双缩脲法测定蛋白质的浓度
双缩脲法测蛋白质浓度
一、目的：1.了解双缩脲法测定蛋白质浓度的基本原理。
2.熟悉双缩脲法测蛋白质浓度的实验操作方法。
二、原理：双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出1个分子氨后得到的产物在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过1个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1~10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
三、实验试剂和仪器1.硫酸铜、酒石酸钾钠、NaOH、KI、酪蛋白2.双缩脲试剂：取0.75g硫酸铜和3.0g酒石酸钾钠溶于250ml蒸馏水，加入150ml 10%NaOH溶液（可另加0.5gKI以防止Cu2+自动还原成一价氧化亚铜沉淀），用水稀释至500ml。
此试剂可以长期保存。
3.10mg/ml标准蛋白溶液：取1.0gNaOH加入500ml蒸馏水中，配成0.05mol/lNaOH溶液。
用0.05mol/lNaOH溶液溶解0.25g酪蛋白，定容至25ml。
4.待测样品液：可以用酪蛋白配制，也可用蛋清，牛血清蛋白。
5.仪器：容量瓶，试管，移液管，量筒，烧杯，胶头滴管，吸耳球，洗瓶，分光光度计四、步骤标准曲线的绘制（表1）。
表1加入物加入量（ml）0 1 2 3 4 5标准液0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.05mol/lNaOH1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0双缩脲试剂4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0室温下振荡均匀，显色30min后，用分光光度计于540nm测定各管吸光度。
实验六双缩脲法测定蛋白质含量
三、操作
1、稀释血清的制备 准确吸取血清0.5mL，置于试管中，加入 0.9% NaCl（即生理盐水）4.5mL,混匀备用。 （血清稀释倍数是多少？5/0.5=10）
2.取三支试管按下表操作
试剂（mL） 蒸馏水
5mg/mL标准蛋白质溶液
空白管 标准 4.0 — — 1.0 4.0
稀释血清 双缩脲试剂 A540
混匀，放置30min后，用分光光度计在 540nm波长处比色，以空白管调零点，测定各 管吸光度。
四、计算
A测定 100 C标准 稀释倍数 血清蛋白质含量（g / 100 mL） A标准 1000
C标准 ：标准蛋白质溶液浓度，为5mg/mL
血清稀释倍数为10 （人的正常值：6～8g/100mL）
2.器材：
(1)试管及试管架； (2) 吸管； (3) 分光光度计。
试剂和器材 1.试剂
(1) 0.9％NaCl溶液即生理盐水； (2) 双缩脲试剂：称取1.5g 硫酸铜(CuSO4•5H2O) 和 6.0g酒石酸钾钠(NaKC4H4O6•4H2O) 溶于500mL蒸馏水 中，在搅拌下加入300 mL 10%NaOH溶液和1.0g KI， 最后用蒸馏水定容至1000mL。 (3) 标准蛋白质溶液(5mg/mL)：牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/LNaOH配制。 (4) 待测蛋白质溶液：血清样本；
实验四 双缩脲法测定蛋白质含量
一、目的
掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法
二、原理
双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物， 在碱性溶液中双缩脲与硫酸铜反应生成紫红色 络合物，称为双缩脲反应。具有两个或两个以 上肽键的化合物都有双缩脲反应，因此蛋白质
双缩脲法测定蛋白质浓度标准曲线的绘制
充分混匀，在540nm比色
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度——标准曲线的绘制 管号 试剂 标准蛋白液/ml 0.9% Nacl/ml 考马斯亮蓝染液/ml 蛋白质浓度/(微克/ml) A 0 0.0 1.0 4.0 0 0.000 1 0.1 0.9 4.0 10 0.009 2 0.2 0.8 4.0 20 0.041 3 0.3 0.7 4.0 30 0.077 4 0.4 0.6 4.0 40 0.083 5 0.6 0.4 4.0 50 0.123
0.000 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
蛋白质浓度/（微克）
的绘制 样液1
样液1加1ml
卵清蛋白
卵清蛋白加1ml
(A595nm)
0.140
考马斯亮蓝法测定--蛋白质浓度
4.0 ？ 0.180
4.0 ？ 0.369
0.120 0.100 0.080 0.060
0.040
y = 0.002x - 0.006 R² = 0.969
双缩脲法测定蛋白质浓度——标准曲线的绘制 管号 试剂 2mg/ml卵清蛋白液/ml 蒸馏水/ml 双缩脲试剂/ml 蛋白质浓度/(mg/ml) A 0 0.0 3.0 2.0 0.0 0.000 1 0.3 2.7 2.0 0.2 0.245 2 0.6 2.4 2.0 0.4 0.345 3 0.9 2.1 2.0 0.6 0.398 4 1.2 1.8 2.0 0.8 0.488 5 1.5 1.5 2.0 1.0 0.574
A 线性
线性
0.020 0.000 (0.020) 0
10 20 30 40 50 60
蛋白质浓度/(微克/ml)
A 线性 (A)
1.2
双缩脲法测定实验报告
一、实验目的1. 学习双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。
2. 掌握双缩脲试剂的配制和使用。
3. 了解实验过程中可能出现的误差及解决办法。
二、实验原理双缩脲法是一种经典的蛋白质定量方法，其原理基于蛋白质分子中的肽键与铜离子（Cu2+）在碱性条件下发生反应，生成紫红色络合物。
该络合物在特定波长（如540nm）处的吸光度与蛋白质含量呈正比关系。
通过测量吸光度，可以计算出蛋白质的浓度。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质标准液（已知浓度）- 待测样品（含有未知蛋白质）- 双缩脲试剂A（含CuSO4）- 双缩脲试剂B（含NaOH）- 6mol/L NaOH溶液- 0.1mol/L HCl溶液- 10g/L NaCl溶液- 移液器- 容量瓶- 烧杯- 比色皿- 分光光度计2. 实验仪器：- 移液器- 容量瓶- 烧杯- 比色皿- 分光光度计四、实验步骤1. 配制双缩脲试剂：- 称取0.1g硫酸酮（CuSO4）溶于50mL去离子水中。
- 称取1.5g酒石酸钾钠溶于50mL去离子水中。
- 称取0.05g碘化钾溶于50mL去离子水中。
- 将三种溶液混合，搅拌均匀，备用。
2. 准备蛋白质标准液：- 将蛋白质标准液用去离子水稀释至一定浓度，备用。
3. 准备待测样品：- 称取一定量的待测样品，用去离子水稀释至一定浓度，备用。
4. 标准曲线的制作：- 取7支试管，分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL蛋白质标准液，然后依次加入1.5mL双缩脲试剂A和1.5mL双缩脲试剂B。
- 将试管放入水浴中加热10分钟，取出冷却至室温。
- 用移液器取0.5mL溶液于比色皿中，以空白试剂为参比，在540nm波长处测定吸光度。
- 以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
5. 待测样品的测定：- 按照标准曲线的制作步骤，对待测样品进行测定。
- 根据标准曲线，计算出待测样品中蛋白质的含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线的制作：- 在540nm波长处，蛋白质含量与吸光度呈良好的线性关系，相关系数R²=0.998。
蛋白质测定方法之双缩脲法(BIURET法)
一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1~10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材1.试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。
如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。
牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。
（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。
此试剂可长期保存。
若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2.器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
（三）操作方法1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。
充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。
用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。
双缩脲法测定蛋白质浓度
×
吸 光 度
× × ×
×
蛋白质浓度（mg/mL）
牛血清白蛋白标准曲线（双缩脲法）
吸光度-蛋白浓度现性方程：
实验试剂
双缩脲试剂；
标准溶液贮备液：2mg/mLBSA溶液 待测蛋白液：卵清蛋白液
实验操作
1. 标准曲线绘制工作表 管号 试剂 mL BSA
(2mg/mL)
0
1
2 0.6 2.4 2.0
3 0.9 2.1 2.0
4 1.2 1.8 2.0
5 1.5 1.5 2.0
6 1.8 1.2 2.0
未 未 知1 知2 3.0 0.0 2.0 3.0 0.0 2.0
0.0 0.3 3.0 2.7 2.0 2.0
dH2O 双缩脲试剂
充分混匀,30 min以内在540nm处测定吸收度. 蛋白质浓度
(mg/mL)
0.0 0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
A540nm
数据处理
标准曲线绘制：用坐标纸，以吸光度值对标准蛋白质浓度作图 Y：A540；X：蛋白质浓度(mg/mL),
坐标刻度：涵盖全部测定值，易于读取，适当反应实验精度
比例：适当，基本保证图形为正方形，容易进行数据处理 数据点标示：用X，O 等图形，其中心点为数据值 趋势线回归：常用一元回归方程；直接估计——使实验数据点 分布在拟合曲线的两侧，
直线方程拟合：任意选取拟合曲线上两点，求直线方程
未知样品浓度：测Βιβλιοθήκη 值应在标准曲线范围以内 吸光度值代入方程 稀释倍数
实验5
双缩脲法测定蛋白质浓度
实验目的
掌握比色法测蛋白质浓度原理及方法 学习标准曲线绘制和分光光度计使用
双缩脲法测定蛋白质含量注意事项
双缩脲法测定蛋白质含量注意事项引言：蛋白质是生物体中一类重要的有机化合物，广泛参与生命活动的调控和执行，因此准确测定蛋白质含量对于许多研究和应用领域具有重要意义。
双缩脲法是一种常用的蛋白质含量测定方法，本文将介绍双缩脲法的原理和操作注意事项。
一、双缩脲法测定蛋白质含量原理双缩脲法是通过测定蛋白质中含有的酪氨酸和组氨酸的数量来确定蛋白质含量的。
在碱性条件下，酪氨酸和组氨酸能与二缩脲酸（DTNB）反应生成黄色产物，通过测定该产物的吸光度可以确定蛋白质的含量。
二、双缩脲法测定蛋白质含量的步骤1. 样品制备：将待测样品溶解于缓冲液中，使其浓度适宜，一般为1-10 mg/mL。
2. 反应体系配置：将待测样品、缓冲液、DTNB和NaOH按照一定比例混合，形成反应体系。
3. 反应进行：将反应体系置于适当的温度下孵育一段时间，使反应充分进行。
4. 吸光度测定：使用分光光度计测定反应体系中产生的黄色产物的吸光度，通常在415 nm波长下测定。
5. 蛋白质含量计算：根据吸光度的测定值，结合标准曲线，计算出待测样品中蛋白质的含量。
三、双缩脲法测定蛋白质含量注意事项1. 样品制备：样品溶解应充分，避免有团块存在，以保证测定的准确性。
2. 缓冲液的选择：不同样品可能需要不同的缓冲液，应根据样品的特性选择合适的缓冲液。
3. DTNB的浓度：DTNB的浓度应适中，过高或过低都会对测定结果产生影响，一般为0.01-0.1 mol/L。
4. 孵育时间：反应体系的孵育时间应控制在适当范围内，一般为10-30分钟，过长或过短都会对测定结果产生影响。
5. 反应体系的pH值：反应体系的pH值应控制在适当范围内，一般为9-10，过高或过低都会影响反应的进行。
6. 吸光度测定条件：吸光度的测定应在反应结束后尽快进行，避免产物的分解或其它因素对测定结果的干扰。
7. 标准曲线的制备：应制备一条符合线性关系的标准曲线，通过测定一系列不同浓度的蛋白标样来制备标准曲线。
双缩脲法试验一蛋白质含量测定
0 0 3 2
1 2 3 4 5 6 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 2.7 2.4 2.1 1.8 1.5 1.2 2 2 2 2 2 2
实验一 蛋方法
2．样液测定
取未知浓度的蛋白液 3.0ml 置试管内，加入双缩尿试剂 2.0ml ，混匀，测其 540nm 的值，对照标准曲线方程， 求得未知液蛋白浓度。 ( 注意：计算浓度时，不要把 2ml 双缩脲试剂计算在内，只
生化技术实验
生物实验中心 2009.10
实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法
一、 目的 学习掌握双缩脲法测定蛋白质含量。 了解其它一些蛋白质定量方法。
(BCA 法、 folin- 酚试剂法，即 lowry 法，紫外分光光度 法,280nm）
实验一 蛋白质含量测定--双缩脲法
二、原理：
一.
实验目的
了解热水提取多糖的过程与注意事项。并了解 目的物质提取过程中的主要影响因子及其相互
关系。
掌握sevag试剂法除蛋白和乙醇沉降多糖的方法
与注意事项。
并学会使用旋转蒸发仪分离浓缩目的物质。
二 .实验原理
用热水提取真菌植物子实体中的多糖 , 利用 多糖类物质在热水中溶解度较高 , 将其提取 出来。 利用 sevag 试剂将游离蛋白变性成为不溶性 物质,经离心分离去除,可达到去除杂蛋白的 目的 接着利用多糖在乙醇中溶解度降低的原理将 多糖从溶液当中沉降出来。
三、 仪器
中低速离心机、循环真空泵、布式漏斗、 高速干粉粉碎机、恒温水浴锅、旋转蒸发 仪，可见分光光度计。250ml烧杯、试管、 移液管若干、1000mL的磨口锥形瓶1个/组。
生物化学实验讲稿
实验四双缩脲法测定蛋白质浓度[实验原理]具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与铜离子形成紫色配合物，在540nm处有最大吸收。
在一定浓度的范围内，蛋白质和浓度与双缩脲反应所呈的颜色深浅成正比，可用比色法定量测定。
[实验仪器及用品]实验器材：容量瓶、试管、吸管、722型（或7220型）分光光度计。
实验试剂：双缩脲试剂；卵清蛋白质溶液；未知液[实验内容及步骤]一、标准曲线的绘制将6只10ml容量瓶编号，按下表加入试剂，即得6种不同浓度的蛋白质溶液。
取干净试管7只，按0、1、2、3、4、5、6编号，1-6号管分别加入上述不同浓度的蛋白质液3.0ml。
0号为对照管，加入3.0ml蒸馏水。
各管加入双缩脲试剂2.0ml，充分混匀，即有紫色出现，用540nm光测定各管吸光度，绘制浓度-吸光度曲线。
二、样液的测定取未知浓度的蛋白质溶液3.0ml臵试管内，加入双缩脲试剂2.0ml，混匀，测其540nm吸光度。
三、数据记录和处理根据标准溶液的吸光度，在坐标纸上绘制出浓度-吸光度曲线，测出位知液的吸光度后，在标准曲线上查出未知液的浓度。
实验五酵母核糖核酸的分离及组分鉴定一、目的了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。
二、原理酵母核酸中RNA含量较多。
RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。
核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。
加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。
三、器材1．乳钵 2．150mL锥形瓶3．水浴4．量筒5．布氏漏斗及抽滤瓶6．吸管 7．滴管8．试管及试管架 9．烧杯 10．离心机11．漏斗四、试剂和材料1．0．04 mol／L氢氧化钠溶液1000 mL2．酸性乙醇溶液500mL将0．3毫升浓盐酸加入30毫升乙醇中。
3．95％乙醇1000mL4．乙醚500 mL5．1．5 mol／L硫酸溶液200mL6．浓氨水50 mL7．0．1 mol／L硝酸银溶液50mL8．氯化铁浓盐酸溶液80mL将2mLl0％三氯化铁溶液(用FeCl3?6H2O配制)加入到400mL浓盐酸中。
蛋白质测定方法之双缩脲法Biuret法
一实验原理双缩脲NH3CONHCONH3是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物;在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应;凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应;紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量;测定范围为1~10mg蛋白质;干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等;此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少;主要的缺点是灵敏度差;因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定;二试剂与器材1.试剂：1标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白BSA或标准酪蛋白,配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液,可用BSA浓度1mg/ml的A280为来校正其纯度;如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液;牛血清清蛋白用H2O 或%NaCl配制,酪蛋白用0．05N NaOH配制;2双缩脲试剂：称以克硫酸铜CuSO45H2O和克酒石酸钾钠KNaC4H4O64H2O,用500毫升水溶解,在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液,用水稀释到1升,贮存于塑料瓶中或内壁涂以石蜡的瓶中;此试剂可长期保存;若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制;2.器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等;三操作方法1.标准曲线的测定：取12支试管分两组,分别加入0,,,,,毫升的标准蛋白质溶液,用水补足到1毫升,然后加入4毫升双缩脲试剂;充分摇匀后,在室温20~25℃下放置30分钟,于540nm处进行比色测定;用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液;取两组测定的平均值,以蛋白质的含量为横座标,光吸收值为纵座标绘制标准曲线;2、样品的测定：取2~3个试管,用上述同样的方法,测定未知样品的蛋白质浓度;注意样品浓度不要超过10mg/ml;三、Folin—酚试剂法Lowry法一实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一;过去此法是应用最广泛的一种方法,由于其试剂乙的配制较为困难现在已可以订购,近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代;此法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即Folin—酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度;这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物;Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深兰色钼兰和钨兰的混合物;在一定的条件下,兰色深度与蛋白的量成正比;Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤;以后在生物化学领域得到广泛的应用;这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,缺点是费时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多;对双缩脲反应发生干扰的离子,同样容易干扰Lowry反应;而且对后者的影响还要大得多;酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用;浓度较低的尿素%,硫酸纳1%,硝酸纳1%,三氯乙酸%,乙醇5%,乙醚5%,丙酮%等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时,必须作校正曲线;含硫酸铵的溶液,只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液,即可显色测定;若样品酸度较高,显色后会色浅,则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍;进行测定时,加F olin—酚试剂时要特别小心,因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定,但上述还原反应只在pH=10的情况下发生,故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时,必须立即混匀,以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前,还原反应即能发生;此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定;此法可检测的最低蛋白质量达5mg;通常测定范围是20~250mg;二试剂与器材1.试剂1试剂甲：A10克Na2CO3,2克NaOH和克酒石酸钾钠KNaC4H4O64H2O;溶解于500毫升蒸馏水中;B克硫酸铜CuSO45H2O溶解于100毫升蒸馏水中,每次使用前,将50份A与1份B 混合,即为试剂甲;2试剂乙：在2升磨口回流瓶中,加入100克钨酸钠Na2WO42H2O,25克钼酸钠Na2MoO42H2O及700毫升蒸馏水,再加50毫升85%磷酸,100毫升浓盐酸,充分混合,接上回流管,以小火回流10小时,回流结束时,加入150克硫酸锂Li2SO4,50毫升蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾15分钟,以便驱除过量的溴;冷却后溶液呈黄色如仍呈绿色,须再重复滴加液体溴的步骤;稀释至1升,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中保存;使用时用标准NaOH滴定,酚酞作指示剂,然后适当稀释,约加水1倍,使最终的酸浓度为1N 左右;3标准蛋白质溶液:精确称取结晶牛血清清蛋白或g—球蛋白,溶于蒸馏水,浓度为250 mg/ml左右;牛血清清蛋白溶于水若混浊,可改用 % NaCl溶液;2.器材1可见光分光光度计2旋涡混合器3秒表4试管16支三操作方法1.标准曲线的测定：取16支大试管,1支作空白,3支留作未知样品,其余试管分成两组,分别加入0,,,,,,毫升标准蛋白质溶液浓度为250mg/ml;用水补足到毫升,然后每支试管加入5毫升试剂甲,在旋涡混合器上迅速混合,于室温20～25℃放置10分钟;再逐管加入毫升试剂乙Folin—酚试剂,同样立即混匀;这一步混合速度要快,否则会使显色程度减弱;然后在室温下放置30分钟,以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于700nm处测定各管中溶液的吸光度值;以蛋白质的量为横座标,吸光度值为纵座标,绘制出标准曲线;注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深,因此各项操作必须精确控制时间,即第1支试管加入5毫升试剂甲后,开始计时,1分钟后,第2支试管加入5毫升试剂甲,2分钟后加第3支试管,余此类推;全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟,则第1支试管可立即加入毫升试剂乙,1分钟后第2支试管加入毫升试剂乙,2分钟后加第3支试管,余此类推;待最后一支试管加完试剂后,再放置30分钟,然后开始测定光吸收;每分钟测一个样品;进行多试管操作时,为了防止出错,每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格;表中是每个试管要加入的量毫升,并按由左至右,由上至下的顺序,逐管加入;最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量微克和测得的吸光度值;2.样品的测定：取1毫升样品溶液其中约含蛋白质20~250微克,按上述方法进行操作,取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照;通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起,同时进行;即在标准曲线测定的各试管后面,再增加3个试管;如上表中的8、9、10试管;根据所测样品的吸光度值,在标准曲线上查出相应的蛋白质量,从而计算出样品溶液的蛋白质浓度;注意,由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸,显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化;因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度相对于标准蛋白质;。
蛋白质定量的五种方法
蛋白质定量得五种方法方法一双缩脲法测定蛋白质浓度[目得］掌握双缩脲法测定蛋白质浓度得原理与标准曲线得绘制。
[原理]双缩脲（NH2CＯNHCOＮH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物,称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键（—ＣＯＮH—)在碱性溶液中也能与Cu２＋反应产生紫红色化合物。
在一定范围内,其颜色得深浅与蛋白质浓度成正比。
因此,可以利用比色法测定蛋白质浓度。
双缩脲法就是测定蛋白质浓度得常用方法之一.操作简便、迅速、受蛋白质种类性质得影响较小,但灵敏度较差，而且特异性不高.除—CONH—有此反应外，—CＯNＨ2、—CＨ2ＮＨ2、-CS－NＨ2等基团也有此反应。
[操作］取中试管7支，按下表操作．各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟.用5４0nｍ比色,以空白管调零点,读取各管光密度值。
[计算］（一）在座标纸上以光密度为纵座标,以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。
(二)从标准曲线中查出待测血清样本得蛋白质浓度(ｇ／L),并求出人血清样本得蛋白质浓度.（三）再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出人血清样本得蛋白质浓度(ｇ／L)。
[器材]中试管7支,l毫升刻度吸管3支,10毫升刻度吸管１支，水浴箱，７21型分光光度计、坐标纸。
[试剂］(—)6Ｎ NaOH:称取240ｇ氢氧化钠溶于1000mｌ水中。
(二）双缩脲试剂:称取CuS04·5H２O 3。
0克,酒石酸钾9.0 克与碘化钾５.０克,分别溶解后混匀,加6ＮNaＯH l00mｌ，最后加水至1000mｌ,贮于棕色瓶中，避光，可长期保存.如有暗红色沉淀出现,即不能使用.（三)０、９%NａCl．(四）蛋白质标准液(１0ｍg／ｍ1),称取干燥得牛血清蛋白100、０mｇ，以少量生理盐水溶解后倒入ｌ0ml容量瓶中，淋洗称量瓶数次,一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线,或用凯氏定氮法测定血清蛋白质含量,然后稀释成ｌ0mg/ｍ1作为蛋白质标准液。
蛋白质的定量测定一-双缩脲法
06
CATALOGUE
双缩脲法的改进和发展方向
改进方法
优化试剂配比
通过调整试剂浓度和比例，提高方法的灵敏度和 准确性，减少误差。
扩大应用范围
针对不同来源和性质的蛋白质样品，优化实验条 件，使其能够适用于更多样品的测定。
ABCD
简化操作步骤
减少实验步骤，降低操作难度，提高实验效率。
提高检测速度
采用快速显色反应或缩短反应时间的方法，缩短 实验周期，提高检测速度。
蛋白质结构研究
通过双缩脲法测定不同蛋白质的含量，有助于研究蛋白质的结构和 功能，进一步了解生物体的生命活动。
蛋白质合成与代谢研究
双缩脲法可以用于研究生物体内蛋白质的合成与代谢过程，探索相 关生理机制。
在医学研究中的应用
临床诊断
双缩脲法可以用于检测尿液、血 液等生物样本中的蛋白质含量， 辅助医生进行临床诊断。
药物研发
在药物研发过程中，双缩脲法可 用于检测药物对蛋白质的影响， 评估药物的疗效和安全性。
病理学研究
通过双缩脲法测定病变组织中蛋 白质的含量，有助于病理学研究 ，深入了解疾病的发生和发展机 制。
在食品工业中的应用
食品品质控制
01
双缩脲法可以用于检测食品中的蛋白质含量，确保食品品质符
合标准。
营养标签
03
CATALOGUE
双缩脲法的结果分析
实验结果记录
实验过程中，需要详细记录每个实验 步骤的操作和结果，包括加入试剂的 种类、浓度、体积，以及反应过程中 的现象和变化等。
实验结果记录应准确、详细，包括实 验数据和观察到的现象，以便后续分 析和处理。
结果计算与处理
根据实验记录的数据，进行相应的计 算和处理，以得出蛋白质的含量。
双缩脲法 bca法
双缩脲法 bca法
双缩脲法（BCA法）是一种用于测定蛋白质浓度的方法。
它是一种比较常见的蛋白质定量方法之一，通常用于生物化学和分子生物学实验中。
BCA法的原理是利用蛋白质中的蛋白质和蛋白质与铜离子的螯合反应来形成紫色络合物，通过比色测定络合物的光密度来确定蛋白质的浓度。
BCA法与传统的Lowry法和Bradford法相比具有许多优点。
首先，BCA法对常见的干扰物质（如盐类、胆碱盐和还原剂）的耐受性更好，这使得在复杂样品中测定蛋白质更加可靠。
其次，BCA法对于碱性蛋白质的测定更加准确，而Lowry法和Bradford法对于这类蛋白质的测定可能存在一定的偏差。
此外，BCA法还具有高灵敏度和较宽的线性范围，可以测定非常低浓度的蛋白质。
在实际操作中，进行BCA法测定蛋白质浓度的步骤通常包括制备一系列标准溶液、将待测样品和标准溶液与BCA试剂混合反应、通过比色法测定吸光度并据此计算蛋白质浓度等。
需要注意的是，在进行BCA法测定时，应当严格按照操作规程进行，以确保结果的准确性和可重复性。
总的来说，双缩脲法（BCA法）是一种准确、灵敏且稳定的蛋白质定量方法，广泛应用于科研实验室和生物制药领域。
通过BCA 法可以快速、准确地测定样品中蛋白质的浓度，为后续的实验和分析提供可靠的数据支持。
蛋白质的定量测定一——双缩脲法
微量移液器
吸嘴装在吸液杆上，应套牢避免间隙。 依据所需容量旋转手轮，使数轮显示所需值。 轻轻地将推动按钮下压，使推动按钮推移至第一
停点位置。 手持取液器垂直浸入溶液中，吸嘴浸入深度为2-
4mm，停留2-3秒后缓慢放松按钮，即回到原来位 置，溶液吸入后稍停即可将吸嘴移出液面。 将取液器吸嘴置于排液容器内。使吸嘴尖紧贴容 器内壁，按压推动按钮至第二停点位置，使溶液 排尽，松开按钮。 移液完毕，按压卸嘴按钮，将吸嘴脱卸。
物理性质：紫外分光光度法。
化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法等。
染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。
其他性质：免疫比浊法。
蛋白质的定量测定——双缩脲法
实验目的要求 1、学习分光光度法原理，了解分光光度
计的结构。 2、掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理
及方法。 3、了解标准曲线的制作方法及其在物质
浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使 溶液澄清后离心，取上清液再测定。
实验报告书写要求
按以下序列书写： 1 实验目的 2 实验原理 3 实验材料 4 实验步骤 5 实验结果与分析
3．器材
试管、试管架、刻度吸管、微量移液器、旋 涡混合器、22PC型、UNICO2000型可见分 光光度计、S54型、UV-8500型紫外分光光 度计。
【实验方法】
1．制作标准曲线
取6支干燥洁净试管编号，按下表加入下列试剂：
加入物（ml）
0
1
2
3
4
5
标准蛋白液/ml
0
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
定量测定中的应用。
分光光度法原理
分光光度法，常被用来测定溶液中存在 的光吸收物质的浓度，其基本原理是根据 Lambert和Beer定律。
双缩脲法测定蛋白质的浓度
紫外吸收法：5μg 考马斯亮蓝法（Bradford法）：1~5μg
双缩脲
2 2 2
2
1800
2
加热
H－
＋ NH3
2 2
双缩脲
双缩脲反应:碱性环境
H 2O
O=C HN R-CH O=C HN R-CH
Cu
C=O NH CH-R C=O NH CH-R
H 2O的肽键（与双缩脲中肽键相似）， 因此有双缩脲反应。
三、实验仪器、材料和试剂
（一）仪器 吸量管（1毫升，2毫升，5毫升）、试管及试管架、721或 7220型分光光度计。 （二）材料 1． 标准蛋白溶液(2~5mg/ml)、 未知液 （三）试剂 1．双缩脲试剂 溶解0.175克硫酸铜（CuSO4.5H2O）溶于 15ml蒸馏水，置于100ml容量瓶中，加入30ml冰冷的蒸 馏水和20ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置1~2h， 再加蒸馏水对刻度，摇匀备用。
在碱性溶液中蛋白质与cu2形成紫红色络合物其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关因此被广泛地应用
双缩脲法测定蛋白质的浓度
N端
C端
相关知识
目前常用的有四种经典方法： 定氮法：灵敏度0.2~1.0mg 双缩尿法（Biuret法）：1~2mg Folin－酚试剂法（Lowry法）：50~100μg
四、实验操作步骤
（一） 绘制标准曲线 （二）未知样品蛋白质浓度的测定
1．取12支试管
6支分别加入0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0毫升的标准 6支分别加入1毫升不同稀释浓度的待测液（两两相同）。 2.分别加水补足到2毫升。 3.分别加入4毫升双缩脲试剂在室温下放置30分钟。 4.在540毫微米波长下 7220型分光光度计比色、读数，记录各 管A值。 ．
双缩脲法测定蛋白质浓度实验报告
双缩脲法测定蛋白质浓度实验报告下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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然ห้องสมุดไป่ตู้置于 1000ml容量瓶中，加入300ml浓氨水、300ml冰
冷的蒸馏水和200ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置 2小时，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。
四、实验步骤 1、标准曲线的绘制：取7支干燥的试管，按下表加入试剂：
0 2mg/ml 牛血清白蛋白液（ml） 0 蒸馏水（ml） 3 双缩脲试剂（ml） 2.0 OD540 0 1 0.3 2.7 2.0 2 0.6 2.4 2.0 3 0.9 2.1 2.0 4 1.2 1.8 2.0 5 1.5 1.6 2.0 6 1.8 1.2 2.0
将上述溶液混合后，试管中即有紫红色出现，在540nm下测 的各管的吸光度，以蛋白质浓度为横坐标，OD值为纵坐标作出标 准曲线。 2、 样液的测定 取未知浓度的蛋白质溶液 3.0ml 置试管中，加入双缩脲试剂 2.0ml，混匀，测其540nm的吸光度，对照标准曲线求得未知液蛋 白质浓度。
蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行 此反应。双缩脲反应可作为蛋白质定量测定的依据。
二、实验仪器
1、 试管 2、 吸管 3、 7200分光光度计
三、实验试剂
1 、 2mg/ml 牛 血 清 白 蛋 白 液 ： 将 1g 牛 血 清 白 蛋 白 溶 于
0.9%NaCl溶液并稀释至1000ml.
实验五
一、实验原理
双缩脲法测定蛋白质的浓度
具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。 蛋白质在碱性溶液中可与 CU2+ 形成紫色化合物，在一定 浓度的范围内，蛋白质浓度与生成的紫色化合物颜色的
深浅成正比，可用比色法测定。
双缩脲反应
尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨而形成双 缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色 的化合物，此反应称为双缩脲反应。