所含的原型成分,且1号峰转运入血后的相对含量有较大的提高,而11号峰却明显下降;
3、6、8及9号峰为新产生的代谢产物。

Fig1 Comparis on of the H PLC profile of Lui Wei Di Huang Wan and the serum of rats after oral administration of the drug (A) Detected at238nm;(B) Detected at276nm
a c ontrol serum;
b s erum containing drug;
c Lui Wei Di Huang Wan
经与六味地黄丸、空白血清及单味生药比较分析确定入血成分的来源为:1号峰的归属较为复杂,来源于三种生药。

首先,熟地中含有此成分,此成分在六味地黄丸和熟地中含量均很低,但是吸收入血后此成分的相对含量大大提高,表明复方配伍后其有较强的血中转移能力(图2);其次,在除去熟地的样品给药后,血清中仍然出现1号峰,表明其他药材在体内对1号峰的产生也有贡献;山茱萸和泽泻中虽不含有此成分,但给药后血中也能产生该峰(图略),经光谱分析表明与六味地黄丸血清中的1号峰为同一成分,所以推测山茱萸和泽泻中所含的物质被代谢后共同产生该成分。

可见,复方中三种生药对血中同一成分1号峰有共同贡献,表明熟地配伍山茱萸和泽泻的必要性及复方配伍的科学性。

2、4、5、10号峰为山茱萸所含成分直接入血而形成,经与标准物质对照表明5号峰为来源于山茱萸的马钱素;7和11号峰为牡丹皮中所含成分直接入血而形成(图3),经与标准物质对照表明11号峰为来源于牡丹皮中的丹皮酚;
3、6、8、9号峰为丹皮酚的代谢产物(图4,图5)。

所以,血清样品中丹皮酚峰较体外样品中明显下降。

丹皮酚被吸
收入血后,其代谢产物量较大,具有产生药效的可能性,或许具有更强的生理活性。

从3、6、8、9号峰的保留时间和UV光谱推测可能为丹皮酚的脱甲氧基代谢物、葡萄糖醛酸或胆汁酸的结合体。

Fig2 Comparis on of the H PLC profile of the seru m of rats after oral administration of the Lui Wei Di Huang Wan,radix rehmannia glutinos a and Lui Wei Di Huang Wan without radix rehmannia glutinosa(Detected at238nm)
a c ontrol s erum;
b serum after admini stration of the Lui Wei DiHuang Wan;
c serum after admini stration of the LuiWei DiHuang Wan without radix rehman nia glutinosa;
d serum after admi nistrati on of radi x rehmannia gl utinosa
Fig3 Comparis on of the HPLC profile of the serum of rats after oral administration of the Lu i Wei Di Hu ang Wan,cortex mou tan and Lui Wei Di H uang Wan without cortex moutan(Detected at238nm)
a c ontrol serum;
b serum after admi nistration of the Lui Wei Di Huang Wan;
c serum after admini stration of the Lui Wei Di Huang Wan w i thout cortex moutan;
d serum after adminis trati on of cortex moutan
Fig4 Comparis on of the HPLC profile of the serum of rats after oral administration of the Lu i Wei Di Hu ang Wan,cortex mou tan and Lui Wei Di H uang Wan without cortex moutan(Detected at276nm)
a c ontrol serum;
b serum after admi nistration of the Lui Wei Di Huang Wan;
c serum after admini stration of the Lui Wei Di Huang Wan w i thout cortex moutan;
d serum after adminis trati on of cortex moutan
Fig5 Comparis on of the H PLC profile of Paeonol and the serum of rats after oral administration of Paeonol a c ontrol serum;b s erum af ter adminis tration of Paeonol;c paeonol
3 2 本研究初步阐明了六味地黄丸的体内部分化学成分,其结果已能在某种程度上阐明该方配伍机制及药效物质基础。

本文仅报道血清中有紫外吸收成分的情况,血中成分的分离及鉴定、研究结果将另报。

综合研究结果将对六味地黄丸的深层次研究及开发提供有效支撑。

该研究结果也说明确定中药的药效物质基础的关键,不仅是在体外研究药物的成分,其根本在于要明确中药复方以何种形式进入体内、进入体内后如何变化、药物配伍对血中成分的影响,只有这样我们才能把握中药复方的内在实质,实现经方的科学化、现代化。

参考文献
[1] 王喜军(Wang XJ).中药及中药复方的血清药物化学研究
[J].世界科学技术 中药现代化(World Sci Te ch Mode rniz TCM),2002,4(2):1 5.
[2] 王喜军(Wang X J).茵陈蒿汤的生物药学研究[J].中国中西医结
合肝病杂志(Chin J Inte rg T radit We st Me d Liv Dis),1998,8:10 12 [3] Yoshi hiro Kano,Xij un Wang,Junko Shirakawa,e t al.Phaumacologi
cal properties of galenical preparations( )pharmacoki netics s tudy of6 7 dime thylesculeti n in Rats[J].J Tradit Me d,1994,11(3): 176 180.
[4] 丁 岗(Ding G),崔 瑛(Cui Y),盛龙生(Sheng LS),等.地黄
血清药物化学的初步研究[J].中国天然药物(Chin J Nat Med),2003,1(2):85 88.
Preliminary Study on Serum Pharmacochemistry of Liu Wei Di Huang Wan
W ANG Xi Jun,Z HANG Ning,SUN Wen Jun,SUN Hui
School o f Pharmacy,Heilongjiang University o f Chinese Medicine,Harbin150040,China
ABSTRACT AIM:To study the serum pharmacochemi stry of Liu Wei Di Huang Wan,a traditional Chinese medicine formula M ETHOD:Based on the establi shed HPLC fingerprint of Liu Wei Di Huang Wan,analysis and comparison were carried out among the HPLC profiles of rat serum samples obtained after oral adminis tration of different ingredient preparations such as Liu Wei Di Huang Wan, Liu Wei Di Huang Wan wi thou t one of ingredients and single ingredient crude drug and control serum The compounds absorbed into blood, their original crude drugs and their metabolites were identified RESULT:Eleven compounds were detected after oral ad ministrati on of Liu Wei Di Huang Wan,four of which are metaboli tes and sevem are the original foum of the compounds contained in Liu Wei Di Huang Wan, one of them is ori g i nated from Radi x rehmannia glu tinosa,and also derived from the components ex i sting in fructus corni and rhizoma alis matis,i e three crude drugs contributed on the same compound in serum CONCLUSION:The compounds absorbed into blood and its metabolites are capable of being the effective constituents,the original crude drugs are the main ingredient drugs of the prescr ip tion,and its serum pharmacochemistry should be subject to thouough investegation so as to illuminate the pharmacology and active mechanis m of Liu Wei Di Huang Wan
KEY WORDS Liu Wei Di Huang Wan;Seru m pharmacochemistry;Metaboli te;Fingerprint
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