第四章蛋白质的稳定性

3、超声波 超声波压力使溶解的气体产生小气泡，小气泡迅速 膨胀至一定程度时突然破碎，这就是空化作用，它既 产生机械力，又产生化学变性剂（如在小气泡中热反 应所产生的自由基），结果使蛋白质失活。 4、压力 0.1-6×108pa的压力下可使酶失活。压力诱导的失 活通常认为是蛋白质变性后聚合的结果，但还有另外 两个失活机理： 第一，已经证明，多亚基酶在高压下可解离成单体，取 消压力后，活力得到不同程度的恢复，但很多这类失 活是不可逆的。 第二，关于乳酸脱氢酶的工作表明，半胱氨酸氧化与失 活机理有关，而这个反应与压力引起的酶结构变化有 关。
第二节 蛋白质不可逆失活的原因和机理
失活机理 聚合（有时伴随形成分子间二硫键） 一级结构改变 1、酸、碱催化的肽键水解，蛋白水解作用和 自溶作用 2、功能基氧化（半胱氨酸巯基和色氨酸吲哚 环） 3、二硫键还原，分子间二硫交换 4、必需巯基的化学修饰 5、蛋白质磷酸化 6、在催化过程中由于反应中间物（主要是自 由基）引起的“自杀”失活 7、氨基酸的外消旋化 8 、 二硫 键 剪 切后形 成 新 氨 基酸 （赖 氨 丙 氨 酸、） 9、天冬酰胺脱氨 辅酶分子从活性部位上解离 寡聚蛋白解离成亚基 吸附到容器表面 “不可逆”构象改变 流体中的剪切失活 极端pH值，加热，蛋白水解酶 氧气（特别在加热时）氧气代谢产物，辐射 加热，高pH，巯基化合物,二硫化物 金属离子，二硫化物 蛋白激酶 底物 加热，极端pH 加热，高pH 加热，高PH 螯合剂、透析、加热，金属离子 化学修饰，极端pH, 脲，表面活性剂，高温或低 温 蛋白质浓度低, 加热 加热，极端pH, 有机溶剂,盐酸胍 流体形变 变性条件 加热，变性剂脲，盐酸胍, SDS, 振动
四、氧化作用
各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸以及蛋氨酸、 半胱氨酸和胱氨酸残基。分子氧，H2O2 和氧自由基是常 见的蛋白质氧化剂。在过渡金属离子（如Cu2+ 存在下） ，于碱性pH，半胱氨酸可氧化成胱氨酸。氧化剂强度不 同，半胱氨酸也可转变成次磺、亚磺或磺（半胱氨）酸 。 H2O2是非专一性氧化剂。在酸性条件下，它主要把蛋 氨酸氧化成它的亚砜。
1．
2）蛋白质（酶）要在几乎无水的环境中发挥作用，必须 在其分子表面有一单层必需水来维持它的活性构象，而与 水混溶的有机溶剂能夺去酶分子表面的必需水，因而使酶 失活。
电容器的极板间充满电介质时的电容与极板间为真空时 的电容之比值称为（相对）介电常数。 物料 水 甲醇 煤油 矿物油 油 丙酮 苯 油漆 介电常数 80 33.7 2.8 2.1 4.6 20 2.3 3.5 物料 水泥 干砂 洗衣粉 纯白糖 介电常数 1.5-2.5 2.5 1.2-1.5 3
五、表面活性剂和去污剂
表面活性剂是由疏水基团和亲水基团组成的化合物。 去污剂有离子性和非离子性两大类，都含有长链疏水尾巴 但“头”部基团不同，有带电的，有不带电的 去污剂在很低浓度下能使蛋白质发生强烈的相互作用，导 致蛋白质不可逆变性。 去污剂的关键物理性质是其溶解度。如图4-7所示，当去 污剂单体加入水溶液时，一部分溶解，一部分在气-水界 面形成单层。
5、对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低 结构上重要的氨基酸残基（如活性部位氨基酸） 的氧化作用是蛋白质失活的最常见的机理之一。 半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚环，对氧化特别 敏感，因此，这些不稳定氨基酸的数目，在高度 稳定的嗜热蛋白质中比在相应的嗜温蛋白质中显 著偏低。
6、氨基酸残基的坚实装配
蛋白质结构中存在有空隙。按照Chothia说法，蛋白球 体积的大约25%仍未充满，即不是被氨基酸占据。但溶质 分子可以包埋在这些孔隙中。这些孔隙通常为水分子所充 满。分子量为2―3万的蛋白质中约有个5―15水分子 。由 布朗运动调节的极性水分子与球体疏水核的接触会导致蛋 白质不稳定。随着水分子从孔隙中除去，蛋白质结构变得 更坚实，蛋白质的稳定性也增加。因此，蛋白质的坚实化 可作为一种人为稳定蛋白质的方法。
•DTNB：5, 5’-二硫代 双（2-硝基苯甲酸） 二硫代-双 硝基苯甲酸） ： 二硫代 硝基苯甲酸
八、热 热失活通常也是两步过程：酶可逆热伸展使它的反应基团和 疏水区域暴露，随后相互作用导致不可逆失活。 有两种构象过程能引起不可逆热失活。 第一，由于热伸展，包埋的疏水区域一旦暴露于溶剂，则会发生 蛋白质聚合。 第二，单分子构象扰动能引起酶失活。 高温（90-100℃）下，依赖pH的共价反应限制了酶的热稳定性。 1、Asn和Gln的脱胺作用，在Asp处的肽键水解，Cys的氧化，二硫 交换作用和二硫键的破坏。上述这些破坏性反应直接导致高温下酶 失活。 2、系统中有还原糖（如葡萄糖），糖很易与Lys的ε-氨基作用 ，这叫“Maillard反应”，是食品工业中热失活的原因。
1．
2、高浓度盐
高浓度盐对蛋白质既可有稳定作用，也可有变性作用，这要 看盐的性质和浓度 . 与Hofmeister离子促变序列有关： （CH3 ） 4N+ > NH4+ > K+ , Na+ > Mg2+ >Ca2+ > Ba2+ > SO42- > CI- > Br- > NO3- >CIO4- >SCN1）越靠近序列左侧的离子对蛋白质的稳定作用越强， 2）愈靠近该序列右边的离子越使蛋白质不稳定。 （NH4）2SO4是众所周知的酶稳定剂，贮存酶时常用它。相 反，NaSCN(硫氰酸钠)是已知的紊乱剂，使蛋白质不稳定。
3、螯合 1）结合金属离子的试剂,如EDTA能使金属酶失活，这是由 于EDTA与金属离子形成配位复合物，从而使酶失去金属辅因 子造成的。这类失活常常是不可逆的，但失去金属辅因子也 能引起大的构象变化，从而导致活力不可逆丧失。
1．
2）螯合剂通常可以稳定不需要金属离子的蛋白质，因为螯合 剂可稳定有害的金属离子。
4． 二硫键
大分子的分子内交联可增强其坚实性，并提高 其在溶液中的稳定性。 稳定化指的是熵性质：由于交联即蛋白质中形 成二硫键，伸展蛋白质的熵急剧降低
物质的熵是它所处状态的分子混乱度 (也称无序度)的度量。熵值小的状态对 应比较有序的状态,熵值大的状态对应比 较无序的状态。 一种物质从固态到液态到气态,分子热运 动的混乱程度依次增强,而熵值也依次增 大。
第四章 蛋白质的稳定性和稳定化
第一节 蛋白质的稳定性
一、蛋白质的稳定性指的是蛋白质抵抗各种因素的影 响，保持其生物活力的能力。 二、蛋白质稳定性的分子原因 1、金属离子、底物、辅因子和其它低分子量配体的结 合作用。
金属离子由于结合到多肽链的不稳定部分（特别是弯曲处）， 因而可以显著增加蛋白质的稳定性。当酶与底物、辅因子和其 它低分子量配体相互作用时，也会看到蛋白质稳定性的增加。
三、极端pH
硫代半胱氨酸残基
图4-6 碱催化的β-消除反应破坏二硫键，产生新的分子内交联键（赖氨丙氨 酸）。
肽键水解也容易在强酸条件下或中等pH和高温相结合的条 件下发生。 在极端条件下（6 mol/L HCI，24h, 110℃）蛋白质可完全 水解成氨基酸。 在强酸、中性和碱性pH下容易发生天冬酰胺和谷氨酰胺的 脱氨作用，结果在蛋白质的疏水性内部引进入负电荷，导 致酶失活。
2、蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用
在体内，蛋白质常与脂类或多糖相互作用，形成复合物， 从而显著增加蛋白质稳定性。
当蛋白质形成复合物时，脂分子或蛋白质分子稳 定到加蛋 白质稳定性
3、盐桥和氢键 蛋白质中盐桥的数目较少，但对蛋白质稳定性贡 献很显著。嗜热脱氢酶亚基间区域有盐桥协作系 统，这是嗜温脱氢酶没有的。因此嗜热酶的催化 活力的变性温度和最适温度都比嗜温酶高出约 20℃。 用定点突变法定性定量地测定了引入的氢键对蛋 白质的稳定性的贡献，发现加入的氢键与蛋白质 稳定性无关。
九、机械力 机械力，如压力、剪切力、振动和超声能使蛋白质变性。 从道理上说，变性是可逆的，但这很难验证，因为常伴随 引起不可逆失活的聚合或共价反应。 1． 振动 振动使蛋白质失活的机理是，振动增加气-液界面的 面积。蛋白分子在这个界面上呈线性排列并伸展，以使疏 水残基最大限度地暴露于空气。然后，蛋白质由于疏水区 域的暴露而聚合。 2． 剪切 当酶溶液快速通过管道或膜时，则在管（膜）壁处或 靠近管（膜）壁处产生剪切力梯度。这个梯度能引起蛋白 质构象变化，导致原先埋藏的疏水区域暴露，然后聚合。 失活程度随剪切速度的增大和暴露时间的增长而增加。
食盐 7.5 碳酸钙 8.3-8.8 聚本乙烯 2.4-2.6 橡胶 2-3
七、重金属和巯基试剂 1、已知重金属阳离子，如Hg2+，Cd2+，Pb2+能与蛋白质的巯基 反应（将其转化为硫醇盐），也能与组氨酸和色氨酸残基反 应。银或汞能催化水解二硫键 2、巯基试剂通过还原二硫键也能使酶失活，但这个作用常是 可逆的。 3、低分子量的含二硫键的试剂可与蛋白质巯基作用，形成混 合二硫键，或者在两个半胱氨酸残基之间形成蛋白分子内的 二硫键。双硫试剂与氧化型谷胱甘肽和含有催化作用必需的 巯基的酶之间也会发生同样的二硫交换反应。
7、疏水相互作用
带有非极性侧链的氨基酸大约占蛋白质分子总体积 的一半。它们与水的接触从热力学上来说是不利的 ，因为非极性部分加入水中，会使水的结构更有序 地排列。 水分子的这种结构重排，显然能引起系统的熵降低 和蛋白质折叠状态的改变：蛋白质的非极性部分总 是倾向于使其不与水接触，并尽可能地隐藏在蛋白 球体内部。从而蛋白质稳定性增加。
一、 蛋白水解酶和自溶作用 蛋白水解酶可催化肽键水解。当蛋白质底物也是一种蛋 白水解酶时，就会发生自我降解现象，叫作自溶。 二、聚合 聚合分三步进行：N ← U → A → As 其中N U代表可逆伸展，A是聚合的蛋白质，As是发生了二硫 交换反应的蛋白质聚合物。
1、必须发生单分子构象变化，导致蛋白质可逆变性。这 个过程使包埋的疏水性氨基酸残基暴露于水溶剂。 2、这种三级结构改变了的蛋白质分子彼此缔合，以最大 限度地减少疏水氨基酸残基的不利的裸露。 3、如果蛋白质分子含有半胱氨酸和胱氨酸残基，则会发 生分子间二硫交换反应。 与许多其它蛋白质失活原因不同，聚合并不一定是不可 逆的。使用变性剂破坏分子间的非共价力（氢键或疏水 相互作用）并且在无变性剂时，通过还原和再氧化再生 天然二硫键，则有可能使蛋白质再活化。