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AAV包装技术问题解答

AAV包装技术问题解答

3、Q:重组AAVs的克隆容量有多大?
维真回答:AAV具有~4.7Kb的包装能力。2个ITR之 间插入的DNA长度接近允许的最大值4.7Kb时,包装 效率显著降低。例如,对于过表达来自cDNA的基因, CMV-poly(A)信号元件约为1KB,因此最大可包装 的cDNA长度约为3.2kb,如果共表达GFP(约 0.8kb),则可包装的容量大约为2.4kb。
4、Q:哪些血清型的 AAV 可供选择? 我该选 用哪种AAV呢? • 维真回答:目前为您提供的 AAV 血清型为 AAV1,AAV2,AAV5,AAV7,AAV6, AAV8 & AAV9。请参阅下面指南中参考文 献的建议。 • 同时参阅转染效率与不同细胞类型对照表, 以确定哪种血清型AAV更适合您的细胞。
山东维真生物科技有限公司
Shandong Vigene Biosciences,lnc.
AAV包装(腺相关病毒技术问题答疑)
AAV包装问题解答
• 1、Q:什么是adeno-associated virus (AAV) • 维真回答:腺相关病毒(AAV)属于微小病毒科, 是一类小的、二十面体、无包膜病毒。需要辅助 病毒如腺病毒或疱疹病毒参与复制。AAV不编码 自己的聚合酶,因此其复制过程依赖于宿主细胞 的聚合酶活性。 AAV是一种复制缺陷病毒,复 制依赖于其他辅助病毒,如腺病毒和疱疹病毒。
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2、Q:什么是recombinant AAV(rAAV) & helper free rAAV?
维真回答:重组AAV(rAAV)是人工改造的AAV, 没有编码AAV病毒复制和结构蛋白的rep和cap基因。 rAAV中与复制和包装相关的rep和cap 基因被替换 为ITRs间的基因或结构,这使rAAV具有4.1-4.9 kb 的包装容量。

AAV病毒包装步骤

AAV病毒包装步骤

A Protocol for AAV vector production and purificationHiroaki Mizukami, Takashi Okada, Takashi Matsushita, and Keiya Ozawa Division of Genetic Therapeutics, Center for Molecular Medicine,Jichi Medical School1. IntroductionThe protocol describe at below is typical of methods that are used topropagate and purify AAV vectors for experiments both in vitro and in vivo.2. Principles of the Triple Plasmid Transfection SystemThe minimum regions in helper adenovirus that mediate the replication ofthe AAV vector are E1, E2A, E4, and VA1. The 293 line of humanembryonic kidney cells encodes the E1 region of the Ad5 genome2. When a helper plasmid that encodes the E2A, E4, and VA regions (Ad-helperplasmid) is used to transfect 293 cells, together with plasmids that encodethe genome of the AAV vector (vector plasmid), as well as the rep and capgenes (AAV-helper plasmid), the AAV vector is produced as efficiently aswhen infection by adenovirus is used as a source of helper virus. Elimination of the heat-inactivation step directed against contaminating adenovirus canimprove the yield of the virus. Furthermore, contamination of the AAVvector stock by most adenoviral proteins can be avoided when this helpervirus-free method is used.3. ReagentsHelper plasmid DNA (pHLP, pAdeno)Vector plasmid harboring the gene of interest flanked by inverted terminalrepeats (ITRs )293 cells (human embryonic kidney cells)DMEM/F12 culture mediumFetal bovine serum2 x HBS buffer, containing 290 mM NaCl, 50 mM HEPES buffer and 1.5mM Na2HPO4, pH 7.1300 mM CaCl2Phosphate-buffered saline (PBS)1 M HEPES buffer, pH 7.4100 mM Tris-HCl (pH 8.0) plus 150 mM NaCl (TBS)0.5 M EDTA (pH 8.0)40% sucrose plus 0.01% BSA in TBSDNase buffer, containing 50 mM Hepes (pH 7.6), 0.15 M NaCl and 10 mM MgCl2HNE buffer, containing 50 mM Hepes (pH 7.4), 0.15 M NaCl and 25 mMEDTAA solution of CsCl in HNE (1.25 g/ml) in HNEA solution of CsCl in HNE (1.50 g/ml) in HNE4. PlasmidsThe AAV vector plasmid, pAAVlacZ, harbors a beta-galactosidaseexpression cassette flanked by inverted terminal repeats (ITRs). The AAV-helper plasmid pHLP, harboring rep and cap, has been descriped previously as pHLP19. The Ad-helper plasmid pAdeno is identical to pVAE2AE4-5and encodes the entire E2A and E4 regions plus the VA RNA I and II genes1.5. Transfection and Extraction of VirusThis protocol is for the transfection of cells in one 225-cm2 flask. Forcultures of other sizes, multiply volumes on a linear basis.Plate trypsinized 293 cells at 5 x 106 cells per 225-cm2 flask to generate amonolayer of 20% to 40% confluence when cells attach initially to thesurface of the flask. Use 40 ml of medium per flask and try to avoid platingclumps of cells and to make sure that cells are distributed evenly on thesubstratum. An even density of cells over the entire substratum is essentialfor high yield and it can be achieved by moving the flask of newly platedcells gently in a crosswize pattern before cells become attached. Place theplate in an incubator in 5% COin air and allow cells to grow to 80%2confluence (24 to 48 h.).One hour before transfection, replace half the medium in the flask withfresh medium. Add 23 µg of vector and of each helper plasmid to 4 ml of300 mM CaCl. Gently add this solution to 4 ml of 2x HBS and mix2immediately by gentle inversion three times. Immediately pipette thismixture into the 225-cm2 flask of 293 cells in 40 ml of DMEM/F12 mediumplus 10% FCS and swirl to produce a homogeneous solution. Immediatelyreturn the plate to the incubator and incubate at 37o for 4 to 6 hr. Do notdisturb the plate during this period. At the end of the incubation, replace the medium with pre-warmed DMEM/F12 culture that medium contains 2%FCS. Three days after transfection, add 1 ml of 0.5 M EDTA to the flask and incubate for 3 min at room temperature. Collect the suspension of cells and centrifuge it at 300xg for 10 min. Remove the supernatant and resuspend the cells in the pellet in 2 ml of TBS.Freeze and thaw the cells that have been suspended in TBS three times by placing them alternately in a dry ice/ethanol bath until the suspension iscompletely frozen and in a water bath of 37o C until it is completely thawed.Return the sample to the ice bath immediately when it is completely thawed.Remove tissue debris by centrifugation at 10,000xg for 10 min and collectthe supernatant.6. Purification of the AAV vectorPrepare supernatants, as described above from 24 flasks. Place 11 ml of asolution of 40% sucrose plus 0.01% BSA in TBS in a sterile ultracentrifuge tube (Ultrabottle #3430-3870; Nalge Nunc, Rochester, NY). Carefullyoverlay the 48 ml of pooled supernatants on this solution. Pellet the crudeviral particles by centrifugation at 100,000xg for 16 hr at 4o C. Resuspend the pellet by vigorous agitation in 5 ml of DNase buffer. Add 1,000 units ofDNase I and incubate for 1 hr at 37o C. Add 250 µL of 0.5 M EDTA and then remove debris by centrifugation at 10,000xg for 2 min. Then filter thesupernatant through a low-protein-binding 5-µm syringe filter (SterileAcrodisc Syringe Filter; Pall Gelman Laboratory, Ann Arbor, MI). Load the filtered material onto a two-tier CsCl gradient (1.25 g/ml and 1.50 g/ml)prepared in HNE buffer. Spin the gradient at 35,000 rpm for 2 h at 16o C inan SW40 rotor (Beckman Instruments, Palo Alto, CA). Collect the band ofviral particles and load it on a second two-tier CsCl gradient (1.25 g/ml and1.50 g/ml) prepared in HNE buffer. Spin the gradient at 65,000 rpm for 2 hat 16o C in a VTi65.2 rotor (Beckman Instruments). Collect fractions of 0.5ml each and select the virus-rich fraction by semi-quantitative PCR analysis, Western blotting with antibodies against Cap, or quantitative DNA dot-blot hybridization. Use a dialysis cassette (Slide-A-Lyzer; Pierce, Rockford, IL)to desalt the virus-rich fraction by three cycles of dilution with 300 ml ofHNE buffer. Concentrate the material to 50 µL with Ultrafree-4 (Millipore, Bedford, MA) according to the manufacturer's instruction. The final titerusually ranges between 1 x 1013 and 5 x 1013 particles from 5 x 108 293 cells, as determined by quantitative DNA dot-blot hybridization or Southernblotting. In the case of an AAV vector that expresses lacZ, production of the vector can be assessed functionally by titration with 293 cells in the presence of a wild-type adenovirus type 2 at an MOI of 50. The transduced cells areincubated for 24 h at 37o C before fixation and X-gal staining. Stained cellsare counted under a light microscope. The ratio of genomes to functionalviral particles is determined from the total number of genomes divided bythe total number of functional units (as determined by X-gal staining) forverification of infectivity.7. References1.T. Matsushita, S. Elliger, C. Elliger, G. Podsakoff, L. Villarreal, G. J.Kurtzman, Y. Iwaki, and P. Colosi, Gene Ther. 5, 938 (1998).2. F. L. Graham, J. Smiley, W. C. Russell, and R. Nairn, J. Gen. Virol. 36, 59(1977).。

把糖揣进了错误的兜-聊一聊AAV的交叉包装与嵌合包装

把糖揣进了错误的兜-聊一聊AAV的交叉包装与嵌合包装

把糖揣进了错误的兜-聊一聊AAV的交叉包装与嵌合包装在 AAV 介导的基因治疗中,制造出可以高效并有选择性地转导特定组织和细胞类型的 AAV 衣壳,是科研人员需要克服的一个难关。

目前病毒衣壳改造最为通用的方法,是利用理性设计或者同源重组的方法,构建具有高度多样性的AAV 变体文库,接着将病毒文库注射到模型动物体内感染目的细胞,然后利用定向进化完成对病毒衣壳的筛选。

对于大多数的AAV衣壳文库来说,其丰富的序列多样性让科研人员对病毒文库的生产过程格外小心谨慎。

在病毒包装时,多个携带不同衣壳序列的质粒会被同时转染到一个细胞当中,这将对病毒的包装会产生怎么样的影响呢?小编带大家来一起看一看。

一. AAV的交叉包装与嵌合包装AAV病毒衣壳由三种衣壳蛋白亚基VP1、VP2 和VP3 组成,它们以1:1:10 的比例从同一个开放阅读框中产生,其中VP1的mRNA 在经过了可变剪接后被翻译,VP2与VP3的翻译则是利用了读码框序列中的替代翻译起始点。

野生型AAV 的基因组包含两个基因,分别可以编码四种复制蛋白和以上的三种衣壳蛋白,基因组两侧各有 145 bp 反向末端重复序列(ITR)。

在AAV病毒生产的过程中,携带复制蛋白与衣壳蛋白基因的质粒,会被转染进入宿主细胞,并进行转录翻译。

三个衣壳蛋白亚基自发组装病毒颗粒,并将ITR与内侧的AAV基因组包装到病毒颗粒当中。

图一. AAV的交叉包装与嵌合包装然而,对于为衣壳改造所构建的AAV 文库来说,这个病毒包装的过程要更复杂一些。

在质粒转染过程中,单个宿主细胞会被转染进几百到上万个外源质粒。

AAV衣壳文库具有高度的衣壳序列多样性,大量携带了不同衣壳序列的质粒会被同时转染到一个细胞当中,并在细胞中转录、剪接、翻译、包装。

因此在包装AAV文库时,会出现交叉包装与产生嵌合包装的现象。

简化一点来说,当细胞中同时含有病毒A的基因组与病毒B的基因组时,有可能病毒A的基因组被包装到了病毒B的衣壳中,或者病毒B的基因组被包装到了病毒A的衣壳中,这种现象就叫做交叉包装;同时,来自病毒A的蛋白亚基VP1-A可能与来自病毒B的蛋白亚基VP2-B 和VP3-B组装,形成含有不同来源的病毒颗粒,这种现象则被称为嵌合包装。

211232365_AAV9衣壳蛋白VP的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

211232365_AAV9衣壳蛋白VP的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2023.04.028·论著/免疫学技术与方法·AAV9衣壳蛋白VP的原核表达、纯化及多克隆抗体制备①张浩李舒月张雄洲谈恒星杨建林曹春雨吕亚丰(三峡大学医学院,肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室,宜昌 443000)中图分类号R392-33 文献标志码 A 文章编号1000-484X(2023)04-0833-05[摘要]目的:表达腺相关病毒(AAV)9型衣壳蛋白VP,制备抗VP蛋白的多克隆抗体。

方法:使用PCR技术从AAV9病毒包装质粒中扩增AAV9衣壳蛋白VP,同源重组法构建衣壳蛋白表达质粒pET30a-AAV9-VP。

质粒转化表达菌E.coli BL21(DE3)后,IPTG诱导目的蛋白VP表达,亲和层析法纯化VP蛋白,将纯化后的蛋白免疫日本大耳白兔,3次免疫后获得针对VP蛋白的兔多克隆抗体。

以Western blot和细胞免疫荧光法检测抗体的应用,ELISA检测所得抗体的效价。

结果:成功构建pET30a-AAV9-VP表达质粒,在大肠杆菌BL21中,IPTG可诱导VP蛋白表达。

亲和层析法纯化获得高纯度的VP蛋白。

该蛋白在日本大耳兔体内能够诱导产生多克隆抗体,ELISA检测抗血清效价达到1∶512 000。

结论:成功原核表达和纯化AAV9衣壳蛋白VP并制备了兔多克隆抗体。

制备的抗AAV9 VP抗体能够特异性识别和结合AAV衣壳蛋白,并可有效用于Western blot和细胞免疫荧光分析,为后续深入研究AAV9在基因治疗中的作用及AAV9载体开发提供了研究基础。

[关键词]原核蛋白纯化;腺相关病毒9;多克隆抗体Prokaryotic expression,purification and polyclonal antibody preparation of AAV9 capsid protein VPZHANG Hao, LI Shuyue, ZHANG Xiongzhou, TAN Hengxing, YANG Jianlin, CAO Chunyu, LYU Yafeng. Three Gorges University Medical College, Hubei Key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotherapy, Yichang 443000, China[Abstract]Objective:To express the recombinant proteins of adeno-associated virus (AAV)9 capsid VP and prepare the polyclonal antibodies against VP. Methods:AAV9 capsid protein VP coding sequence was amplified from AAV9 plasmid by PCR,and capsid protein expression plasmid pET30a-AAV9-VP was constructed by homologous recombination. After transforming it into E.coli BL21 (DE3), IPTG was used to induce expression of VP, and the VP was purified by Ni-NTA resin affinity chromatography,the purified protein was used as antigen to immunize Japanese white rabbits to prepare polyclonal antibodies. The rabbit polyclonal antibody against VP protein was obtained after three times of immunization. Specificity of anti-sera was detected by Western blot and cell immunofluorescence, ELISA was used to detect titer of anti-VP antibody. Results:The pET30a-AAV9-VP expression plasmid was successfully constructed. IPTG can induce the expression of VP in E.coli BL21 bacteria. Ni-NTA resin affinity chromatography can effectively purify VP protein, and the VP can induce polyclones effectively in Japanese white rabbits, the antibody titer detected by ELISA was reaches 1∶512 000. Conclusion:Successful expression and purification of AAV9 capsid protein VP and preparation of rabbit polyclonal antibodies. The AAV9 VP antibody can specifically recognize and bind to the AAV capsid protein and can be effec‐tively used for Western blot and immunofluorescence analysis. It provides a research foundation for development of AAV9 vector and the in-depth study of the role of AAV9 in gene therapy.[Key words]Prokaryotic expression;Adeno-associated virus 9;Polyclonal antibody①本文为国家自然科学基金项目(81772833);肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室(三峡大学)基金项目(2021KZL01)。

腺相关病毒包装手册

腺相关病毒包装手册

腺相关病毒(AAV)构建及包装操作手册目录一、AAV安全注意事项二、AAV储存和稀释注意事项三、AAV介绍四、汉恒生物AAV产品服务及载体信息与现货列表五、AAV整体实验流程六、实验材料七、AAV载体构建八、AAV包装九、AAV收集和纯化十、AAV滴度测定十一、AAV感染细胞测试十二、AAV用于动物实验(重磅干货,五星推荐)十三、案例分享附件1附件2一、AAV安全使用注意事项(*非常重要!!!*)1)AAV相关实验请在生物安全柜(BL-2级别)内操作。

2)操作病毒时请穿实验服,佩戴口罩和手套,尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。

3)操作病毒时特别小心病毒溅出。

如果操作时超净工作台有病毒污染,请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。

接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请用84消毒液浸泡后统一处理。

4)如需要离心,应使用密封性好的离心管,如有必要请用封口膜封口后离心。

5)动物注射操作请在生物安全柜内(BL-2级别)完成。

6)病毒相关的废弃物需要特殊收集,统一经高温灭菌处理。

7)实验完毕用洗手液清洗双手。

二、AAV储存和稀释注意事项1.AAV的储存收到病毒液后若在短期内使用,可将病毒放置于4℃保存(一周内使用完最佳);如需长期保存请分装后放置于-80℃。

注:a.反复冻融会降低病毒滴度(每次冻融病毒滴度会降低10%-50%),因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融。

汉恒生物已对病毒进行了分装(200 l/tube),收到后请直接放置-80℃保存即可。

b.若病毒储存时间超过6个月,汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度。

2.AAV的稀释需要稀释病毒时,请将病毒取出冰浴融解,再使用无菌PBS或生理盐水混匀分装后置于4℃保存(一周内使用完最佳)。

三、AAV介绍腺相关病毒(AAV)属微小病毒科( parvovirus),为无包膜的单链线状DNA 病毒。

只有在腺病毒或者疱疹病毒等辅助病毒协助下,宿主才能产生具有感染性的AAV,所以AAV被称作腺相关病毒。

AAV-SaCas9操作手册

AAV-SaCas9操作手册

汉恒生物‐‐pHBAAV‐SaCas9‐gRNA汉恒生物—腺相关病毒pHBAAV-SaCas9-gRNA操作手册一、腺相关病毒(Adeno-Associated Viral Vector,AAV)简介腺相关病毒属微小病毒科(parvovirus),为无包膜的单链线状DNA病毒。

AA V 的基因组约4700bp,包括上下游两个开放读码框架(ORF),位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。

AAV基因组中有3个启动子(P5、P19和P40)和2个开放阅读读框(ORF),rep和cap,如图1所示,它们在AA V病毒整合、复制和装配中其重要作用。

图1.AA V基因组结构二、腺相关病毒的优点1.安全性高:迄今从未发现野生型AA V对人体致病,重组AA V基因组序列上去除了大部分的野生型AA V基因组元件,进一步保证了安全性;2.免疫原性低:AA V2的基因组仅4681个核苷酸,便于用常规的重组DNA技术进行操作,而且进行动物实验时造成的免疫反应小;3.宿主范围广:能感染分裂细胞和非分裂细胞;4.表达稳定:能介导基因的长期稳定表达;5.物理性质稳定:在60℃不能被灭活,能抗氯仿;三、CRISPR/Cas9基因敲除原理CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。

II型CRISPR/Cas系统在发挥功能时仅需要一种蛋白即Cas9核酸酶参与。

Cas9核酸酶复合体由Cas9蛋白和两个非1编码的RNA-crRNA前体pre-crRNA和tracrRNA组成。

在酿脓链球菌(Streptococcus pyoge nes)中,pre-crRNA和tracrRNA均由CRISPR位点上转录而来,然后pre-crRNA通过其含有的重复序列和tracrRNA形成RNA异二聚体,并结合到Cas9蛋白上,Cas9蛋白再对pre-crRNA进行剪切以获得成熟的crRNA,成熟的crRNA上长度为20个碱基的向导序列通过与目的DNA的序列互补来引导整个Cas9复合体去切割目的DNA。

腺相关病毒(AAV)包装技巧

腺相关病毒(AAV)包装技巧

腺相关病毒(AAV)包装技巧上文已经介绍了腺相关病毒的基础知识,具有如此多优点、功能如此强大的腺相关病毒是如何生产的?本文将为大家揭开腺相关病毒生产的神秘面纱。

腺相关病毒生产流程大致可分为基因克隆、细胞转染、收毒、病毒纯化、滴度检测等步骤,具体步骤我们下文分解?怎么可能,下面就是腺相关病毒生产流程。

1)根据订单不同选择不同的载体,在此以人源基因克隆为例。

2)Vigenebio 公司的 AAV 载体与我们的人源 ORF (注:维真生物拥有18000人源cDNA ORF克隆,可以最快的时间克隆到载体)库中的穿梭质粒的多克隆位点相兼容,通过酶切,连接,转化的方式将基因亚克隆进入 pAV-FH AAV 载体,得到阳性克隆之后进行酶切跑胶验证及测序以确认插曲片段的正确性。

细胞冻存流程1) 按照培养细胞流程,将细胞吹下来加入 50ml 离心管中, 800g 离心5min。

2) 配制冻存液,90% 血清,10% DMSO,混匀。

3) 离心后去上清,将配制的冻存液加入,将细胞吹匀4) 取上述溶液 1ml 分至 1.5ml 细胞冻存管中,做好标记和日期。

5) 放入装有异丙醇的冻存盒中,放入-80度冰箱过夜。

(冻存盒要提前一天从冰箱中拿至室温,使异丙醇的温度达到室温,每次冻存前确保异丙醇的加入量在刻度线上)。

6) 第二天将冻存盒放入液氮或-150℃冰箱中。

1) 10cm 培养盘中加 10cm 新鲜 DMEM 培养基,放培养箱预热至 37℃。

2) 从液氮中取出冷冻管,迅速投入37 ℃~38℃水浴中,使其融化(1-2 分钟左右)。

3) 待细胞冻存管中溶液尚未完全融化时加入预热的培养盘中。

4) 摇晃均匀,放培养箱培养。

5) 4h后待细胞完全贴壁后更换新鲜培养基(除去冻存液中DMSO 对细胞的毒害作用。

也可在第 3步中 800g 离心 5min,除去培养基后再悬浮细胞添加至新鲜预热的 DMEM 细胞培养皿中)。

1) 生物安全柜紫外灭菌半小时。

pDG系列AAV包装

pDG系列AAV包装

pDG系列AAV包装AAV construction and preparation. AAV was prepared by methodsdescribed earlier.42 Briefly, AAV vectors expressing the EGFP under thecontrol of the cytomegalovirus enhancer/chicken beta actin promoter, awoodchuck hepatitis virus post-transcriptional-regulatory element, andthe bovine growth hormone polyA(pAAV-EGFP) were generated byPolyethylenimine (PEI, Polysciences, Warrington, PA) transfection intoHEK293T cell line. Cells were co-transfected with the AAV helper plasmidspDP1rs, pDP5rs, pDP8.ape, and pDG9. Helper Plasmid 1, 5, & 8 wereobtained from Plasmid Factory, Germany. AAV9 (pDG9) was constructed by isolating the backbone from the AAV helper plasmid pDG and theAAV9 capsid gene from pAAV 9 (S. Zolotukhin UF, Gainesville, FL). At 72hours after transfection, cells were harvested and lysed in the presence of0.5% Sodium Deoxycholate and 50 U/ml Benzonase (Sigma) by repeatedrounds of freeze/thaws at ?80 °C and 50 °C. The virus was isolated usinga discontinuous Iodixanol gradient. Samples were buffer exchanged toPBS using an Amicon Ultra filter100,000 MWCO Centrifugation device(EMD Millipore, Billerica, MA). The genomic titer of each virus was determinedby quantitative PCR (Bio-Rad CFX384). The viral DNA sampleswere prepared by treating the virus with DNaseI (Life Technologies, GrandIsland, NY), heat inactivating the enzyme, digesting the protein coat withProteinase K (Life Technologies), and concluding with a second heat-inactivation.Samples were compared against a standard curve of supercoiledplasmid diluted to 1e3 to 1e7 copies per ml. Freshly prepared AAVs werealiquoted and stored at ?80 °C. When needed, viruses were diluted in sterile1X DPBS, pH7.2 and used immediately.。

维真生物AAV病毒产品说明书

维真生物AAV病毒产品说明书

病毒产品说明书项目信息基因名称基因序列号滴度体积小鼠RNF20基因AAV8NM_0011632637.94×1013vg/ml100μl AAV8-TBG无 1.09×1013vg/ml100μl产品使用说明根据不同细胞的MOI(MOI是multiplicity of infection的缩写,中文译为感染复数,实际的含义即为每个细胞被多少个有活力病毒所感染)和需要感染的细胞量以及病毒滴度,计算所需要的病毒量,然后将所需的病毒加入事先准备好的细胞培养体系中,培养12小时左右即可换成完全培养基正常培养。

一般培养至第24-48小时,可在荧光显微镜下观察病毒感染细胞情况。

我们强烈建议您在使用我们的产品前进行预实验摸索最适MOI值或查阅相关文献后再进行实验。

注:由于AAV的组织特异性,体外感染细胞的效率比较低,所以我们强烈推荐您购买AAV用于动物实验。

运输&保存条件全程干冰运输。

收到产品后,请于-80℃保存,避免反复冻融,使用前于4℃融化。

我们强烈建议在收到病毒后按照每次用量进行分装,避免反复冻融。

订购须知ViGene Biosciences的产品仅限用于研究,不可用于包括人类体外诊断和治疗在内的其他用途。

ViGene Biosciences的产品,不得修改和转售给任何第三方,未经ViGene Biosciences的书面批准,不得将产品用于向其他第三方提供服务或用于制造商品化产品。

ViGene Biosciences的全长cDNA克隆来自人类cDNA。

我们70%的克隆与RefSeq 和GenBank数据库中序列完全一致,部分cDNA克隆序列中含有SNPs,可能与RefSeq数据库的序列存在一个或多个核苷酸的差异。

建议购买者在购买前仔细核对克隆序列。

根据GenBank2013数据库的序列信息,产品中每个克隆包含一个完整的开放阅读框(ORF),随着RefSeq序列的不断变化,GenBank的数据也在不断更新。

sunbio AAV产品手册 最终版

sunbio AAV产品手册 最终版

上海生博AAV产品手册(2017版)一、AAV背景知识1.1AAV概况腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV),是一类无包膜的细小病毒,属于微小病毒科(Parvoviridae)的依赖病毒属(Dependoparvovirus),透射电镜(transmission electron microscope,TEM)下,AAV病毒本身呈二十面体结构。

AAV 基因组为约4.7kb的线性单链DNA(single strand DNA,ssDNA),只含两个基因,Rep(Replication)基因和Cap(Capsid)基因。

AAV为目前发现的基因组最简单的复制缺陷型病毒,也因此,AAV被作为病毒载体广泛应用。

FIG1 AAV的3D构象图FIG2 AAV病毒颗粒的组分构成FIG1和FIG2文献出处:Mingozzi, F. and K.A. High.Blood, 2013. 122(1): p. 23-36.FIG3 AAV TEM图Zinn, E., et al.. Cell Rep, 2015. 12(6): p. 1056-68.1.2AAV的ITR区AAV基因组的5’和3 ’端各有一个长度为145bp的倒转重复序列(inverted terminal repeat,ITR),是AAV复制和包装所必需的最少的自身序列。

ITR区富含GC(>80%),可折叠为一个自我互补的T型发卡结构,其中的Rep蛋白结合位点(Rep binding elements,RBE)、RBE’和末端解链位点(terminal resolution site,TRS)是AAV 基因组的复制起始的关键。

另外ITR区还含有包装信号,是AAV整合、复制和包装所必须的顺式作用元件,并具有转录启动子活性。

FIG4 AAV基因组结构图Nance, M.E. and D. Duan. Hum Gene Ther, 2015. 26(12): p. 786-800.FIG5 AAV ITR区的二级结构图(以AAV2序列为例)Daya, S. and K.I. Berns. Clin Microbiol Rev, 2008. 21(4): p. 583-93.1.3AAV的ORFAAV含有两个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),Rep基因和Cap基因。

重组腺相关病毒(AAV)载体构建技术原理

重组腺相关病毒(AAV)载体构建技术原理

重组腺相关病毒(AAV)载体构建技术原理腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)是微⼩病毒科(parvoviridae)家族的成员之⼀,是⼀类⽆法⾃主复制、⽆被膜的⼆⼗⾯体微⼩病毒,其直径约20-26nm,含有4.7kb左右的线状单链DNA作为基因组。

研究中采⽤的重组腺相关病毒载体(recombination adeno-associated virus, rAAV)是在⾮致病的野⽣型AAV基础上改造⽽成的基因载体,由于其种类多样、免疫原性极低、安全性⾼、宿主细胞范围⼴(对分裂细胞和⾮分裂细胞均具有感染能⼒)、扩散能⼒强、体内表达基因时间长等,rAAV被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之⼀。

AAV基因组结构悬浮框:包装纯化及滴度检测--侵染细胞过程-- rAAV载体优势—rAAV⾎清型选择—应⽤案例rAAV包装纯化及滴度检测AAV包装过程中,包装质粒负责编码⽬的基因以及两个末端反向重复序列(ITR,对于病毒的复制和包装具有决定性作⽤),辅助质粒包含AAV包装所需的cap(编码病毒⾐壳蛋⽩)和rep(参与病毒的复制)基因,以及腺病毒Helper质粒。

三种质粒共同转染293T细胞后,AAV病毒开始复制和包装。

和元⽣物腺相关病毒的⽣产和质控采取了国际学术界公认的标准流程,采⽤三质粒系统在293T细胞中进⾏包装。

所获得的病毒颗粒经过超速离⼼纯化,并通过qPCR对病毒基因拷贝进⾏滴定。

另外,我们也可以根据使⽤者要求,提供蛋⽩染⾊检测⾐壳蛋⽩的完整性以及内毒素含量等。

⼀般情况下rAAV的滴度在1012~1013VG/ml,完全可以满⾜各类整体实验的使⽤要求。

AAV包装流程图滴度检测⽅法:定量PCR检测病毒基因组中外源DNA拷贝数。

滴度检测原理:腺相关病毒的基因组为单链DNA,外源DNA拷贝数代表病毒基因组拷贝数。

高效包装腺相关病毒的原理及流程

高效包装腺相关病毒的原理及流程

高效转染病毒
源井生物可以提供不同质量标准的慢病毒,腺病毒,腺相关病毒。

在基因编辑方面,源井生物可以提供体外细胞感染用的浓缩病毒,也可以提供动物体内使用的超纯化病毒,满足客户的不同科研需求。

三种病毒的比对:
腺相关病毒包装原理
腺相关病毒( adeno-associated virus,AAV) 是一类细小病毒,基因组为单链DNA,对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

通常需要腺病毒或疱疹病毒帮助其在体内复制扩增。

重组腺相关病毒(recombinant AAV, rAAV)是利用
AAV2 型基因组与不同血清型的衣壳蛋白基因组结合产生的混合体病毒载体,可将目的基因的CDS 区序列或者RNAi 干扰序列插入rAAV 表达质粒中,包装病毒后感染细胞完成对目的基因的操作。

腺相关病毒具有感染温和,免疫原性小,长效稳定表达的特点,主要应用于动物体内注射。

源井生物提供的腺相关病毒颗粒经过超速离心纯化,并通过qPCR对病毒基因拷贝进行滴定。

腺相关病毒的滴度在10^12~10^13GC/ml,可以满足各类整体实验的使用要求。

不同血清型的AAV组织感染嗜亲性各不相同,表现出一定的器官靶向特异性。

下表列举了不同的AAV血清型及对应的组织亲和性:
产品规格:
服务流程及质量控制:
基因敲除腺相关病毒
源井生物构建基因敲除腺相关病毒载体并包装为腺相关病毒,经过超速离心纯化后,可用于动物定位注射和整体注射实验。

细胞感染腺相关病毒后,可稳定表达gRNA和Cas9蛋白,达到敲除靶基因的目的。

基因敲除腺相关病毒载体选择:
注明| 文章是源井生物原创,转载请注明。

AAV病毒包装实验常见问题的解答

AAV病毒包装实验常见问题的解答

AAV病毒包装实验常见问题的解答腺相关病毒载体介导的感染效率⽐真核表达质粒的要⾼,且⽬的基因表达稳定,⽬前已经被⼴泛应⽤于体外细胞和体内动物实验中⽬的基因的功能研究、模型建⽴和临床试验等。

越来越多实验室的课题都要⽤到AAV病毒包装,不过在实验的过程中会出现很多问题,⽐如载体构建、质粒抽提纯化异常、病毒滴度过低甚⾄出不了毒等等情况。

今天来聊聊这⽅⾯的问题,看看病毒包装⾼质量的交付受到哪些因素影响,怎样能做得更好。

Q1:腺相关病毒是什么?和实验室⽤的A A V载体的区别在哪⾥?答:腺相关病毒,即Adeno-Associated Virus (AAV), 是⾃然界中存在的天然病毒,基因组上有rep基因和cap基因,因此也叫野⽣型腺相关病毒(图⼀),即wide type AAV(wtAAV);实验室⽤的AAV载体,是在腺相关病毒的基础上经过⼈⼯改造的质粒,基因组上没有rep基因,因此也叫重组腺相关病毒,即recombinant AAV(rAAV)。

没有特别指出的时基因,和cap基因候,简称AAV⼀般是指已经改造过的AAV载体。

图⼀(来源:参考⽂献1)Q2:腺相关病毒有哪些特点,A A V适合做哪些下游实验?答:腺相关病毒是⼀种⼩型⽆包膜病毒,属于细⼩病毒科,包含⼀个单链线性DNA基因组,长度约为4.7kb,其⾐壳蛋⽩由VP1、VP2和VP3三种蛋⽩构成,在1965年从腺病毒分离株的污染物中⾸次被发现。

Q3.腺相关病毒进⼊宿主细胞之后,其基因组会整合到宿主细胞基因组中吗?答:野⽣型腺相关病毒wtAAV感染⼈体细胞后,由于其rep基因、ITR序列结构和宿主基因组的相互作⽤,可能倾向整合到19号染⾊体短臂上的AAVS1位点,在⼩⿏中是倾向整合到ROSA26基因位点;⽽改造过的重组型腺相关病毒rAAV,由于基因组上已经去除了rep和cap基因,因此失去了整合到宿主基因组的特性。

rAAV在体内组织,特别是在肌⾁组织中,在宿主基因组染⾊体以外以附加⼦(episome)的双链DNA形式存在,持续稳定表达⽬的基因。

慢病毒包装原理-介绍PDF.pdf

慢病毒包装原理-介绍PDF.pdf

慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒( Lentivirus )载体是以 HIV-1 (人类免疫缺陷 I 型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。

区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入。

该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达。

在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的的基因治疗效果,在美国已经开展了临床研究,效果非常理想,因此具有广阔的应用前景。

目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。

由于有些类型细胞脂质体转染效果差,转移到细胞内的 siRNA 半衰期短,体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的,因而使其应用受到较大的限制。

采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体,然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略,不但使脂质体有效转染的细胞种类增加,而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ,在长期稳定表达载体的细胞中,甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。

在所构建的 siRNA 表达载体中,是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的,这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列,而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。

当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时,它指导的转录就会停止,在转录产物 3' 端形成 1~4 个U 。

U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子,其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游,适合于表达~ 21ntRNA 和~ 50ntRNA 茎环结构( stem loop )。

在 siRNA 表达载体中,构成 siRNA 的正义与反义链,可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成 siRNA ;也可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA),载体包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4 ~ 5 T转录终止位点之间的茎环结构序列,转录后即可折叠成具有 1~4 个 U 3 ' 突出端的茎环结构,在细胞内进一步加工成 siRNA 。

人腺相关病毒(AAV)elisa试剂盒使用说明书

人腺相关病毒(AAV)elisa试剂盒使用说明书

人腺相关病毒(AAV)elisa试剂盒使用说明书Elisa kit规格:48孔配置/96孔配置标准品稀释液:1.5ml×1瓶酶标试剂:3 ml×1瓶(48)/6 ml×1瓶(96)【人腺相关病毒(AAV) elisa试剂盒】本试剂仅供研究使用计算:以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

试剂盒组成:封板膜:2片(48)/2片(96)说明书:1份密封袋:1个标准品:2700ng/L 0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存酶标包被板: 1×48 1×96 2-8℃保存样品稀释液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液: 3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液:(20ml×20倍)×1瓶(20ml×30倍)×1瓶2-8℃保存实验原理:本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人腺相关病毒(AA V) 水平。

用纯化的人腺相关病毒(AA V) 抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入腺相关病毒(AA V) ,再与HRP标记的腺相关病毒(AA V) 抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的腺相关病毒(AA V) 呈正相关。

用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人腺相关病毒(AA V) 浓度。

aav三质粒包装系统原理

aav三质粒包装系统原理

aav三质粒包装系统原理AAV三质粒包装系统原理引言:AAV(Adeno-Associated Virus,腺相关病毒)是一类非致病性的单链DNA病毒,被广泛应用于基因治疗和基因传递等领域。

AAV 三质粒包装系统是一种常用的AAV病毒包装方法,它利用细胞内的三种帮助病毒复制的基因产品,实现AAV病毒颗粒的产生。

本文将详细介绍AAV三质粒包装系统的原理。

一、AAV病毒的基本结构和生命周期AAV病毒是一种非致病性的病毒,其基本结构包括外壳蛋白、基因组DNA和内核蛋白。

AAV病毒的生命周期分为两个阶段:感染和复制。

感染阶段中,AAV病毒依靠宿主细胞表面的受体进入细胞内,并被转运到细胞核。

复制阶段中,AAV病毒的基因组DNA被转录成mRNA,然后mRNA被翻译成蛋白质,最终形成新的AAV病毒颗粒。

二、AAV三质粒包装系统的构建AAV三质粒包装系统是一种利用细胞内三种基因产品协同作用的方法,将目标基因包装入AAV病毒颗粒中。

三种基因产品分别是AAV复制相关基因(Rep)、AAV帮助基因(Cap)和目标基因(Gene of interest)。

其中,Rep基因编码的蛋白质具有基因复制和转录调控的功能;Cap基因编码的蛋白质则构成AAV病毒的外壳;目标基因是研究者想要传递到目标细胞内的基因。

三、AAV三质粒包装系统的工作原理1. 构建AAV三质粒:首先,将Rep、Cap和目标基因的DNA序列分别插入到合适的载体中。

然后,将这三个载体转染到细胞中,使其在细胞内产生相应的基因产品。

2. 基因复制和转录调控:Rep基因编码的蛋白质与AAV病毒的基因组DNA结合,形成复合物。

这个复合物能够复制和调控AAV病毒的基因组DNA,使其能够被转录成mRNA。

3. 病毒外壳的组装:Cap基因编码的蛋白质被翻译出来后,与AAV 病毒的基因组DNA和Rep蛋白质相互作用,形成病毒外壳的主要组成部分。

这个过程需要外源性帮助病毒(如辅助腺病毒)的参与。

腺相关病毒包装(AAV)介绍

腺相关病毒包装(AAV)介绍

腺相关病毒包装(AAV)介绍
腺相关病毒(AAV)是最初发现的作为腺病毒载体污染物的小型病毒。

利用AAV进行研究的一个主要优势是它的复制能力有限,并且通常不会导致人类疾病。

由于这些原因,AAV通常被包含在较低的生物安全水平,并引发相对较低的免疫效应在活生物体内。

虽然AAV可以在BSL-1处理,但表达癌基因或毒素的AAV应该在BSL-2处理。

AAV能够以低免疫应答和低毒性转导分裂和非分裂细胞。

尽管重组AAV不能整合到宿主基因组中,转基因的表达可以是长期的。

AAV 的效用目前受到其小包装容量的限制(包括ITRs在内为4.5 kb),尽管人们对扩大这一容量有很大的兴趣和努力。

传统上,AAV要求存在另一种“辅助”病毒,如腺病毒或疱疹病毒,以便繁殖。

这是由于AAV依赖于某些介导AAV复制的外源基因产物。

这一要求已经被“无辅助病毒系统”所回避,该系统能够在不使用辅助病毒的情况下产生传染性AAV粒子。

相反,在AAV生产期间,特定的基因产物可以由辅助质粒(例如,pHelper)和特定的包装细胞系(例如,HEK293细胞)提供。

AAV质粒系统概述。

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AAV病毒包装
摘要: (一) AAV-293细胞的冻存(二)AAV-293 细胞的传代(三)AAV-293 细胞的复苏(四)AAV 包装和浓缩
(一) AAV-293细胞的冻存
随着传代的次数增加,AAV-293细胞会出现生长状态下降、突变等。

为了防止此类现象的出现,我们需要在开始就对细胞进行大量冻存,以保证实验的稳定性和持续性。

在细胞对数生长期进行冻存,增加细胞复苏成活率。

1、去掉
细胞培养上清液,加入PBS 洗去残留的培养基;
2、加入0.25%的胰酶,消化1~2min 后,镜下观察细胞变圆,细胞间间隙加大时,去除胰酶,加入新鲜培养基吹打混匀,移入离心管中。

3、细胞计数,将细胞全部晃下,加入3mL 37 ℃预热的10% DMEM,用10mL 移液管进行吹打,较大力吹打6-8 次即可,不留死角,之后,将所有细胞吸出,置于15mL 离心管中,取50ul 混匀后的细胞于1.5mLeppendorf管中,加入450ul 10% DMEM,即为10 倍稀释,混匀,取10ul 细胞于计数板中计数。

计数板上共 4 大格,每大格16 小格。

计数时,4 大格均计数,总数除以4(得每大格细胞数),再乘以10(10 倍稀释),即为实际n 万/mL 细胞浓度。

4、细胞离心,1000 rpm/min,5min。

去掉上清。

5、根据细胞计数,结果加入细胞冻存液(70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO)重悬细胞,密度为3 x 106 个/ml。

6、分装进细胞冻存管,放入冻存盒中,放入-80℃超低温冰箱。

7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存,并作记录。

保存过程中,要不时复苏细胞检测细胞存活率,观察细胞状态等。

(二)AAV-293 细胞的传代
当细胞生长到汇合率达到80%~90%时需要对细胞进行传代操作,以扩大细胞数量,维持细胞良好的生长状态。

1、消化细胞,方法同细胞冻存。

2、细胞离心结束后,加入完全培养基重悬。

3、根据具体情况,将细胞分到10cm 培养皿中,每个培养皿补足到10ml 培养基。

(三)AAV-293 细胞的复苏
当细胞传代次数过多,细胞状态变差时,或者细胞出现污染事故时,需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复苏。

1、设置温度为37~42℃的水浴。

2、查看细胞库记录,根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞(需戴上棉手套,防止被冻伤),迅速丢入水浴锅中并快速晃动,尽量在1~2min 内使细胞溶液完全
溶解。

3、将细胞溶液转移到15ml 离心管中,并在其中加上1ml 新鲜的完全培养基,混匀后离心,1000 rpm/min,5min。

4、去掉上清,加入5ml 新鲜的完全培养基,混匀沉淀后,转入6 cm 培养皿。

5、将培养皿平稳放入37℃、5% CO2 和95%相对湿度的培养箱中培养。

6、第二天观察细胞存活率。

给细胞换一下培养基。

以后每天观察细胞生长情况。

(四)AAV包装和浓缩
1. 质粒扩增
构建好的AAV载体、包装质粒和辅助质粒需经过大量抽提,浓度大于1ug/ul,A260/280 在
1.7-1.8 间方可用以包毒。

推荐使用Qiagen 大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提。

2. 传AAV-293细胞
将培养AAV-293 细胞T75 瓶中的培养基吸净,加入2mL 4 度冰箱取出的0.25%胰酶,使其均匀覆盖瓶底,置于37 度培养箱中3-5min,取出,摇晃可发现细胞于底部脱离,将其全部晃下,加入3mL 37 度水浴中预热的10% DMEM,移液枪用10mL 移液管进行吹打,较大力吹打6-8 次即可,不留死角,瓶口处较难吹打可将移液管对准培口,小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。

之后,将所有细胞吸出,置于15mL 离心管中,取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中,加入450ul 10% DMEM,即为10 倍稀释,混匀,取10ul 细胞于计数板中计数。

计数板上共4 大格,每大格16 小格。

计数时,4 大格均计数,总数除以4(得每大格细胞数),再乘以10(10 倍稀释),即为实际n 万/mL 细胞浓度。

传代当天记为第一天,若第二天进行转染,铺900-1000 万/T75;若第三天转染,铺350-400 万/T75。

每瓶T75 加10mL 10%DMEM 培养基。

转染当天观察细胞密度,80-90%满即可进行转染。

转染前无需换培养基。

3. 做脂转complex
试剂名称试剂数量
载体质粒5ul(1.0ug/ul)
包装质粒5ul(1.0ug/ul)
辅助质粒5ul(1.0ug/ul)
注:LipofiterTM转染试剂为汉恒生物产品,使用说明参考LipofiterTM说明书。

4. AAV 病毒收毒:
病毒颗粒同时存在于包装细胞和培养上清中。

可以将细胞和培养上清都收集下来以获得最好的收率。

1) 准备一个干冰乙醇浴(将乙醇倾入装有干冰的泡沫盒即可,也可用液氮替代干冰乙醇浴)和37°C 水浴;
2) 将产毒的细胞连同培养基一同收集到一个15ml 的离心管中。

收集细胞时,将培养盘倾斜一定角度将细胞刮到培养基中;
3) 1000 rpm/min,离心3 分钟,分离细胞和上清,将上清另外存放,细胞用1ml PBS 重悬;
4) 将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37°C 水浴中反复转移,冻融四次。

每次融解后稍加震荡。

注意:每次凝固和解冻大概需要十分钟的时间。

5. AAV 病毒浓缩:
1) 10,000 g 离心去除细胞碎片,将离心上清转移到一个新离心管中。

2) 将两次收集的上清混合在一起,用0.45um 滤器过滤除杂质
3) 加入1/2 体积的1M NaCl,10% PEG8000 溶液,混合均匀,4度过夜
4) 12,000 rpm 离心2h,弃上清,病毒沉淀用适量的PBS 溶液溶解,待完全溶解后用0.22um 滤器过滤除菌。

5) 加入Benzonase 核酸酶消化去除残留的质粒DNA(终浓度为50 U/ml)。

合上管盖,颠倒几次以充分混合。

在37 °C 孵育30 分钟;
6) 用0.45 μm 过滤头过滤,取滤出液,即为浓缩的AAV病毒。

6. AAV的纯化
1) 向病毒浓缩液中添加固体CsCl 直到密度为1.41 g/ml(折射率为1.372);
2) 将样品加入到超速离心管中,用预先配好的1.41 g/ml CsCl 溶液将离心管剩余空间填满;
3) 在175,000 g 下离心24 小时,以形成密度梯度。

按顺序分步收集不同密度的样品,取样进行滴度测定。

收集富集有AAV 颗粒的组分;
4) 重复上述过程一次。

5)将病毒装入100 kDa的透析袋,4度透析脱盐过夜。

此即为纯化的AAV病毒
AAV病毒包装滴度测定(采用Q-PCR 法)
1)取20ul 浓缩病毒液,加入1ul RNAse-free DNAse,混匀,37℃水浴反应30min。

2)4℃,12 000 rpm/min,离心10 min,取10ul 上清到另一个无菌的1.5ml EP 管中。

3)加入90ul Dilution Buffer(1 mM Tris-HCl, pH 8.0,0.1 mM EDTA,150 mM NaCl),混匀,37℃金属浴反应30min。

4)自然冷却至室温,加入1ul 蛋白酶K,65℃水浴反应1h。

5)100℃金属浴反应10min,自然冷却至室温。

6)进行Q-PCR 检测滴度。

AAV病毒的储存、稀释
1. 病毒的储存:
收到病毒液后在很短时间内即使用腺相关病毒进行实验,可以将病毒暂时放置于4℃保存;如需长期保存请放置于-80℃(病毒置于冻存管,并使用封口膜封口)。

1)病毒可以存放于-80℃6 个月以上;但如果病毒储存时间超过6个月,建议在使用前需要重新测定病毒滴度。

2)反复冻融会降低病毒滴度:每次冻融会降低病毒滴度10%;因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融,为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。

2. 病毒的稀释:
如果需要稀释病毒,请将病毒取出置于冰浴融解后,使用PBS 缓冲液或培养目的细胞无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。

混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。

AAV使用安全注意事项
1.病毒操作时最好使用生物安全柜。

如果使用普通超净工作台操作病毒,请不要打开排风机。

2.病毒操作时请穿实验服,带口罩和手套。

3.操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。

如果操作时超净工作台有病毒污染,请立即用70%乙醇加1% SDS 溶液擦拭干净。

接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液等请用84 消毒液或1% SDS 中浸泡过夜后弃去。

4.用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤:拧紧培养瓶或盖紧培养板。

用70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。

离开显微镜实验台之前,用70%乙醇清理显微镜实验台。

5.如需要离心,应使用密封性好的离心管,或者用封口膜封口后离心,而且尽量使用组织培养室内的离心机。

6.脱掉手套后,用肥皂和水清洗双手。

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