骨移植、骨库与骨生物材料

骨移植、骨库与骨生物材料


2003-12-01 13:37



骨移植是将一部位之骨组织离体后移植于人体内另一骨骼有缺损或需要加强或固定处的一种手段，是组织移植中最常用的方法之一，骨组织的保存也要比皮肤、筋膜、肌腱、血管以及其它移植组织容易的多。这是因为被移植的骨组织不完全取决于它成活的细胞，而是需经过受区缓慢的爬行替代过程，代之以新的有生命的骨组织，由于所产生的免疫排斥反应低，是最先移植成功的组织。

1668年荷兰人Job van Meekeren报道了一例骨移植术：将狗的颅骨移植到伤员的颅骨缺损处，因为这种治疗方法不符合基督教教义，后来伤员要求取出移植物。17世纪以后科学家们对骨形态生理和骨移植机理进行了研究，1674年荷兰科学家Leeuwenhoek利用发明的显微镜对骨组织进行了最初的观察，1684年Heyde对蛙的骨折愈合过程进行了研究，认为骨痂是由骨折端血凝块钙化而成的。1739年Duhamel将银丝植于骨膜下，数月后银丝被骨包埋，他认为这是由于骨膜成骨所造成的。1836年Heine通过切除肋骨，但保留肋骨骨膜，发现肋骨可重新长出，证实骨膜具有成骨能力。1842年Fluorens进一步证实骨膜的成骨作用，并认为骨膜细胞在骨缺损修复过程中起重要作用。法国科学家Ollier自1858年首先开始对骨移植机理进行研究，1867年Ollier报道了他的研究成果，他发现骨膜及骨在游离状态下可以短期存活，低温保存有利于其存活，在适当的环境下骨膜、哈佛管内皮细胞和骨内膜细胞均参与成骨。1893年Barth认为新鲜骨移植物的细胞均要坏死，移植骨未经吸收就被宿主来源的新骨所替代，并将这一过程称为“爬行替代”。1907年Axhausen认为移植骨除骨膜细胞外其它细胞成分均坏死，移植骨的修复依赖于宿主骨膜、骨内膜、骨髓及周围结缔组织的侵入，侵入移植骨的间充质细胞先转变为破骨细胞，吸收旧骨，而后转变为成骨细胞，产生新骨，他引用了’爬行替代”
这一述语。以上科学研究为骨移植的临床应用奠定了基础。1820年Walther将开颅取下的骨片植回颅骨缺损处，开创了首例游离自体骨移植术。1880年Macewen将同种异体胫骨移植至4岁男孩感染性肱骨缺损处，最终获得满意疗效，这是医学史上的第一例同种异体骨移植。1907年Lexer首先施行了同种异体关节移植。至1925年Lexer共施行同种异体全膝关节移植２３例，半膝关节移植11例，成功率达50%。本世纪初骨移植迅速地在临床推广，Bnamam、Tietze、Muller、Tomita、Lexer和Albee等先驱学者对骨移植的临床应用做出了重要

贡献，1915年Albee出版了关于骨移植的专著，到1923年Albee报道临床自体骨移植3000例，Lexer报道了自体骨移植1000例。至此骨移植术的临床价值得到肯定。

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一、移植骨的转归(Changes of Transplanted Bone)

松质骨和皮质骨在移植后的初期阶段的改变是相似的。由于初期的炎症反应，常有组织水肿，因为缺乏血供，绝大部分移植骨发生坏死。由于骨的特殊组织结构，营养物质能够到达移植骨内细胞的量是有限的，没有充足的营养，大部分骨细胞难以成活，只有通过哈佛管和骨小管，移植骨的最内层细胞才能获得一些营养物质。因此，唯一能够成活的骨细胞是最靠近受区，能从周围组织获得营养物质的部分骨细胞。不能成活的骨细胞发生自溶性坏死，遗留无数空的骨细胞陷窝，坏死组织由逐渐长入的巨噬细胞清除。受区肉芽组织逐渐充填了空的骨细胞陷窝。肉芽组织只含有毛细血管和原始的间充质组织。间充质组织的生长受毛细血管生长的影响，因为在缺乏血液供给的情况下，这些细胞不能成活，因而，受区血运不良时，使这一过程减慢，植骨前和术中注意改善植骨床的血运是很重要的。这一阶段至少持续2周。

在松质骨，原始的间充质细胞很快转化为成骨性细胞(osteogenic cells)，绝大多数成骨性细胞来自宿主。随着成骨细胞的形成，骨样组织沿着坏死小梁骨的边缘沉积，移植骨中心部分发生的坏死被有活性的破骨细胞吸收。因为老的坏死基质主动的被活的骨小梁替代，但骨的大体解剖结构相对没有发生变化。最后阶段是老的骨髓腔被有活性的新的骨髓细胞充填，最终完成整个爬行替代过程。

皮质骨移植后的修复过程与松质骨略有不同，虽然也发生有活性的血管肉芽组织长入，但比松质骨显得特别慢。这是因为，松质骨的结构有利于营养物质的弥散，这对存活的部分骨细胞很有利。而且，受区的血管肉芽组织也易于长入。营养物质不易通过皮质骨，因而对皮质骨内存活的骨细胞继续生存和受区肉芽组织的长入均受影响。皮质骨块植入后，其暴露缘被受区破骨细胞吸收，哈佛管转变为小的髓腔，肉芽组织侵入，原始间充质组织充填大的腔隙。这一过程一直持续到髓腔达到预想的大小，此时吸收中止，修复过程显得突出，以成骨细胞充填腔隙为主，同时伴有活性的骨样组织沉积。在外侧面新骨的沉积，限制了在内侧面坏死基质内破骨细胞发生的量，这种机理的发生是由于坏死的皮质骨内含有许多小的具有主动形成新骨的骨单位，由于这一过程不一致，因此外侧面的骨质主动地被替代，而内侧部分的替代却受到

限制。

移植骨本身的结构决定了皮质骨和松质骨替代过程的速度有所不同。皮质骨移植后再生缓慢，是因为发生骨坏死的区域较松质骨大，而这些死骨必须经过血管肉芽组织的侵入、哈佛管的扩大、以及进行性破骨细胞的吸收与成骨性细胞的增殖才能被去除。不论是密质骨还是松质骨的骨小梁，必须被替代。移植骨的结构内骨小梁越多，被活骨所替代的过程就越快。骨质越密，替代就越缓慢，因而采用皮质骨移植时，应考虑到替代过程缓慢的缺点，但具有支撑固定的优点。松质骨移植的优点是替代过程易于进行，缺点是支撑作用较差。在移植骨表面可能有一些细胞是存活的，正如前所说，唯一能成活的骨细胞是最靠近受区，能从周围组织获得营养物质的部分移植骨。松质骨存活的骨细胞量，要比皮质骨存活的量大。

Enneking等人证实，所移植的皮质骨在6周后，其结构将会变得疏松，强度减弱。这种情况至少要持续6个月。只有在一年以后，约有60%的结构由替代的新骨组成，皮质骨的力学强度才有了一定的恢复。移植骨早期的疏松改变，是坏死骨的吸收所造成。其强度的减弱与疏松有关，而与坏死骨与活骨的混杂无关。对每一例接受植骨的患者说，只要采用游离骨片(块)移植，不论是自体骨、同种异体骨，还是各种方法保存的骨(冻干、冷冻、硫柳汞浸泡、著沸或高压灭菌、甚至脱钙骨)，都要经过这一死而复生的爬行替代过程。而且这一过程是逐渐、缓慢、持续不断的过程，最终将移植骨完全吸收，而代以新的、有生命的骨组织。

在有些病例，移植骨有时不能完全被吸收替代。在少数成人接受皮质骨移植后，没有被替代的量可高达90%，可长期遗留在体内，有的长达20年之久。在儿童，骨的吸收替代过程以及骨的塑形都比成人快，术后第2年，只有通过显微镜，才能识别出移植骨的结构。

Urist把移植骨的转归分为五个阶段。

第一阶段为术后数分钟至数小时的变化，主要表现为受区炎性反应和成骨细胞前体(preosteoblast)和破骨细胞前体(preosteoclast)的增殖。移植骨中的BMP以及各种分解产物引起受区细胞的趋化转移反应(chemolatic directional migration)，使受区细胞与移植骨内外侧暴露面接触。第一阶段为移植骨的反应期，不论移植骨取自自体还是同种异体，也不论是取自活体的新鲜骨还是贮存骨，反应是相似的。

第二阶段和第三阶段是第一阶段的延续，从1～7d
开始发生，为手术损伤消退以后的变化，主要特征为，受区形成的成纤维细胞样间充质细胞与移植骨的BMP之间的反应。在自体移植中，

成骨细胞的分泌物也能产生BMP的转移和骨的诱导(osteoinduction)反应。在同种异体储存骨移植中，还需增加BMP从有机基质中转移至间充质细胞表面的过程。BMP能被高压或照射灭菌方法破坏。BMP的骨诱导反应可被过敏样反应(hpyersensitivity-like reaction)所抑制，而且在组织不相容性免疫反应中，可观察到浆细胞、网状细胞及其他细胞浸润。这种抑制现象，在接受活体同种异体新鲜植骨后第3周出现，在接受粗制的冻干同种异体植骨后第4周出现。

第四阶段为术后数月至数年，主要为移植骨与受区骨发生传导。这种骨传导(osteoconduction)的发生，取决于受区的新骨长入。新生血管和新骨除长入生物性结构的移入物外，还可长入非生物性结构(nonbiologic structure)，例如甲基丙烯甲酯(methylmethacrylate)、陶瓷(ceramics)以及硫酸钙，还能长入已变性的生物结构(denatured biologic structure)的植入物中，例如，经照射灭菌的骨和高压消毒灭菌的骨。骨传导可被植入物与受区之间形成的纤维组织膜所阻止，但植入物与受区之间的间隙存在接触压力时，能促进骨连接发生。在骨连接中，植入物的结构仅起被动作用。未变性的可吸收性植入材料比非生物性不能吸收的植入材料容易发生骨传导。

在第五阶段，自体骨移植或同种异体移植逐渐地恢复力学特性。此阶段可长达2～20年，取决于植入材料的质量与形状。成功的自体移植、同种异体移植以及非生物性植入物最终与受区骨结构混杂在一起。第五阶段与第四阶段同样重要，因为随着修复过程的消退，大约有10%容积的植入物需塑形。因此，无活性的骨(有骨细胞陷窝而无细胞存在的骨)要占成功的自体或同种异体植骨总量的90%。


二、植骨吸收细胞及细胞因子(Cells and Cytokines for Resorption of Bone Grafts)

移植骨的吸收是由细胞介导的，但吸收细胞的表型特征一直未得到肯定。目前对植骨吸收细胞有两种看法，一是认为骨移植物吸收是由破骨细胞介导的；另一种看法则认为骨表面的单核细胞和多核巨细胞决定着骨吸收，并指出这些单核及多核巨细胞同破骨细胞之间存在本质的差别。

支持第一种观点的依据有：

①破骨细胞由循环中的单核细胞融合形成，这些单核细胞起源于骨髓多能造血干细胞；②单核吞噬细胞系统的细胞如单核细胞和各种组织巨噬细胞具有许多破骨细胞的功能、细胞化学及形态特点，它们是破骨细胞的前体细胞；

③单核吞噬细胞所具有的破骨细胞特性包括抗胰蛋白酶粘附底物能力、细胞表面受体、无活性颗粒吞噬和形成多核细胞样破骨细胞的形态。

④单核细胞和巨噬细胞可被吸引到骨表面，通过一定的刺激可分化形成具有破骨细胞组织化学和功能特点的破骨细胞；

⑤人外周血单核细胞及啮齿动物腹膜渗出的巨噬细胞能引起无活性的异种骨或同种异体骨溶解吸收，这些细胞作为破骨细胞的前体细胞在适当条件下可转化为多核破骨细胞；

⑥破骨细胞是一种骨表面MNGC，其超微结构特点是具有皱褶缘、亮区、囊泡区和破骨细胞基本部四个部分，研究发现其它类型的MNGCs可在骨-细胞界面上分化形成具有破骨细胞形态特征的皱褶缘和亮区。皱褶缘是破骨细胞骨吸收的场所，其具有分泌溶酶体酶和吸收被降解的骨基质成分的作用，皱褶缘的发达程度反映了破骨细胞的活跃程度。亮区的功能是使破骨细胞粘附在骨表面上；

⑦抗酒石酸酸性磷酸酶阳性是破骨细胞的典型细胞化学特征，观察发现脱矿骨表面的大部分MNGC显示出抗酒石酸酸性磷酸酶阳性表达，其形态又与破骨细胞极其相同。推测异位植骨表面细胞向破骨细胞转化依赖于骨组织微环境中的辅助信号，这种信号在骨脱矿后充分表现出来。

支持第二种观点的依据有：

①破骨细胞虽然可由循环中的单核细胞融合而成，但这种单核细胞前体细胞的本质尚不清楚；②破骨细胞与单核吞噬细胞在细胞化学、形态特征及功能方面存在差异，如破骨细胞是典型的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞，而大多数单核吞噬细胞不具有这一特点；

③Walters观察发现大鼠皮下植入骨块后，骨表面出现大量MNGC，但这些细胞不具有破骨细胞典型皱褶缘细胞膜的特点，由此认为MNGC只是异物巨细胞；

④Kelly等研究显示矿化骨植入成年大鼠皮下后，骨表面的MNGC不具有抗酒石酸酸性磷酸酶反应产物和破骨细胞形态特征；

⑤单核吞噬细胞缺乏破骨细胞在骨表面形成吸收陷窝的能力。进一步研究发现单核细胞、组织及炎性巨噬细胞均具备分化形成破骨细胞性骨吸收细胞的潜能，但必须存在骨衍生性基质细胞。

破骨细胞及单核吞噬细胞可能来源于同一类骨髓造血干细胞，这种多能造血干细胞能在一定的刺激下向成熟的破骨细胞和单核吞噬细胞分化，植骨局部的微环境因素可以改变单核吞噬细胞前体细胞的表型特征。在植骨表面，破骨细胞和单核吞噬细胞均发挥吸收溶骨的作用。当然，要充分证实植骨吸收细胞的表型尚需建立更理想的实验模型及观察方法。

研究发现，同种异体骨或异种骨移植局部会出现多少不等的巨噬细胞和T淋巴细胞，这是由于移植抗原介导的细胞免疫造成的。在完全脱抗原异种骨移植

局部亦能观察到单核巨噬细胞浸润，有人认为这是异物肉芽肿的组织学改变。在上述两种情况下，巨噬细胞在植骨局部发挥着免疫性和非免疫性功能。植骨局部的单核吞噬细胞被活化后能分泌多种细胞因子，这些细胞因子伴随其它类型细胞产生的细胞因子一起对植骨的吸收产生重要的调节作用。

随着免疫细胞化学及核酸分子原位杂交技术的发展，结合细胞和组织培养的研究，人们对植骨局部细胞因子的作用有了更进一步的认识。TNF-α和IL-1是植骨局部多种细胞产生的两种重要的细胞因子，有研究表明，它们对破骨细胞性植骨吸收有明显促进作用。TNF-α产生后可作为外周血单核细胞的趋化因子，诱导血源性单核吞噬细胞迁移至刺激部位，发挥其吞噬功能。TNF-α作为局部破骨性骨吸收刺激因子可促进破骨性骨吸收。此外单核吞噬细胞通过TNF-α的自分泌调节进一步产生更多的TNF-α和其它细胞因子。IL-1在植骨局部可以发挥以下作用：①对附近的巨噬细胞是一个强有力的趋化剂，并刺激其合成、分泌IL-1；②激活破骨细胞，促进骨吸收，并刺激破骨细胞增生，诱导破骨细胞分泌胶原酶和PGE；③阻止骨钙素的合成，影响新骨形成。另有研究表明，IL-1和TNF-α可通过自分泌和旁分泌方式刺激单核巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞及成骨细胞分泌GM-CSF。GM-CSF是一种单核吞噬细胞前体细胞分化的调节因子，也是MNGC形成的刺激因子。GM-CSF对破骨细胞的作用表明它能通过影响破骨细胞的形成而调节骨吸收，并可促进破骨细胞前体细胞的生长与分化。

由此可见，在植骨局部表达的细胞因子对骨材料的吸收产生着重要的调节作用。深入研究植骨局部巨噬细胞的募集机理及深刻认识骨吸收效应细胞的刺激因子将有利于提高骨移植材料的应用效果。


三、骨移植的材料(Bone Grafts)

（一）自体骨

在同一人体上将骨从一个部位移植到新的部位，称自体骨移植(autograft)。它的成骨潜能最大，可提供一些活的骨细胞，以松质骨最多，细胞存活时间也长。植骨的成功很大程度上取决于自体骨的质量、植骨床血供及有血运丰富的软组织覆盖。还必须有足够的固定，消除软组织与植骨之间的剪性活动，有利于新生血管长入植骨。在完成爬行替代过程中，植骨总会有一定程度的吸收，同时有新骨沉积在其表面。新鲜自体植骨会提供一些活的骨细胞，这已得到充分证实，问题是骨痂的形成是植骨存活细胞本身生长造成，还是受区骨祖细胞所致。许多权威人士一致认为，这些细胞的主要来源包括植骨受区骨表面的成骨细胞、骨髓细胞、受区的

软组织、以及血中循环的游离成分。某些表面细胞和在陷窝的骨细胞(陷窝最深0.30mm)是成活的，对早期形成的血管能够长入初期网质骨支架中，起着极其重要的作用。成骨性细胞的其他来源包括植骨骨内膜和骨膜的生骨层。

自体骨移植所携带的骨膜，对新骨的形成，是一种强烈的刺激剂，在动物实验中，应用游离骨膜桥状植于骨缺损部位，取得成功。

松质骨移植，有利于组织液扩散和血管肉芽组织的侵入，而皮质骨对组织液的扩散起屏障作用，血管肉芽性组织，只有通过哈佛管进入。而且，松质骨有较大的骨内面(endosteal surface)，对受区骨痂的形成，提供丰富的骨祖细胞来源，但皮质骨的骨内膜几乎对受区骨痂的形成无作用。松质骨(特别是髂骨)含有丰富的红骨髓，内含原始的网状细胞、未成熟的造血细胞、以及骨髓血管的内皮细胞等，均能提供丰富的骨祖细胞。在松质骨，新骨的形成先于坏死基质的清除，而皮质骨坏死的基质被清除之后，新骨才能形成，因而骨的替代过程显得较长。

髂嵴，胫骨前内侧面和腓骨中段，常作为自体骨移植的供骨区。其他供区有股骨大粗隆和肋骨。

(二)同种异体骨

同种异体骨移植是指同一种属个体之间的骨组织移植。

1. 同种异体骨移植生物学：

同种异体骨移植可以诱发宿主产生免疫排异反应，目前临床上多采用经冷冻、冻干或化学处理的同种异体骨，其细胞成分多已坏死，因此同种异体骨移植在与宿主愈合过程中的表现、作用机理和生物力学特征等方面，与自体骨移植有一定差异。

(1)同种异体骨移植在宿主的愈合过程：同种异体骨移植在宿主的愈合过程与自体骨移植有许多不同，主要表现为同种异体移植骨的成骨与血管穿入的速度和程度都不及自体骨，而同种异体移植骨更易被吸收。新鲜同种异体骨移植的早期宿主反应与自体骨移植类似，移植术后1周在同种异体移植骨周围发生明显的炎症反应，第2周时炎症反应达高峰，淋巴细胞为主要的浸润细胞，此后2个月淋巴细胞仍为主要浸润细胞，在移植骨周围有炎性纤维包膜形成，炎症反应因移植骨抗原性的差异而渐渐减轻，或持续至8个月以上。早期同种异体移植骨周围血管再生与自体骨类似，但端—端吻合形式的再生少见，移植1周末炎性细胞包绕再生血管，血管壁出现透明变性，管腔闭锁，移植骨存活细胞进行性坏死。新鲜同种异体骨移植早期，移植骨周边存活细胞可产生类似自体骨的成骨现象，但由于再生血管的闭锁和炎细胞浸润，导致这种初期成骨被吸收。在移植后4周左右，

宿主来源的组织侵入移植骨，发生二期成骨，但这种成骨的速度和成骨量远不及新鲜自体移植骨。冷冻、冻干等处理的同种异体骨，已几乎没有存活细胞，故移植至宿主后不产生早期的自身成骨，而完全依靠宿主组织侵入后发生二期成骨。

Burchardt认为同种异体骨移植与宿主的愈合主要受移植骨抗原性影响，他根据动物同种异体腓骨移植实验，将移植骨与宿主的愈合分为三型。I型：愈合过程与自体骨移植相似，没有疲劳骨折，移植16周后移植骨与宿主骨连接，移植骨的成骨量、塑形均与自体骨移植接近，提示供体与宿主的组织相容性抗原差异很小或没有差异；Ⅱ型：愈合过程缓慢，表现为：①较多发生不连接或延迟连接；②移植骨周边被吸收或移植骨体积变小；③移植骨内部被吸收范围扩大，延伸至间质板层；④移植骨机械强度明显下降，提示供者与宿主组织相容性抗原有较大差异；Ⅲ型：没有修复征象，移植骨迅速地被吸收，提示供者与宿主之间存在着强烈的组织相容性抗原差异。各种消除抗原处理可以改善同种异体骨移植与宿主的愈合。Heiple的实验表明新鲜自体骨移植与宿主骨的愈合最优，同种异体骨移植与宿主骨愈合的优劣次序为：冻干骨>冷冻骨>脱矿骨>冷冻+照射骨>冻干+照射骨>新鲜骨>脱蛋白骨。

同种异体骨移植的修复程度还与移植骨的性质和大小有关，较小的松质骨粒移植容易达到完全修复，而大段皮质骨移植则不能达到完全修复。Enneking等对16例同种异体骨干或关节，移植后4～65个月的临床标本进行放射学和组织学观察，发现移植皮质骨与宿主皮质骨的愈合连接缓慢，依靠宿主皮质来源的外骨痂连接，而移植松质骨与宿主松质骨的愈合连接较快，主要由宿主松质骨来源的内骨痂来连接，移植骨内部修复十分缓慢，而且主要发生在移植骨浅表面和两端，移植后5年，移植骨仅有20%被新骨替代，深层未修复部分仍保持原有的结构。

(2)同种异体骨移植的成骨机理

①自身成骨作用：新鲜同种异体骨移植，其移植骨存活细胞具有早期成骨能力，但因免疫排异反应，移植骨中供体来源的细胞被杀死，早期成骨被吸收，因此新鲜同种异体骨的自身成骨作用是无效的。库存同种异体骨的细胞成分多已死亡，也就不具有自身成骨能力。McGaw和Harbin早在1934年就证明骨髓具有成骨作用，Gray和Elves的研究表明自体骨移植成骨作用60%以上来自骨髓和骨内膜，30%来自骨膜，10%来自骨基质对局部组织的诱导。骨髓中含有定向成骨前体细胞和可诱导的成骨前体细胞，如将宿主骨髓与同种异体骨复合后移植，移植骨可获

得早期成骨能力。

②骨诱导作用：骨基质中提取的骨诱导物质，BMP，可在体外诱导结缔组织中的间充质细胞、骨髓基质细胞、滑膜细胞、成纤维细胞呈现软骨细胞及骨细胞表型。将BMP植入啮齿类动物肌肉、皮下等处，可引起软骨内成骨过程。未脱矿的同种异体骨植入动物肌肉内很难观察到骨诱导现象，这可能是由于矿盐与基质蛋白的紧密结合，抑制了BMP的释放，也可能在未脱矿骨中存在着某种BMP抑制因子。为了增加同种异体骨的骨诱导作用，需将其进行脱矿处理。

同种异体骨的诱导成骨活性和宿主对诱导成骨物质的反应，不同种属间有明显差异。啮齿类动物的骨诱导现象明显强于高等动物（如狗及灵长类动物），在高等动物BMP的靶细胞可能主要存在于骨骼系统，而骨外呆诱导的成骨前体细胞对BMP的敏感性较差；在高等动物需要高浓度BMP才能异位诱导成骨。

③骨传导作用：骨传导作用也就是支架作用，是移植物周围组织床的血管、骨祖细胞沿植入物的机械引导侵入其内部的过程。新鲜自体骨具有骨传导作用，其它无存活细胞的植入物，如库存同种异体骨、羟基磷灰石、聚乳酸、磷酸三钙等材料也具有骨传导作用。骨传导作用仅见于移植物植入骨骼系统内，若将无活性的植入物(无自身成骨作用和骨诱导活性)植入骨骼系统以外，仅能引起纤维组织替代，形成瘢痕。Nielsen在兔的双侧桡骨造成1cm的骨和骨膜缺损，在一侧用聚氨脂膜卷成管状，桥接骨缺损；对侧骨缺损不处理，作为对照；术后5周植聚氨脂膜组膜外来自两端的骨痂会师，并有骨膜形成，而对照组发生骨不连接，这个实验显示了骨传导作用的重要性。

(3). 同种异体骨移植的生物力学:

①同种异体骨初始生物力学特性：新鲜采集的同种异体骨生物力特性受多种因素影响，包括供者的年龄、性别、身体特征和取骨部位。很显然各种骨病和全身代谢性疾病会影响到骨的力学强度。20～39岁年龄组骨的强度最高，此后骨的强度随年龄增加而减弱，在70～79岁年龄组，骨的强度仍可维持在最大强度的70%～85%。一般情况下骨所能耐受的压力是张应力的两倍，最大张应力约为88～108N/mm，最大压应力为137～196N/mm。在不同解剖部位相同大小同质骨样品的强度差异在20%左右，相同解剖部位男性与女性骨的强度差异也在20%左右。②处理与贮存对骨生物力学特征的影响

冷冻：Frankel首先研究了冷冻对骨生物力学特性的影响，发现-25℃冷冻对骨弯曲负荷的机械强度无影响。Komender对-78℃冷冻骨进行测试，发现耐受压应力较新鲜骨减少了10%，张应力无改变，弯

压应力减少了10%。Pelker对-20℃～-196℃(液氮)冷冻骨的抗旋转应力和压应力测试，结果表明与新鲜骨无明显差异。但应注意如果将骨由室温直接浸入液氮急剧降温，可以造成骨的细小碎裂，会明显减弱骨的机械强度。

冻干：冻干处理可使骨发生纵向微细的或明显的裂纹，冻干骨再水化后抗弯曲应力较新鲜骨减少了45%～100%，抗旋转应力减少了61%，但抗压应力无明显改变或增加20%。

脱矿：马振国等对不同脱矿时间处理的狗骨进行了测试，发现脱矿率与抗弯曲应力的减少率呈直线正相关，脱矿率为49%时抗弯曲应力较不脱矿骨减少了31.50%，脱矿率在98.40%时抗弯曲应力减少84.30%；脱矿率在25.90%以下时，对骨的抗压应力强度没有影响，脱矿65.10%～77%时，抗压应力强度的减少维持在17.70%，脱矿98.40%时，抗压应力强度减少了88.20%。

γ射线照射:大剂量γ射线照射可以破坏骨胶原分子间的交连，造成骨力学强度改变。3
Mrads剂量以下的照射对骨的力学特性影响较小，其抗旋转应力仅较正常对照减少10%，而6 Mrads的照射可使骨抗旋转应力下降35%。

③同种异体骨移植愈合过程的生物力学特征：在自体皮质骨移植由于早期破骨细胞活跃，造成骨吸收，移植术后6周～6个月，移植骨的机械强度较正常骨下降约40％～50%，术后1～2年新骨渐渐形成，移植骨的机械强度逐步恢复正常。同种异体骨移植诱发宿主免疫排异反应，早期骨吸收较自体骨移植更为明显，移植骨的机械强度亦有更显著的减弱，其机械强度减弱的程度受组织相容性抗原差异大小的影响，此外同种异体骨移植术后的辅助治疗，如放疗、化疗也会降低移植骨的机械强度。在同种异体移植骨没有一定程度被宿主组织替代和血液供应重建前，不能对反复作用的较小应力发生生理适应性塑形，因此易发生疲劳性骨折。

2.
同种异体骨移植免疫学：同种异体骨移植与实质脏器移植有所不同，诱发的宿主免疫排异反应一般不引起危及生命的严重后果，但免疫排异反应往往干扰移植骨愈合，影响治疗效果。对骨移植免疫学研究始于50年代，随着免疫学技术的发展，对骨移植免疫的研究不断深入，已达到分子水平，成为骨科基础研究中活跃的领域之一。

(1)同种异体骨关节移植抗原：骨组织由矿物质、胶原、非胶原蛋白和细胞成分构成。骨骼中的矿物质不具有抗原性，胶原和非胶原蛋白仅是弱抗原，同种异体骨移植的抗原刺激主要来自其细胞膜表面糖蛋白，它们受主要组织相容性复合物(MHC)基因的控制，人类MHC基因位于第17对染色体上，称为HLA(human lymphocyte hist

ocompatibility anigen)系统。MHC抗原分为两大类，I类抗原在人类为HLA-A.B.C，广泛分布于有核细胞膜表面，可用血清学方法检测，故又称SD抗原(serologically defined antigen)，此类抗原是CD8+淋巴细胞识别“自我”的重要标记；Ⅱ类抗原在人类为HLA-D的DP.DI/DO.DQ.DR，主要存在于B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、被激活的T淋巴细胞，起初用混合淋巴细胞培养的方法检测，因而又称LD抗原(lymphocyte defined antigen)，这一类抗原的存在是激活CD4+淋巴细胞的必备条件。Burwell和Esses等证实新鲜同种异体骨移植主要抗原刺激来自骨髓，骨髓中含有造血细胞系、内皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞等多种细胞成分，它们多有Ⅱ类抗原的表达，因而可能起到抗原递呈细胞的作用，Czitrom认为骨髓中造血粒细胞系细胞是骨移植免疫主要的抗原递呈细胞。实验表明去除骨髓并不能消除同种异体骨的抗原性，这可能是由于骨髓细胞成分不易被彻底去除。此外Skjod等证实成骨细胞亦有Ⅱ类抗原表达，有γ干扰素存在的情况下Ⅱ类抗原的表达增强。这提示排异反应中，由于细胞因子诱导，加强了Ⅱ类抗原的表达，成骨细胞亦可起到抗原递呈细胞的作用。除主要组织相容性抗原之外，细胞表面还存在次要组织相容性抗原，如血型物质、组织特异性抗原、同功酶及Y染色体伴性抗原等，它们在同种异体骨移植免疫中的作用尚不明确。

软骨组织由软骨细胞和周围致密的基质构成，后者主要有蛋白多糖和Ⅱ型胶原两种成分。虽然Elves等证实软骨细胞与外周淋巴细胞有同样的MHC抗原，Lance等的研究表明正常软骨细胞仅有I类抗原表达，但在炎症或γ干扰素的作用下，软骨细胞亦表达Ⅱ类抗原，Langer等也证明游离软骨细胞能够刺激宿主免疫反应，但是完整的同种异体软骨移植并不引起宿主明显的排斥反应，软骨细胞可存活数年，这因为软骨细胞周围致密的基质形成屏障，软骨细胞处于免疫特免状态。Yablon等发现同种异体软骨移植物中的连接蛋白和蛋白多糖可以游离到滑液，沉积在滑膜，并诱发宿主产生特异性抗体和细胞免疫。由此可见同种异体软骨移植的抗原刺激主要来自其基质，而不是细胞。

(2)同种异体骨移植对宿主免疫系统的激活：同种异体骨植入宿主后，局部发生炎症反应，宿主淋巴细胞、巨噬细胞等炎性细胞侵入移植骨，带有I、Ⅱ类抗原的存活移植骨细胞，可以直接激活宿主T细胞。缺乏活的非自身细胞情况下，抗原递呈需要宿主巨噬细胞辅助。巨噬细胞吞噬移植骨释放的细胞残体，在细胞内消化分解后，抗原成分浓缩粘附在巨噬细胞膜表面，与巨噬细胞膜

表面的I、Ⅱ类抗原结合形成复合物，这种外来抗原与宿主I、Ⅱ类抗原复合物正是T细胞抗原的配体。外来或宿主抗原递呈细胞在递呈抗原的过程中还分泌IL-1等细胞因子。T细胞的激活需要两个信号刺激，第一信号是抗原递呈细胞所递呈抗原的特异性刺激，第二信号是非特异的，即IL-1、IL-2等细胞因子对淋巴细胞的自分泌或旁分泌调节作用。参与MHC抗原识别的T细胞有两类。CD4＋细胞，即辅助Ｔ淋巴细胞 ( t- helper lymphocyte, TH）细胞识别Ⅱ类抗原，TH又可分为功能不同的两个亚型：TH1激活后可以释放IL-2、IL-3、INF-γ、TNF-β、MG-CSF等细胞因子，具有活化巨噬细胞和细胞毒功能，与迟发性超敏反应有关。TH2在激活后释放IL-3、IL-4、IL-5和MG-CSF，具有诱导B细胞增生，并辅助B细胞分泌特异抗体。CD4＋细胞所分泌的多种细胞因子具有非特异放大排异反应的作用。CD8＋细胞，即细胞毒性Ｔ淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, TC）识别I类抗原，激活后产生IL-2、IL-4、TNF-γ、TNF-β，具有细胞毒功能。B细胞抗原受体与抗原结合产生特异性刺激，同时B细胞还需与TH细胞相互作用或与IL-4等细胞因子结合，才能被激活并产生特异性抗体。Muscolo等证实同种异体骨移植宿主周围血液淋巴细胞被致敏，表现为混合淋巴细胞培养细胞增殖动力学改变，抗体介导细胞实验显示宿主产生抗供体淋巴细胞抗体。Langer等采用白细胞游走抑制实验证实同种异体骨移植动物的白细胞已被致敏。这些实验清楚地表明同种异体骨在体内能够激活免疫系统。Horowitz等进行了体外淋巴细胞激活观察，发现去除与不去除骨髓的同种异体骨均能在体外致敏淋巴细胞，淋巴细胞的激活严格受MHC的限制，I、Ⅱ类抗原均与刺激T细胞增殖有关，受同种异体抗原刺激增殖的T细胞表现为Thy1+、CD8+、CD4-，CD8+细胞亚群中，有些克隆可以直接识别Ⅱ类抗原。

有些同种异体骨移植的病例，其临床观察到的排异反应要比预计的轻，这与机体的免疫调节有关。Rodrigo证实新鲜同种异体骨移植的大鼠，体内的抑制T淋巴细胞(CD8+)可以被激活，对免疫排异反应起负反馈调节作用。Langer发现同种异体关节移植患者的血清中存在特异的封闭抗体，对细胞介导的细胞毒起抑制作用。Segal在大鼠进行同种异体胎鼠骨移植，发现宿主产生Ⅱ类抗原的特异抗体，这种抗体能够抑制排异反应。

(3)同种异体骨移植免疫排异机理：同种异体实质脏器移植，其组织细胞是存活的，移植时需即刻吻合血管，恢复血液供应，同种异体抗原激发宿主免疫系统产生特异性抗体和细胞毒淋巴细胞，特异性免疫物与靶细胞发生作用，通过细胞介导细

胞毒、抗体介导细胞毒和抗体依赖的细胞介导细胞毒反应杀灭移植细胞，此外在特异性免疫反应过程中，还启动了补体系统、凝血系统、肾素系统、激活非特异炎症连锁反应，加剧了对移植脏器的排异，最终导致移植脏器的血液循环中断，外来细胞成分坏死。许多学者采用微量细胞毒实验证实，同种异体骨移植可诱发宿主产生特异性细胞毒淋巴细胞和抗体，在体外能与供体淋巴细胞发生抗体介导细胞毒、细胞介导细胞毒和抗体依赖细胞介导的细胞毒反应。这提示新鲜同种异体骨移植免疫排异反应的第一步与实质性脏器的情况类似，宿主产生的特异性免疫物质介导杀灭移植骨的存活细胞。

骨移植与其它实质脏器移植有以下几点不同：①骨组织含有大量矿化细胞外基质，而细胞成分少；②库存同种异体骨几乎没有存活细胞；③骨移植不需吻合血管；④骨移植的功能为支撑作用或促进局部成骨，而实质脏器移植则要恢复该脏器的正常功能。按照严格的定义，同种异体骨是植入物(implant)，而不是移植物(transplant)。同种异体骨移植的免疫排异结果，不仅是移植骨存活细胞的被杀灭，而主要表现为移植骨被吸收，没有爬行替代修复和血循环重建。Friedlaender对43例接受冻干同种异体骨移植的患者进行研究，其中9例患者血清中检测出抗HLA抗原抗体，但这9例患者骨移植均获得满意的疗效。这提示在没有存活细胞的冻干同种异体骨移植，虽然残余抗原能够刺激宿主产生特异抗体，但体液免疫在同种异体骨移植免疫排异反应中不起主要作用。目前一般认为细胞免疫在排异反应中起主导作用。Horowitz和Friedlaender，认为同种异体骨移植免疫排异反应分为两期，第一期由同种异体抗原刺激宿主产生特异的细胞毒淋巴细胞和抗体，直接作用于靶细胞，这一期反应与实质脏器移植的排异反应类似，仅见于新鲜同种异体骨移植。第二期表现为激活的免疫细胞产生细胞因子，这些细胞因子激活破骨细胞，造成移植骨的吸收。新鲜同种异体骨移植即有第一期反应，也有第二期反应，而库存同种异体骨因没有存活细胞，主要表现为第二期反应。

同种异体骨移植激活宿主免疫系统，除产生特异性抗体和细胞毒淋巴细胞外，还产生了许多细胞因子，如巨噬细胞分泌的IL-1、M-CSF，T细胞分泌的TNF等细胞因子，它们除了参与免疫反应的非特异调节外，还能影响成骨与破骨自身平衡。Horton和Raisz等发现外周单核细胞在有丝分裂原的刺激下，可产生增加体外骨培养中破骨细胞数量与功能的物质，命名为破骨细胞激活因子(osteoclast
activating
factor，OAF)。近来的研

究表明OAF样活性因子包括IL-1、TNF-α、TNF-β，其中IL-1起主要作用。在体外成骨细胞培养发现，短期IL-1刺激可暂时增加成骨细胞的胶原和蛋白合成，而持续IL-1刺激则抑制胶原、非胶原蛋白合成，引起碱性磷酸酶活性降低，矿盐沉积受阻。TNF-α和TNF-β对骨的影响与IL-1类似，但活性远不如ＩＬ-１强烈。Nguyen
等在大鼠持续给予ＩＬ-１，发现动物血清及尿钙增高，骨钙素下降，破骨细胞数目和骨吸收面积增加，认为IL-1是骨吸收介质。Thomson等证实IL-1、TNF-α、TNF-β对破骨细胞的激活需通过成骨细胞介导，IL-1刺激成骨细胞产生GM-CSF、IL-6和其它一些未知因子，这些细胞因子进而激活破骨细胞，导致骨吸收。破骨细胞来源于造血系统的粒细胞-巨噬细胞系，M-CSF、GM-CSF可刺激宿主骨髓产生更多的破骨细胞，加速移植骨的吸收。

(4)骨移植免疫与骨诱导的相互作用：

骨基质中含有多种生长因子和淋巴因子，它们对维持骨的成骨与破骨自身稳定起着重要作用，其中骨基质中的TGF家族生长因子与骨诱导现象有关，此外它们也是免疫调节因子。许多研究表明TGF-β是一种高效内源性淋巴细胞增殖与功能的抑制剂。

免疫细胞产生的IL-1、TNF等细胞因子具有抑制成骨，增强骨吸收的作用，免疫反应亦可抑制BMP的诱导成骨作用。免疫反应与骨诱导之间很可能存在着互为负反馈调节的相互作用。(5)减轻骨移植免疫排异反应的途径：

减轻同种异体骨移植免疫排异反应，可以通过供者与受者组织配型，对宿主的免疫抑制和对移植骨抗原的处理三个基本途径来达到目的。

①组织配型：很显然移植物如能与宿主达到良好的组织抗原配型，宿主不会发生免疫排异反应。在实验动物比较容易控制组织配型，但人类由于HLA的多态性，除同卵孪生外，再也不可能达到完全的组织配型。在脏器移植也只能对排异反应影响较大的个别位点配型，但目前临床上尚不对同种异体骨移植进行组织配型。

②对宿主的免疫抑制：临床对同种异体骨移植患者一般不使用免疫抑制剂，因为免疫抑制剂多有较大的副作用。但在动物实验已进行了较多关于免疫抑制的研究。肾上腺皮质激素可以抑制白细胞游走和溶酶体酶的释放，由此可能抑制IL-1和其它淋巴因子的产生，干扰巨噬细胞与淋巴细胞的相互作用，在宿主受抗原刺激之前给予皮质激素能够较有效地抑制免疫排异反应。硫唑嘌呤(azathiopurine,
AZT)可以抑制嘌呤合成，杀死有丝分裂期的淋巴细胞，宿主受抗原刺激后给药作用较好，可明显促进组织不配型同种异体骨移植的愈合。环胞素A对改善同

种异体骨移植的愈合，以及吻合血管同种异体骨移植的存活均具有良好的效果，环胞素A能抑制IL-1和IL-2的产生，抑制淋巴细胞IL-2受体的表达，从而抑制排异反应。氨甲蝶呤(methotrexate,
MTX)也能阻止淋巴细胞增殖，但Kliman等的研究表明MTX虽可抑制宿主产生特异抗体，但也延迟移植骨与宿主的愈合。抗淋巴细胞血清(anti-lymphocyte
serum,
ALS)主要抑制T淋巴细胞，干扰细胞免疫，组织不配型同种异体骨移植使用ALS，可有效地抑制免疫排异反应，促进移植骨愈合。③移植骨抗原处理：由于同种异体骨移植功能与实质脏器移植不同，移植骨可以没有存活细胞，因此可以采用多种方法，尽量去除或杀死移植骨内的细胞成分，以减弱其抗原性。尽量彻底刮除移植骨的骨髓、骨膜，反复洗涤，是简单有效的去除抗原方法，但机械方法不可能完全去除移植骨的细胞成分。1951年Kreuz等发现冻干处理可以减弱同种异体骨移植诱发的局部炎性细胞浸润。40多年间许多学者对新鲜、低温冷冻和冻干同种异体骨移植诱发的体液免疫和细胞免疫进行比较研究，结果基本上一致表明：新鲜同种异体骨移植诱发的排异反应最强，低温冷冻处理移植骨可稍减轻或延迟排异反应，而冻干处理移植骨则可明显减弱排异反应。关于低温冷冻与冻干处理减弱同种异体骨抗原性的机理尚不完全清楚，可能是由于冷冻和冻干处理进一步杀死残存活细胞，以及冻干处理使抗原结构发生物理性变化。脱矿处理可以减弱移植骨的抗原性，在此基础上，Urist于1973年采用连续化学处理，去除部分没有诱导成骨活性的非胶原蛋白，制成了诱导成骨活性强，而抗原性弱的骨基质明胶。1975年Urist又在脱矿骨的基础上，增加了自消化处理，以便使移植骨内残存细胞溶解，制成了自消化抗原去除的同种异体骨，简称AAA骨。其它一些强烈的处理方法，如煮沸、γ-射线照射等，虽可减弱移植骨的抗原性，但也破坏了骨诱导物质的活性，影响移植骨与宿主的愈合，这些方法已被放弃。

(三)异种骨

异种骨移植系指不同种属个体之间的骨组织移植。在众多的各种骨移植材料中，异种骨是最早被研究应用的一种。

动物骨来源广泛，取材方便，在临床上，异种骨移植具有非常重要的意义，不仅可以满足日益增多的患者对骨移植的需求，而且可以避免自体骨移植二次手术时可能造成的并发症，缩短手术时间，且没有同种异体骨移植可能导致交叉感染的危险。异种骨移植在骨科领域中主要用于加速骨折、骨不连的愈合，填充骨缺损及关节、脊柱融合等。

1.
异种骨移植免疫

研究：对任何异种组织器官移植而言，免疫排斥反应是移植成功的主要障碍。异种骨移植也同样面临强烈的免疫排斥问题。异种骨移植后，移植局部出现炎性渗出，伤口破溃，植骨受到排斥，这说明异种骨的生物相容性极差。

在异种骨移植排斥反应中，移植抗原的本质一直是一个值得研究的问题。在60年代，大多数学者认为皮质骨的主要抗原来源于骨组织内的血细胞成分而不是骨本身的细胞成分，并设想如果将牛皮质骨中的血清和红细胞清除，就有可能得到无免疫活性的异种移植骨。然而，进一步研究的结果并非如此。刘玮用免疫组织化学方法证实了牛骨移植抗原定位于骨细胞和哈佛管内皮上。Frank认为，异种骨基质中的非胶原蛋白成分有明显的免疫原性。但是，人们对异种骨抗原性方面的了解并不如对同种异体骨那样深刻。由此，我们必须结合异种器官移植的抗原性及同种异体骨移植的抗原性方面的资料来共同考虑。

目前认为，骨是一种复合组织，除骨组织本身的细胞成分和骨基质胶原外，还包括神经组织、脂肪组织、小血管和血液成分以及纤维结缔组织等，所有这些成分表面都具有遗传基因控制的特异性抗原，这些抗原会引起同种异体或异种骨移植后的免疫排斥反应。参与异种移植免疫应答的因素有多种，对异种骨移植而言，一般认为以特异性细胞免疫和体液免疫为主。

异种骨作为异种移植材料同异种器官移植有许多相似之处，但亦有差别。异种骨移植不象肝、肾、心等器官移植那样，需保持存活以及正常功能状态，而仅仅是提供短期的机械填充、支架作用和诱导成骨作用。异种骨在植入宿主体内之前多要经过一定的处理，这样就消弱了移植骨的抗原性。异种骨移植时也不会出现异种器官移植时表现的超急性免疫排斥反应现象。

2.异种骨移植免疫检测：异种骨移植后，进行细胞免疫和体液免疫等方面的检测是必要的，这样可以评价异种骨的抗原性和受体的免疫反应情况。在细胞免疫方面，可通过观察植骨局部的组织学变化及检测血液淋巴细胞群及亚群的变化来判断细胞免疫程度。桑宏勋将牛骨植入小鼠体内观察T淋巴细胞总数及亚群的变化，结果发现，新鲜异种骨移植后，免疫排斥反应强烈，局部组织有大量淋巴细胞浸润，外周血及脾内T细胞总数及其亚群数目均明显升高，尤以活化T淋巴细胞阳性率升高显著。在体液免疫方面，可以测定受体血清中免疫球蛋白含量，
抗骨抗原的特异性抗体的产生及抗原抗体复合物等。实验发现，异种骨植骨后1～2周，受体内即可测得特异性抗骨抗体，3

周时抗体滴度达到高峰，以后随着植骨吸收和抗原的不断清除，受体血清中抗体滴度不断下降。经过处理的异种骨移植术后6～8周，受体血清中抗骨抗体接近消失；而新鲜异种骨移植时，高滴度的抗体水平持续到术后12周以上。

3.
异种骨材料处理及问题：面对异种骨移植时的免疫排斥问题，人们尝试了多种骨材料处理方法，以消除异种骨的抗原性。传统的处理方法主要包括：冷冻和冷冻干燥（Bioplant骨）、脱钙骨、无机骨或脱蛋白骨(完全脱蛋白的Oswestry骨和部分脱蛋白的Kiel骨)，此外，还有煮沸、煅烧及放射线照射等。近年来又有许多Bio-os骨的研究应用报道。但迄今为止，这些方法处理的异种骨无一能取得满意效果。其中最主要的问题就是在消除异种骨抗原性的同时也消弱了异种骨的诱导成骨能力。研究证实，异种骨的抗原性和诱导活性具有共同的物质基础，在消除抗原性的同时也同样破坏了其诱导成骨物质。所以前面提及的异种骨处理方法难以使异种骨同时充分发挥这两方面的作用。

为了解决好异种骨的抗原性与诱导成骨活性之间的矛盾，有人提出复合植骨和将异种骨内两种成分分开处理的方法。刘玮和胡蕴玉用部分脱蛋白牛骨松质和提纯的bBMP复合为一体，将这种新材料命名为重组合异种骨(reconstituted
bone xenograft, RBX)，经动物实验及临床应用取得比较满意的效果。

4. 移植排斥对异种骨的影响

：研究已经证实，新鲜异种骨移植会引起强烈的免疫排斥反应，此时，成骨量少，或不成骨。而经过一定处理，使骨移植抗原减弱后再行移植，可大大消弱移植排斥反应，同时骨形成量增加。这说明免疫反应对骨形成有阻滞作用。

异种骨移植的免疫排斥反应包括体液免疫和细胞免疫，一般认为T细胞介导的免疫反应发挥主要作用，而体液免疫对移植物的排斥不肯定。Delustro在研究异种胶原移植时发现，低滴度特异性抗体的存在不影响骨的愈合过程。Elves研究显示，Oswestry骨移植2周时血清抗体水平低，
此时已有较多骨形成，6周时抗体水平达峰值，成骨量仍持续升高。赵长庚在重组合异种骨移植的研究中发现，低滴度抗体的存在并不影响成骨活性，并认为体液免疫在一定范围内并不导致移植排斥及新骨形成。但Nilsson在狗颅骨缺损BMP植入实验中发现，初次植入BMP骨愈合88％～100％，而二次植入时骨缺损仅有56％～71％愈合。二次植入BMP时，在血清中检测到高滴度抗BMP抗体。这说明BMP二次植入时宿主体内高水平BMP特异性抗体阻碍了BMP的诱导成骨作用。目前认为，细胞免疫对异种骨移植时骨诱导

的影响较大。Urist将异种动物的脱钙骨基质埋入大鼠肌间隙，术后组织学检查发现异种骨基质周围有大量淋巴细胞浸润，多核吞噬细胞堆积，周围仅有少量软骨细胞分化而无骨组织生成。Sampath也曾做过相似的实验，将牛、猴和人的BMG植入小鼠皮下，发现植入区出现明显的排斥反应，局部有大量炎性细胞浸润，诱导成骨作用很小。有学者进一步研究发现，小鼠体内新鲜异种骨移植无骨软骨生成，而见纤维组织和淋巴细胞浸润，外周血及脾内T细胞总数及其亚群数目均明显升高，术后14d为著，以活化T细胞阳性率最高。这些研究表明，异种骨移植免疫排斥反应妨碍了成骨诱导物质充分发挥作用；排斥反应越强，新骨形成就越少。然而，免疫排斥反应究竟通过何种途径干扰骨的诱导形成，至今尚不十分清楚


四、骨库(Bone Bank)

骨库的建立，是将事先采集、贮存并经过处理的同种骨甚至异种骨用于治疗，为临床使用安全有效的骨移植材料提供了促证。骨移植广泛应用于临床，是自50年代骨库建立之后开始的。1942年古巴医生Inclan首先提出骨库的概念。1950年美军总结第二次世界大战战伤救治经验，在马里兰州建立了美国海军组织库，采用深低温冷冻或冻干法保存同种异体移植物。以后麻省总医院和迈阿密大学也相继建立了大型骨库。随着供骨来源的增加和贮骨方法的改进，骨库在世界上逐渐普及，加拿大、苏联、英国、法国、波兰、捷克斯洛伐克、日本等国均建有规模不同的骨库，所贮存的都是同种异体骨。

(一)骨库的类型以美国为例，目前有三种类型的骨库。

临时性骨库(casual bone bank)：基层医院为满足自身需要而设，用普通冰箱贮存移植骨。

大医疗中心骨库(institutional bone bank)：为大医疗中心所建，除本单位外还向其它医院提供库骨，一般采用深低温冷冻法贮存。

地区性组织库(large regional tissue
bank)：作为全国性机构向一个大地区提供移植组织(包括骨组织)，一般隶属大医院、科研机构和高等院校，采用多种方法贮骨。

国外的地区性组织库正朝着协作和建立服务网络方向发展，有的已形成三级骨库网络，国内少数医院已建立一定规模的骨库，但尚处于起步阶段。目前世界各地骨库均贮存同种异体骨，同种异体骨应用广泛，但有引起交叉感染如乙肝和艾滋病的危险。美国红十字会器官移植部1990年调查12家骨库，检测1944个标本，不合格率竟高达30%。

供骨的来源及选择供骨标准:

库骨主要来源于尸体骨，然而骨的获取亦如其它组织(肾脏、角膜等)，须经供者本人生前

同意，或得到死者亲属认可，或死亡后无家属认领方可进行。供骨的另一来源为无菌手术中切除者，如胸腔手术开胸时切除的肋骨，人工髋关节置换术切除的股骨头和股骨颈，外伤性截肢后的骨骼及无禁忌证的死婴骨等。

在获取骨组织和进行移植之前，必须获悉供者的有关病史及死因，并通过实验室检查等对供者进行评价，以排除潜在的严重传染性疾病或移植骨局部感染等。目前许多组织库对选择供体规定的标准为：①供者无急慢性感染或恶性肿瘤；②血清学检查、细菌学检查、艾滋病、肝炎等病毒及其它性病检测合格；③无长期或大剂量使用类固醇、胰岛素、生长激素或麻醉药品史；④供者最佳年龄为15～45岁；⑤采骨应在死后12h内(冷冻保存者在24h内)进行。

采骨: 尸体骨取骨术

在清洁条件而不是无菌条件下进行，所采骨须用化学灭菌剂或γ线行二期灭菌；如能在严格无菌条件下进行，则可免去二期处理，或仅用温和方法处理。但无论采取何种方法，必须注意：达到无菌要求而不破坏骨的生物特性；灭菌过程中产生的毒性物质，在移植前必须予以清除。

无菌取骨宜在标准手术室中，采用无菌操作。若为多脏器组织的供者，取肾、取皮、取骨等同时进行，须多名医护人员有序协调操作，先取肾，然后从躯干背部及四肢背面取皮，再将尸体转为仰卧位取骨。上肢自喙突至腕部，股骨取外侧入路，胫骨取前入路，最后取骨盆，因有伤及内脏导致感染之可能，取倾斜45°体位，供侧朝上。根据骨库库存和临床需求情况决定骨与关节的分割切取。先切取关节移植物，主要有肱骨上段半肩关节、全肘关节、股骨下段半膝关节和胫骨上段半膝关节，应保留部分或全部关节囊、侧副韧带和肌肉附丽，勿损伤关节面。然后切取骨移植物，在长骨的两端干骺交界处截骨。还可根据需要将大块骨截短劈开制成不同形状和规格的骨材。取骨时，每骨至少做一处培养；长骨干可做三处培养，分别取材于表浅部、骨髓和关节部。此外，可做心脏穿刺取血，导尿取残存尿液，送培养及检验。摘取腹股沟淋巴结置于Hams
F-12培养基，分离和冷冻贮存淋巴细胞，进行免疫学检测。

采骨后彻底刮除肌肉及骨膜等软组织，但靠近关节软骨之骨膜应保留宽套箍状之一圈；保留主要韧带、肌腱和关节囊，以便在肢体重建时增加骨关节的稳定性。为降低组织排斥反应，应彻底冲净骨髓组织，但不宜削刮髓腔。骨表面喷撒抗生素液，置于聚乙烯塑料袋内，用无菌敷料单三重包扎，贮于4℃冰箱18～24h，再移至-80℃深低温冰箱或用冻干法

贮存。

骨软骨移植物(半关节)的保存：冷冻前将长骨之关节端浸于含15%甘油或10%二甲亚砜(DMSO)之细胞培养基内30～40min，以提高软骨细胞生存率。施行两阶段冷冻，即以1℃～2℃/min之速度降温至-20℃，然后快速冷冻至-80℃。

(四)贮骨及灭菌方法

1.冷冻法：普通冻箱(2℃～-30℃)，由于冰晶在-50℃左右出现速度很快，导致骨质结构的机械性损伤；在此温度下骨内一些酶仍有活性，可最终破坏骨组织，故贮存期一般不得超过6个月。深低温冰箱(-80℃)：温度降至-80℃，酶对骨的破坏最小，胶原酶处于静止状态，贮存期可以达数年；此法耗资少。液氮冷冻保存(-196℃)：以每分种0.50℃～2.00℃的速度先降至-40℃～-60℃，然后迅速置气相液氮致冷达-100℃，再移至液相氮中冷冻贮存。

2.
冻干法：取材后立即在-70℃～-80℃下低温冷冻，然后置于真空容器(10Pa)升华脱水，直至残余水分为2%～5%，在真空状态下室温贮存。使用前再水化以恢复其生物学性能。冻干骨内水分减少，真空环境氧含量极低，引起组织变性的酶被抑制，故在室温下贮存可不致变性。冻干不能灭菌，要求严格无菌操作或采用其它灭菌方法。

3.
脱钙法：有全骨脱钙及表面脱钙(脱钙10%)两种。目前常用的骨碎片脱钙过程为：流水洗除骨髓后投入0.60mol/L盐酸溶液，置于20℃下24h，即可清除骨基质中的矿物质。完整骨干和皮质骨板同法脱钙，但骨皮质表面脱钙深度控制在1mm左右。脱钙骨具有明显诱导能力，易被血管化和吸收替代，但无支撑固定作用。

4. 化学制剂贮存法

(1)硫柳汞溶液(1：100)：此法能保持骨的韧性，但易引起骨矿质分解，且须2周换液一次，现已不用。

(2)酒精：先置于95%酒精1～2周，再移置75%酒精，存放4℃冰箱，定期换液。此法简便经济，灭菌可靠，但骨再生缓慢，消除免疫原性不理想。

5. 灭菌

（１）照射法：多采用60Co
γ线照射，对细菌、霉菌及病毒(乙肝、艾滋病病毒)有较好杀灭作用。也有用直线加速器进行灭菌，只是穿透力较弱。常用剂量为2～2.50Mrad。剂量过大可使植骨丧失诱导活性并降低其抗折强度。低温辐照较之在常温下照射可保存部分骨诱导活性，故建议在低温保护下辐照灭菌。

(2)环氧乙烷：用于骨和软骨组织的灭菌，安全、快速且价格较低廉。环氧乙烷纯气体效果最佳，对细菌繁殖体、芽胞和真菌均有强大杀灭作用，对多种病毒有灭活作用。业已证明，环氧乙烷浓度400～800mg/L，相对湿度30%～60%，温度25℃～40℃，作用2～5h，即能完全灭菌，对骨诱导活性