第四章蛋白质的稳定性

•DTNB：5, 5’-二硫代 双（2-硝基苯甲酸） 二硫代-双 硝基苯甲酸） ： 二硫代 硝基苯甲酸
八、热 热失活通常也是两步过程：酶可逆热伸展使它的反应基团和 疏水区域暴露，随后相互作用导致不可逆失活。 有两种构象过程能引起不可逆热失活。 第一，由于热伸展，包埋的疏水区域一旦暴露于溶剂，则会发生 蛋白质聚合。 第二，单分子构象扰动能引起酶失活。 高温（90-100℃）下，依赖pH的共价反应限制了酶的热稳定性。 1、Asn和Gln的脱胺作用，在Asp处的肽键水解，Cys的氧化，二硫 交换作用和二硫键的破坏。上述这些破坏性反应直接导致高温下酶 失活。 2、系统中有还原糖（如葡萄糖），糖很易与Lys的ε-氨基作用 ，这叫“Maillard反应”，是食品工业中热失活的原因。
1．
2、高浓度盐
高浓度盐对蛋白质既可有稳定作用，也可有变性作用，这要 看盐的性质和浓度 . 与Hofmeister离子促变序列有关： （CH3 ） 4N+ > NH4+ > K+ , Na+ > Mg2+ >Ca2+ > Ba2+ > SO42- > CI- > Br- > NO3- >CIO4- >SCN1）越靠近序列左侧的离子对蛋白质的稳定作用越强， 2）愈靠近该序列右边的离子越使蛋白质不稳定。 （NH4）2SO4是众所周知的酶稳定剂，贮存酶时常用它。相 反，NaSCN(硫氰酸钠)是已知的紊乱剂，使蛋白质不稳定。
第四章 蛋白质的稳定性和稳定化
第一节 蛋白质的稳定性
一、蛋白质的稳定性指的是蛋白质抵抗各种因素的影 响，保持其生物活力的能力。 二、蛋白质稳定性的分子原因 1、金属离子、底物、辅因子和其它低分子量配体的结 合作用。
金属离子由于结合到多肽链的不稳定部分（特别是弯曲处）， 因而可以显著增加蛋白质的稳定性。当酶与底物、辅因子和其 它低分子量配体相互作用时，也会看到蛋白质稳定性的增加。
EDTA：乙二胺四乙酸
4、有机溶剂 酶既可在水溶液中发挥作用，也可在无水有机溶剂中 发挥作用。 1）当与水混溶的有机溶剂加入蛋白质水溶液中时，则可 看到酶失活。这是因为有机溶剂通过疏水相互作用直接结 合于蛋白质，并改变溶液的介电常数。有机溶剂通过增加 疏水核的溶解度，降低带电表面的溶解度而具有使蛋白质 “从里往外翻”的倾向。
一、 蛋白水解酶和自溶作用 蛋白水解酶可催化肽键水解。当蛋白质底物也是一种蛋 白水解酶时，就会发生自我降解现象，叫作自溶。 二、聚合 聚合分三步进行：N ← U → A → As 其中N U代表可逆伸展，A是聚合的蛋白质，As是发生了二硫 交换反应的蛋白质聚合物。
1、必须发生单分子构象变化，导致蛋白质可逆变性。这 个过程使包埋的疏水性氨基酸残基暴露于水溶剂。 2、这种三级结构改变了的蛋白质分子彼此缔合，以最大 限度地减少疏水氨基酸残基的不利的裸露。 3、如果蛋白质分子含有半胱氨酸和胱氨酸残基，则会发 生分子间二硫交换反应。 与许多其它蛋白质失活原因不同，聚合并不一定是不可 逆的。使用变性剂破坏分子间的非共价力（氢键或疏水 相互作用）并且在无变性剂时，通过还原和再氧化再生 天然二硫键，则有可能使蛋白质再活化。
食盐 7.5 碳酸钙 8.3-8.8 聚本乙烯 2.4-2.6 橡胶 2-3
七、重金属和巯基试剂 1、已知重金属阳离子，如Hg2+，Cd2+，Pb2+能与蛋白质的巯基 反应（将其转化为硫醇盐），也能与组氨酸和色氨酸残基反 应。银或汞能催化水解二硫键 2、巯基试剂通过还原二硫键也能使酶失活，但这个作用常是 可逆的。 3、低分子量的含二硫键的试剂可与蛋白质巯基作用，形成混 合二硫键，或者在两个半胱氨酸残基之间形成蛋白分子内的 二硫键。双硫试剂与氧化型谷胱甘肽和含有催化作用必需的 巯基的酶之间也会发生同样的二硫交换反应。
7、疏水相互作用
带有非极性侧链的氨基酸大约占蛋白质分子总体积 的一半。它们与水的接触从热力学上来说是不利的 ，因为非极性部分加入水中，会使水的结构更有序 地排列。 水分子的这种结构重排，显然能引起系统的熵降低 和蛋白质折叠状态的改变：蛋白质的非极性部分总 是倾向于使其不与水接触，并尽可能地隐藏在蛋白 球体内部。从而蛋白质稳定性增加。
四、氧化作用
各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸以及蛋氨酸、 半胱氨酸和胱氨酸残基。分子氧，H2O2 和氧自由基是常 见的蛋白质氧化剂。在过渡金属离子（如Cu2+ 存在下） ，于碱性pH，半胱氨酸可氧化成胱氨酸。氧化剂强度不 同，半胱氨酸也可转变成次磺、亚磺或磺（半胱氨）酸 。 H2O2是非专一性氧化剂。在酸性条件下，它主要把蛋 氨酸氧化成它的亚砜。
三、极端pH
硫代半胱氨酸残基
图4-6 碱催化的β-消除反应破坏二硫键，产生新的分子内交联键（赖氨丙氨 酸）。
肽键水解也容易在强酸条件下或中等pH和高温相结合的条 件下发生。 在极端条件下（6 mol/L HCI，24h, 110℃）蛋白质可完全 水解成氨基酸。 在强酸、中性和碱性pH下容易发生天冬酰胺和谷氨酰胺的 脱氨作用，结果在蛋白质的疏水性内部引进入负电荷，导 致酶失活。
图4-7 去污剂分子的单体、单 层和胶团形成示意图
表面活性剂分子的两 亲性质使之在水溶液 中能自发形成结构有 序的多分子聚集体, 通常称为胶团
阴离子去污剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），与蛋白质的结合 比例是溶液中游离SDS浓度的函数。当单体SDS浓度使某一生物 结合位点饱和时，则以协同方式结合其它位点，导致蛋白质伸 展。伸展使先前埋藏的疏水性氨基酸残基暴露，有利于SDS的 进一步结合，直至达到饱合为止。对于几乎所有的蛋白质来说， 每克蛋白质结合SDS的最大量类似，大约1.4g/g。SDS-多肽复合 物本质上是胶团，SDS分子聚集在蛋白质暴露的疏水区域周围。 六、 变性剂 1、脲和盐酸胍 高浓度脲（8-10 mol/L）和盐酸胍（6 mol/L）常用于蛋白质 变性，然而，尽管它们作用很有效，却没有普遍接受的作用机 理。
3、螯合 1）结合金属离子的试剂,如EDTA能使金属酶失活，这是由 于EDTA与金属离子形成配位复合物，从而使酶失去金属辅因 子造成的。这类失活常常是不可逆的，但失去金属辅因子也 能引起大的构象变化，从而导致活力不可逆丧失。
1．
2）螯合剂通常可以稳定不需要金属离子的蛋白质，因为螯合 剂可稳定有害的金属离子。
4． Βιβλιοθήκη Baidu硫键
大分子的分子内交联可增强其坚实性，并提高 其在溶液中的稳定性。 稳定化指的是熵性质：由于交联即蛋白质中形 成二硫键，伸展蛋白质的熵急剧降低
物质的熵是它所处状态的分子混乱度 (也称无序度)的度量。熵值小的状态对 应比较有序的状态,熵值大的状态对应比 较无序的状态。 一种物质从固态到液态到气态,分子热运 动的混乱程度依次增强,而熵值也依次增 大。
2、蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用
在体内，蛋白质常与脂类或多糖相互作用，形成复合物， 从而显著增加蛋白质稳定性。
当蛋白质形成复合物时，脂分子或蛋白质分子稳 定到疏水簇上，因而防止疏水簇与溶剂的接触， 屏蔽了蛋白质表面的疏水区域，从而显著增加蛋 白质稳定性
3、盐桥和氢键 蛋白质中盐桥的数目较少，但对蛋白质稳定性贡 献很显著。嗜热脱氢酶亚基间区域有盐桥协作系 统，这是嗜温脱氢酶没有的。因此嗜热酶的催化 活力的变性温度和最适温度都比嗜温酶高出约 20℃。 用定点突变法定性定量地测定了引入的氢键对蛋 白质的稳定性的贡献，发现加入的氢键与蛋白质 稳定性无关。
3、超声波 超声波压力使溶解的气体产生小气泡，小气泡迅速 膨胀至一定程度时突然破碎，这就是空化作用，它既 产生机械力，又产生化学变性剂（如在小气泡中热反 应所产生的自由基），结果使蛋白质失活。 4、压力 0.1-6×108pa的压力下可使酶失活。压力诱导的失 活通常认为是蛋白质变性后聚合的结果，但还有另外 两个失活机理： 第一，已经证明，多亚基酶在高压下可解离成单体，取 消压力后，活力得到不同程度的恢复，但很多这类失 活是不可逆的。 第二，关于乳酸脱氢酶的工作表明，半胱氨酸氧化与失 活机理有关，而这个反应与压力引起的酶结构变化有 关。
1．
2）蛋白质（酶）要在几乎无水的环境中发挥作用，必须 在其分子表面有一单层必需水来维持它的活性构象，而与 水混溶的有机溶剂能夺去酶分子表面的必需水，因而使酶 失活。
电容器的极板间充满电介质时的电容与极板间为真空时 的电容之比值称为（相对）介电常数。 物料 水 甲醇 煤油 矿物油 油 丙酮 苯 油漆 介电常数 80 33.7 2.8 2.1 4.6 20 2.3 3.5 物料 水泥 干砂 洗衣粉 纯白糖 介电常数 1.5-2.5 2.5 1.2-1.5 3
五、表面活性剂和去污剂
表面活性剂是由疏水基团和亲水基团组成的化合物。 去污剂有离子性和非离子性两大类，都含有长链疏水尾巴 但“头”部基团不同，有带电的，有不带电的 去污剂在很低浓度下能使蛋白质发生强烈的相互作用，导 致蛋白质不可逆变性。 去污剂的关键物理性质是其溶解度。如图4-7所示，当去 污剂单体加入水溶液时，一部分溶解，一部分在气-水界 面形成单层。
九、机械力 机械力，如压力、剪切力、振动和超声能使蛋白质变性。 从道理上说，变性是可逆的，但这很难验证，因为常伴随 引起不可逆失活的聚合或共价反应。 1． 振动 振动使蛋白质失活的机理是，振动增加气-液界面的 面积。蛋白分子在这个界面上呈线性排列并伸展，以使疏 水残基最大限度地暴露于空气。然后，蛋白质由于疏水区 域的暴露而聚合。 2． 剪切 当酶溶液快速通过管道或膜时，则在管（膜）壁处或 靠近管（膜）壁处产生剪切力梯度。这个梯度能引起蛋白 质构象变化，导致原先埋藏的疏水区域暴露，然后聚合。 失活程度随剪切速度的增大和暴露时间的增长而增加。
5、对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低 结构上重要的氨基酸残基（如活性部位氨基酸） 的氧化作用是蛋白质失活的最常见的机理之一。 半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚环，对氧化特别 敏感，因此，这些不稳定氨基酸的数目，在高度 稳定的嗜热蛋白质中比在相应的嗜温蛋白质中显 著偏低。
6、氨基酸残基的坚实装配
蛋白质结构中存在有空隙。按照Chothia说法，蛋白球 体积的大约25%仍未充满，即不是被氨基酸占据。但溶质 分子可以包埋在这些孔隙中。这些孔隙通常为水分子所充 满。分子量为2―3万的蛋白质中约有个5―15水分子 。由 布朗运动调节的极性水分子与球体疏水核的接触会导致蛋 白质不稳定。随着水分子从孔隙中除去，蛋白质结构变得 更坚实，蛋白质的稳定性也增加。因此，蛋白质的坚实化 可作为一种人为稳定蛋白质的方法。
有两个特点已经明确， 第一，这些试剂消除了在维持蛋白质三级结构中起重要作 用的疏水相互作用。 第二，它们直接与蛋白质分子作用。尽管准确的作用机理 不清楚，但脲及盐酸胍广泛用于检测蛋白质可逆伸展的构 象稳定性。 应当特别注意的是，由脲可自发形成氰酸盐。8 mol/L脲 溶液平衡时大约含有0.02 mol/L氰酸盐。氰酸盐可与蛋白 质中的氨基和巯基相互作用，引起不可逆失活。因此，脲 溶液应在用前用优质固体脲新鲜配制
第二节 蛋白质不可逆失活的原因和机理
失活机理 聚合（有时伴随形成分子间二硫键） 一级结构改变 1、酸、碱催化的肽键水解，蛋白水解作用和 自溶作用 2、功能基氧化（半胱氨酸巯基和色氨酸吲哚 环） 3、二硫键还原，分子间二硫交换 4、必需巯基的化学修饰 5、蛋白质磷酸化 6、在催化过程中由于反应中间物（主要是自 由基）引起的“自杀”失活 7、氨基酸的外消旋化 8 、 二硫 键 剪 切后形 成 新 氨 基酸 （赖 氨 丙 氨 酸、） 9、天冬酰胺脱氨 辅酶分子从活性部位上解离 寡聚蛋白解离成亚基 吸附到容器表面 “不可逆”构象改变 流体中的剪切失活 极端pH值，加热，蛋白水解酶 氧气（特别在加热时）氧气代谢产物，辐射 加热，高pH，巯基化合物,二硫化物 金属离子，二硫化物 蛋白激酶 底物 加热，极端pH 加热，高pH 加热，高PH 螯合剂、透析、加热，金属离子 化学修饰，极端pH, 脲，表面活性剂，高温或低 温 蛋白质浓度低, 加热 加热，极端pH, 有机溶剂,盐酸胍 流体形变 变性条件 加热，变性剂脲，盐酸胍, SDS, 振动