饮用水中微生物检测方法(粪链球菌铜绿假单胞菌产气荚膜梭菌)

其他形态菌落 成非左述各种 反应结果
产氨试验（+）
产氨试验（+）、 氧化酶（+）、 荧光试验（+） 铜绿假单胞菌阳性 非铜绿假单胞菌
铜绿假单胞菌阳性
铜绿假单胞菌阳性
菌数计算、报告结果
过滤操作方式和滤膜放 推测性试验 置培养时注意事项
Ø 水样过滤 依照水质确定稀释倍数，用 0.45μm 的滤膜 过滤250ml水样。 Ø 培养： CN 培养基 36℃±1℃培养40h~48h。 Ø 计数 20h~24h和40h~48h观察菌落并计数； 蓝色 or 绿色判定为铜绿假单胞菌，非蓝绿 产荧光和红褐色菌落进一步确证性试验。
铜绿假单胞菌在CN板上
Ø 营养琼脂 Ø 氧化酶试验
确证性试验
在 CN 琼脂上培养 20~24h 的可疑菌落接种，在 36 ℃±1 ℃ 培养20h~24h，检查再次纯化的菌落。 选最初为红褐色菌落试验， 10s内成深蓝紫色为阳性反应， 注意反应操作方法。
Ø 金氏B培养基
红褐色、氧化酶阳性的接种 36℃±1℃ 24h~5d，每天紫 外灯检，5d内有荧光为阳性。
粪链球菌特性
• 粪链球菌菌形圆或椭圆，可顺链的方向延长,直径0.5 微米 ~1.0 微米 , 大多数成双或短链状排列 , 通常不运动。 在丰富培养基上菌落大而光滑，直径1毫米~2毫米， 全缘，罕见色素。其营养要求低，在普通营养琼脂上 也可生长。能在10℃~45℃ pH9.6或含6.5%NaCl肉汤 培养基中生长，并能耐65℃ 30分钟。它可利用精氨 酸为能源，发酵山梨醇，不发酵阿拉伯糖。在简单的 培养基上生长不需叶酸。
Ø根据蓝色和绿色菌落的计数和确证性试验的结果 ，计算每 250ml水样中铜绿假单胞菌的数量，结果以CFU/250ml计。
第三部分 产气荚膜梭菌的检测
产气荚膜梭菌生物系特性
Ø 菌体较大，大小为(0.9～1.3)×(3.0～9.0)微米,无鞭毛，有荚膜。 芽孢椭圆形,位于偏端。专性厌氧。菌落直径2～5毫米，血琼脂 革兰氏染色阳性 平板上有溶血圈。糖发酵能力强，产酸产气。本菌的特征之一 是在牛乳培养基中呈暴烈发酵现象。 Ø 为革兰阳菌粗短大杆菌。两端钝圆，单个或成双排列，偶见链 状。芽胞椭圆形，位于菌体中央或次极端，芽胞直径不大于菌 体，在一 般培养时不易形成芽胞，在无糖培养基中有利于形成 芽胞。在机体内可产 • • 假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂平板 金氏B培养基斜面 乙酰胺肉汤 营养琼脂 氧化酶试剂 钠氏试剂
铜绿假单胞菌检测程序
水样 取250ml水样过滤 将滤膜移放在CN琼脂培养基上 36℃± 1℃ 24h～48h 可疑菌落分别计数
蓝/绿色菌落
产荧光（非蓝/绿色）菌落
红褐色菌落
报告
Ø 依据典型菌落的计数和确证性试验为阳性 的结果，计算250ml水样中粪链球菌数量， 结果以CFU/250mL计。
第二部分 铜绿假单胞菌的检测
铜绿假单胞菌特性
Ø 一种常见的条件致病菌，属于非发酵革兰氏阴性杆菌。菌体细 长且长短不一， 铜绿假单胞菌有时呈球杆状或线状，成对或短 链状排列。菌体的一端有单鞭毛，在暗视野显微镜或相差显微 镜下观察可见细菌运动活泼。 Ø 本菌为专性需氧菌，生长温度范围 25~42℃，最适生长温度为 25~30℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点可 用以鉴别。在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素， 如绿脓素（pyocynin）与带荧光的水溶性荧光素（pyoverdin） 等。在血平板上会有透明溶血环。
GB/T 8538-2008铜绿假单胞菌检测
Ø 适用于饮用天然矿泉水的检测 Ø 原理
滤膜法：250ml 水样用0.45μm的滤膜过滤，滤膜 在 CN 琼脂上于 36 ℃±1 ℃中培养 48h ，能生长并 产生绿脓菌素，或者生长且氧化酶阳性、紫外 360±20nm产生荧光、能利用乙酰胺产氨的革兰 氏阴性菌无芽孢杆菌，则存在绿脓杆菌，结果阳 性。
N P F (C F / nF ) R(C R / nR ) 式中： P 呈蓝 / 绿的菌落数（所有证实 为铜绿假单胞菌的菌落 ）； F 显荧光的菌落数； R 呈红褐色的菌落数； nF 进行产氨测试的显荧光 菌落数； C F 产氨阳性的显荧光菌落 数； nR 进行产氨、氧化酶、金 氏B培养基上显荧光测试的 红褐色菌落数； C R 产氨、氧化酶、金氏 B培养基上显荧光测试均 呈阳性的红褐色菌落数
培养基
• KF链球菌琼脂平板 • 脑-心浸萃琼脂液体培养基 • 脑-心浸萃琼脂斜面
粪链球菌检测程序
水样 取250ml水样过滤 将滤膜移放在KF琼脂培养基上 36℃±1℃、48h，红色或粉红色菌落计数、镜检形态 挑取典型菌落3～5，分别接种脑-心浸萃琼脂培养基 45℃ 过氧化氢酶试验 48h 36℃± 1℃ 3d
GB/T 8538-2008粪链球菌检测
Ø 适用于饮用天然矿泉水的检测 Ø 原理
滤膜法：250ml 水样用0.45μm的滤膜过滤，滤膜 在KF链球菌琼脂上于36℃±1℃中培养48h，选择 红色或者粉红色菌落在脑-心浸萃琼脂上进行确证 实验，过氧化氢酶反应阴性，并能在脑-心浸萃液 体培养基上于 45 ℃培养后浑浊生长，则存在，结 果阳性。
Ø 乙酰胺肉汤试管
接种营养琼脂纯化的菌落36℃±1℃ 20~24h，加钠氏试 剂，色泽深黄到砖红，产氨阳性。
金氏B培养基产生荧光
阴性 阳性 阳性
乙酰胺肉汤培养液
砖红色
深黄色
阳性
阴性
计数结果及报告
Ø滤膜上特征菌落证实为铜绿假单胞菌的菌落，计算菌落时应考 虑到验证试验的比例及特定的水量，如矿泉水、泉水和其他瓶 装水，水样的体积应为250ml。菌落数按下述式子计算。
45℃生长试验
胆汁肉汤试验
菌数计算、报告结果
推测性试验
过滤操作方式和滤膜放 置培养时注意事项
Ø 水样过滤 依照水质确定稀释倍数，使得过滤 250ml 水样滤膜上菌落数20个~100个。 Ø 培养：36℃±1℃培养48h。 Ø 计数 对滤膜上红色或者粉红色菌落进行革兰氏 染色、显微镜镜检， G+ ，计数 250ml 水样 中粪链球菌数。
KF链球菌琼脂上菌落
确证性试验
Ø 滤膜上的典型菌落在脑 - 心浸萃琼脂斜面培养， 36℃±1℃ 24h~48h，有菌落继续。 Ø 过氧化氢酶反应 取培养物在洁净载玻片上，滴加3%过氧化氢。有 气泡阳性，不是粪链球菌；无为阴性，继续。 Ø 继续培养 转移到脑-心浸萃液态培养基和胆汁液态培养基分 别于45℃ 48h和36℃±1℃ 3d。 Ø 判定：若生长，为阳性。