流式细胞术的原理和临床

四．细胞凋亡研究上的应用
细胞死亡在多细胞生物通过两种机 理而产生，即凋亡和坏死。凋亡不仅与 个体形成等基本生命现象有关，而且与 癌、AIDS等多种疾病的发生密切相关。 电泳分析可见DNA呈阶梯状改变。使用 FCM能精确定量凋亡细胞，同时可进行 多参数分析。
原位标记DNA断裂的方法已用来鉴别凋 亡的细胞，使用生物素或地高辛标记的 脱氧核苷酸在外源性DNA聚合酶或TdT 作用下，标记3`-OH。荧光素标记的二抗 与其结合，用流式细胞术检测凋亡细胞。
一、临床免疫学中的应用
1、机体免疫状态评估
就用FCM及荧光染料标记的特导性单克隆 抗体，可对细胞表面标记物进行研究。结合细 胞分选技术，将分选同鉴定结合进行，可分离 出所需的细胞群体，纯度可达95%以上。现在 命名的CD系列已有130种细胞表面分化抗原， 可分选、分析出外周血细胞、亚群及亚群中的 亚群，也可以对循环免疫复合物及其它免疫指 标检测。例如，HLA-B27检测，其抗原阳性与 强直性脊柱炎及炎症性肠病等有不同程度的正 相关。
1．2 细胞群体及细胞表面标记变化的检 测 可以发现体内外细胞表型及细胞亚群 的微小变化，有利于发现恶变的肿瘤细 胞，或在免疫治疗及宿主排异反应中抗 原决定簇发生改变的细胞群体。
1．3 细胞表面抗原决定簇性质研究 1．4 细胞表面标记的分子变化的定量分
析
1．5 细胞抗原表Hale Waihona Puke Baidu的研究
细胞抗原的表达和细胞的其他生物 和生化变化一样，是细胞增殖和增殖活 动中的一种现象。研究正常和肿瘤细胞 增殖、分化及周期活动中抗原表达，对 于加深对肿瘤发生、发展、肿瘤细胞及 肿瘤实体的异质性，肿瘤入侵转移的认 识和它们同肿瘤诊治，耐药性的认识是 十分重要的。
三．细胞内PH及Ca2+测定
Ca2+除了作为细胞内许多关键和功能 蛋白的辅基之外，还是重要的细胞内信 使，测定细胞内Ca2+的变化，对于了解细 胞内信息传递，细胞调亡等都有一定的 意义。使用Ca2+特异的Fluo—3染料标记 细胞可用FCM测定Ca2+的变化。
用 SNARF—1 标 记 细 胞 ， 用 FCM 可 测 定细胞内PH，例如癌细胞在受到加热或 化疗细胞内PH下降。
Cyclin家族中有8种CyclinA、B、C、D、 E、F、J、H。Cyclin A、B、F及E在细胞 周期中不间断的表达。这些蛋白质合成 及降解构成了细胞周期的特征性。
增殖细胞核抗原PCNA是一稳定的细胞周 期相关性核蛋白，在G1期和S早期， PCNA水平升高2~3倍，在G2期保持低值。
Ki-67核抗原可见细胞周期全过程，而静 止期G0无表达。
溴脱氧脲嘧啶核苷替代胸腺嘧啶脱氧核 苷参与DNA的合成，测定DNA的合成速 率。
异染性荧光染料AO，同染DNA、RNA识 别G0/G1期。
二．测定细胞周期蛋白、癌基因及抗癌 基因蛋白
对细胞周期调节机理研究进展较快，
真核细胞的增殖是控制在细胞周期的特 定阶段，特别是在G1到S期以及G2到M 期 移 行 部 位 。 Cyclin （ 周 期 蛋 白 ） 作 为 Cyclin依赖性cdk复合体的调节亚单位， 对细胞周期起重要的调节作用。
P53已被认为是一种抗癌基因。野生型 P53蛋白是一种细胞生长抑制物，能阻断 细胞周期循环。人类的许多恶性肿瘤中， 可见P53突变，用FCM可以测定P53在癌 细胞内表达，从而评估诊断和预后。
P53 Tumour Suppressor Gene
Human p53 Protein –Antibody Mapping Sites
一、细胞表面标记及抗原决定簇性质的 研究 流式细胞术在细胞表面标记，特别 是肿瘤细胞表面标记的研究中，以及在 细胞分类和亚群的分析上，开始了一场 细胞免疫学的革命。尤其在细胞表面标 记分析上，占有举足轻重的地位。
1．1 血液系统细胞表面标记的研究 可 用于白血病细胞的免疫分型和淋巴瘤的 研究。
AIDS，大多数有明显的T4/T8降低，应用 FCM行T4、T8细胞计数及T4/T8比值测定， 可作为排除诊断的方法。
用抗P-170抗体标记肿瘤细胞，用流式细 胞术可直接测定P-170表达。也可用罗丹 明荧光染料作为被测抗癌药物在细胞中 的积聚。在耐药细胞有P-170糖蛋白的过 表达，使进入细胞的罗丹明荧光染料可 以被泵出细胞外，细胞内的罗丹明减少， 荧光强度降低，可以用FCM检测。
流式细胞术在免疫学中的应用
C-erB-2，产物是分子量为190KD跨膜糖 蛋白，其结构类似于表皮生长因子受体， 过表达C-erb常常与肿瘤细胞较快增生及 病人预后有关，使用FCM可测定C-erb-2 在乳腺癌等中的表达，并可进而分析与 病人预后的关系。
MYC基 因家族由 C-MYC、N-MYC及LMYC构成，也是与细胞增殖有关的癌基 因，最近的研究提示MYC基因与凋亡的 诱导有关。
凋亡蛋白的检测：
反映细胞凋亡的早期蛋白Annexit V 其他P53蛋白、Myc蛋白、bcl-2蛋白、 Bax蛋白等等。
五、多药耐药检测
近年来的研究发现癌细胞耐药性与
癌细胞内存在耐药基因有关。多药耐药 基因（multidrug resistant gene,MDR）的 产物为P-糖蛋白（P-GP或P-170）。P-170 是分子量为170KD的跨膜蛋白，利用 ATP的能量将抗癌药物排出细胞外。除 在正常细胞上表达外，常常在许多实体 肿瘤细胞及白血病中高表达，提示耐药 性增高。故对于肿瘤化疗病人，检测P170有重要的临床意义，可指导癌症治疗。
用于免疫细胞表型分析的基本抗体
IgG1/IgG2 CD45/CD14 CD3/CD4
CD3/CD8 CD3/CD16+56 CD19
1．1免疫缺陷病
它是由于机体免疫系统先天发育不
全或后天受损所致的一种临床综合症。 用FCM行T细胞表型分析大多数可用于分 类诊断先天性或获得性的免疫缺陷综合 症。如大多数伴严重联合免疫缺陷 （SCID）的患者血中缺乏成熟的T细胞， 个别病例血中有循环T细胞，但表型异常。