实验六 食品中志贺氏菌的检验
志贺氏菌
四、志贺氏菌检验标准操作程序11 范围本标准规定了食品中志贺氏菌（Shigella）的检验方法。
本标准适用于食品中志贺氏菌的检验。
2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2.3 厌氧培养装置：41.5 ℃ 1 ℃。
2.4 电子天平：感量0.1 g。
2.5 显微镜：10×～100×。
2.5 均质器。
2.6 振荡器。
2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。
2.8 无菌锥形瓶：容量100 mL、200 mL、2 000 mL。
2.9 无菌培养皿：直径90 mm。
2.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2.11 全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂3.1 GN增菌液：见第A.1章。
3.2 志贺氏菌增菌肉汤：见第A.2章。
3.3 麦康凯（MAC）琼脂：见第A.3章。
3.4 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）琼脂：见第A.4章。
3.5 志贺氏菌显色培养基3.6 三糖铁（TSI）琼脂：见第A.5章。
3.7 营养琼脂：见第A.6章。
、3.8 葡萄糖半固体管：见第A.7章。
3.9 葡萄糖铵培养基：见第A.8章。
3.10 尿素琼脂：见第A.9章。
3.11 β-半乳糖苷培养基：见第A.10章。
3.12 氰化钾（KCN）培养基：见第A.11章。
3.13 氨基酸脱羧酶试验培养基：见第A.12章。
3.14 糖发酵管：见第A.13章。
1顾启芳，郭云昌。
3.15 缓冲葡萄糖蛋白胨水（MR和V-P试验用）：见第A.14章。
3.16 西蒙氏柠檬酸盐琼脂：见第A.15章。
3.17 醋酸盐培养基：见第A.16章。
3.18 粘液酸培养基：见第A.17章。
3.19 蛋白胨水、靛基质试剂：见第A.18章。
3.20志贺氏菌属诊断血清。
4 检验程序志贺氏菌检验程序见图1。
志贺氏菌检验方法
03
，如实验服、口罩、手套等。
样品处理注意事项
样品采集时应保证无菌操作，避免污染。
样品应尽快送至实验室进行检验，避免长时间存 放导致细菌繁殖。
样品处理过程中应保持清洁卫生，避免交叉污染 。
检验方法选择注意事项
1
根据样品类型和检验目的选择合适的检验方法。
2
对于不同种类的志贺氏菌，应选择具有针对性的 检验方法。
断结果。
分子生物学检测法
聚合酶链式反应（PCR）
利用特异性引物扩增志贺氏菌基因片段，通过凝胶电泳检 测扩增产物，判断是否存在志贺氏菌。
基因测序
对志贺氏菌基因进行测序分析，与其他已知基因序列进行 比对，以确定志贺氏菌的种属和亚种。
生物传感器技术
利用生物传感器检测志贺氏菌的代谢产物或特异性抗原， 通过信号转换器将生物信号转化为电信号，实现快速、灵 敏的检测。
食品样品的处理
采集到的食品样品应尽快送往实验室进行检验，如果不能及时送检，应将样品低 温保存，避免样品变质和污染。
04
志贺氏菌检验的注意事项
实验室安全注意事项
01
实验室应保持清洁卫生，定期进行消毒处理，确保无菌环境。
02
实验操作应在生物安全柜中进行，避免交叉污染和意外感染。
实验人员应接受专业培训，熟悉操作规程，佩戴个人防护装备
03
志贺氏菌检验的样品采集与处 理粪便样品的采集与处理粪便样品的采集
采集粪便样品时，应确保采集到新鲜 、未被污染的粪便，并尽量多采集一 些，以增加检出率。
粪便样品的处理
采集到的粪便样品应尽快送往实验室 进行检验，如果不能及时送检，应将 样品低温保存，避免样品干燥和污染 。
水样品的采集与处理
食品沙门志贺氏菌
使用孢子储备液，在验证过的期间内，其稳定的孢子储备 液可以保存在2～8℃一直使用。
26
注意事项
➢ 黑曲霉转种操作应在超净工作台（或相当此环境）中进行， 关闭风机，靠近酒精灯操作；
➢ 每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培 养基特征和纯度无误后再继续保藏。
10
典型菌落--CHRO
菌落为紫红色
11
初筛微生 物
沙门氏菌
柠檬酸杆 菌属
变形杆菌
菌落颜色
紫色(直径约 1mm)
蓝色(直径约 1mm)
无色或被抑 制
12
注意事项
亚硫酸铋琼脂（BS）：该培养基制备过程不宜过分加热， 以免降低其选择性，应在临用时配制，超过48h不宜使用。
将已挑菌落的平板储存于2 ℃～5 ℃或室温至少保留24 h， 以备必要时复查。
➢ 各实验室应根据自身操作习惯总结出一套切实可行、 快速稳定的菌液制备标准程序。
23
操作步骤
➢ 1、接种前用1：1000新洁尔灭擦拭工作台面，然后开紫外 灯消毒30分钟。
➢ 2、自冰箱取出保存工作用菌种，室温放置20分钟，温度 平衡后才能传代。
➢ 3、实验人员进入缓冲间，换鞋、穿无菌衣、戴口罩，用1： 1000新洁尔灭溶液消毒双手，并将培养基及菌种移入阳性 菌接种室。
品污染了沙门菌后，通常没有感官性状的改变。
3
沙门氏菌检验程序
4
前增菌
目的：修复损伤的细菌细胞。 缓冲蛋白胨水(BPW) 肉汤：是基础增菌培养基，不含任
何抑制成分，有利于受损伤的沙门菌复苏。使受损伤的 沙门菌细胞恢复到稳定的生理状态。 方法：25 g（mL）样品置于盛有225 mL BPW的无菌均 质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。若样品为 液态，不需要均质，振荡混匀，直接进行培养。于36 ℃±1 ℃培养8 h～18h。
食品微生物学检验 志贺氏菌检验作业指导书
食品微生物学检验志贺氏菌检验1、范围适用于食品中志贺氏菌的检验2、设备和材料2.1恒温培养箱：36℃±1℃2.2冰箱：2℃—5℃2.3厌氧培养装置：41.5℃±1℃2.4电子天平；2.5显微镜2.6均质器；2.7无菌吸管；2.8无菌均质杯；2.9无菌培养皿，直径90mm；2.10生化鉴定试剂盒；2.11比浊管及比浊管架；3、培养基和试剂3.1志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素3.2麦康凯琼脂（MAC）3.3木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂（XLD）3.4志贺氏菌显色培养基3.5三糖铁琼脂3.6营养琼脂平面4、操作步骤4.1增菌以无菌操作取检样25g（mL），加入装有灭菌225mL志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片均质器以8000r/min~10000r/min均质，于41.5℃±1℃厌氧培养16h~20h。
4.2分离取增菌后的志贺氏菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36℃±1℃培养20h~24h，观察各个平板上生长的菌落形态，若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48h进行观察。
志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表1.表1 志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征4.3 初步生化试验(1)自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种TSI.半固体和营养琼脂斜面各一管。
置36℃±1℃培养20h～24h，分别观察结果。
(2)凡是三糖铁琼脂中斜面产碱，底层产酸（发酵葡萄糖，不发酵乳糖，蔗糖）.不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体），不产硫化氢，半固体管中无动力的菌株，挑取其5.3.1中已培养的琼脂斜面上长的菌落，进行生化试验和血清学分型。
5、生化试验(1)生化试验（生化鉴定试剂盒）a.菌悬液的制备取一支盛有2ml无菌水的试管；用接种针挑取可疑菌落至无菌水中；仔细研磨，与标准浊度管比较，制成0.5个麦氏浊度的均匀菌悬液。
食品中志贺氏菌检验
食品微生物检验技术
无色至浅粉红色， 半透明、光滑、湿 润、圆形、边缘整 齐或不齐
白色，不透明、圆形、 边缘不整齐，直径1 mm～3 mm，菌落 周围琼脂颜色变为紫 红色
操作规程
已培养的营养琼脂斜面上生 长的菌苔，进行生化试验
二、志贺氏菌检测
ß-半乳糖苷酶
尿素
选取平板上5个或5个以上可疑菌落接种TSI、葡萄糖半固 体、营养琼脂斜面，36℃1 ℃培养20h～24h，观察结果。
食品微生物检验技术
一、志贺氏菌概况
概述
志贺氏菌属（Shigella） 的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌。临 床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆 菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌 引起的细菌性痢疾最为常见。人类对痢疾杆菌有很高的易感性。在幼儿可引起急性 中毒性菌痢，死亡率甚高。
一、志贺氏菌概况
需氧或兼氧性厌氧，最适温度37℃，PH7.2-7.4； 在普通琼脂和SS平板上，能形成圆形、微凸、光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、
在中等大小的菌落； 宋氏志贺氏菌菌落较大，较不透明，粗糙而扁平，在SS平板上可迟发酵乳糖，菌落
呈玫瑰红色； 在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。
增菌：用GN增菌液使处于 濒死状态的细菌恢复活力
报告
二、志贺氏菌检测
操作规程
225ml 志贺氏 菌增菌液增菌
选择性增菌
细胞数量增殖 液体 25mL 摇匀
样品
25g 均质
固体 样品
鉴别培养基
寻找可疑典型菌落
穿刺划斜面
TSI、营养琼脂、半固体培养基
41.5±1℃
16~18h 厌氧培养
食品中志贺氏菌的检验
志贺氏菌属 于肠杆菌科志贺氏菌属 ,根据生化特 性不同将其分为四个群: A群--痢疾志贺氏菌；B群----福氏志贺氏菌 C群--鲍氏志贺氏菌；D群----宋内氏志贺氏菌 志贺氏菌属的细菌统称痢疾杆菌.临床上能引起痢疾 症状的病原微生物很多,如志贺氏菌属 、沙门氏菌属、 变形杆菌属、埃希氏菌属等，还有阿米巴原虫及病毒 等。其中以志贺氏菌属 引起的细菌性痢疾最为常见， 是细菌性痢疾的主要病原菌。通过食品和饮水传播， 引起人的疾病。人对志贺氏菌的易感性很高，人是它 的唯一宿主。所以在食物和饮用水的卫生检验时，常 以是否含有志贺氏菌作为指标。
附:志贺氏菌抗原分类
抗原构造与分型：志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原 （O）及表面抗原（K）组成。主要抗原有三种： • 型特异性抗原：型多糖抗原为菌体抗原的一种，是光滑型 菌株所含有的重要抗原。当菌株变为粗糙型时，此抗原也 常随之消失，各菌型所含的型抗原不同，可用于区别菌种 的型别。 • 群特异性抗原：为光滑型菌株的次要抗原，也是菌体抗原 的一种。特异性较低，常在数种近似的菌内出现。在福氏 菌株中，由于所含群抗原不同，可将某些菌型分为多种亚 型，如福氏菌2型，根据群抗原不同，可分成2a、2b两个 亚型。 • 表面抗原（K抗原）：在新分离的某些菌株菌体表面含有 此种抗原。不耐热，加热100℃1小时即被破坏。具有此种 抗原的菌株，可阻止菌体抗原与相应免疫血清发生凝集。
SS平板原理及照片
糖大 的肠 肠杆 杆菌 菌或 者 别 的 发 酵 乳
酸硷指示剂为中性红,配方中还有煌绿
SS平板原理及照片
氏果是 菌没沙 有门 黑氏 色菌 中。 心有 ，黑 可色 能中 是心 志。 贺如
麦康凯琼脂平板照片
溶培 液养 中基 性中 红加 水有 溶乳 液糖 结 晶 紫 水 乳糖阴性 乳糖阳性
志贺氏菌的检验
xx年xx月xx日
《志贺氏菌的检验》
CATALOGUE
目录
志贺氏菌的基本信息志贺氏菌的检验方法志贺氏菌的预防和控制志贺氏菌的流行病学特征志贺氏菌的治疗和预后
01
志贺氏菌的基本信息
志贺氏菌是一种常见的细菌，可引起人类腹泻和严重的肠道疾病。
志贺氏菌属是肠杆菌科中的一个属，包括多种血清型，其中以宋内志贺氏菌最常见。
志贺氏菌通过粪口途径传播，污染食物和水源导致人类感染。
02
志贺氏菌的检验方法
观察志贺氏菌的形态和染色特性，如杆菌、无芽胞、无鞭毛等。
细菌学检验
形态与染色
志贺氏菌需要在特定培养基上培养，如SS、HE等培养基，观察菌落生长情况及生化反应。
培养特性
用已知抗体检测志贺氏菌的抗原，如K抗原、O抗原等，用于分型。
根据细菌药敏试验结果，选用最敏感的抗生素治疗。
03
治疗原则和方法
02
01
患者应隔离在单间病房，医护人员和探视者应注意消毒和隔离措施。
隔离与消毒
给予高热量、高蛋白、易消化的食物，保证患者营养需求。
饮食调整
针对患者出现的腹泻、发热等症状，进行相应的护理和对症治疗。
症状护理
患者管理和康复
治愈率较高
志贺氏菌对抗生素敏感，经过及时治疗，大部分患者可以治愈。
志贺氏菌的简介
革兰氏阴性杆菌，无芽胞，无鞭毛，有菌毛。
需氧或兼性厌氧，不产生硫化氢。
所有血清型均能发酵乳糖，产酸产气。
志贺氏菌的生物学特性
志贺氏菌的致病性
感染后可引起急性细菌性痢疾，典型的表现包括腹泻、腹痛、发热和里急后重等。
在免疫系统受损或抗生素使用不当的情况下，志贺氏菌可引起严重的痢疾症状和并发症，包括脱水、休克和死亡。
志贺氏菌检验
该标准的起草内容主要参考了国际标准组织ISO标准 ，部分参考采用了美国 FDA、NMKL等标准
3.与现有已颁布的新版国家标准协调统一
参考了已颁布的2008版国标，在样品的前处理步骤，培养条 件的选择，文字描述等方面尽量 保持一致。
GB/T 4789.5-2003 标准不足处
1. 采用GN增菌肉汤,37℃需氧培养,4小时后大肠菌的生长速度大大超 过志贺氏菌, 检测效果较差
1 宋内氏典型菌落
XLD
志显
2 福氏典型菌落
XLD
志显
3 鲍氏典型菌落
XLD
志显
4 痢疾典型菌落
XLD
志显
5 熟肉制品中宋内的分离效果
R&F志显
XLD
6 蔬菜制品中宋内分离效果
XLD
志显
7 鲍氏在生肉中的分离效果
XLD
志显
8 熟肉制品中福氏的分离效果
志显
（四）初 步 生 化
• 选取平板上5个或5个以上可疑菌落接种TSI、葡萄糖半固体、营养琼脂斜 面，36 ℃1 ℃培养20 h～24 h， 观察结果。
A1
1, 120.
A2
149
A3
164.
A4
88，159.
A6
130
A7
121
A8
38, 23
A10
. 144
A11
29
A12
3
B群
1,2,13,16,17,19,
62,69,73,3438-51
C1
2, (50)
C2
87ab,, 96
C3
85
C4
149
C6
76
志贺氏菌检验方法
培养基
选择适合志贺氏菌生长的培养 基，如SS、EMB等选择性培
养基。
培养条件
在37℃左右的恒温环境下培 养24-48小时，观察细菌生长
情况。
菌落特征
志贺氏菌在培养基上形成的菌 落较小，表面光滑、湿润、无
色或略带黄色。
鉴定试验
通过生化试验、血清学试验等 方法对培养出的细菌进行鉴定 ，以确定是否为志贺氏菌。
05
志贺氏菌检验案例分析
案例一：某食品厂志贺氏菌污染事件调查
调查背景
调查过程
某食品厂生产的罐装饮料被检测出含有志 贺氏菌，导致产品召回和消费者健康问题 。
对食品厂的生产线、水源、原料、包装材 料等进行全面检查，同时采集相关样品进 行志贺氏菌检测。
调查结果
案例分析
发现生产线存在卫生问题，水源和原料未 受到污染，包装材料合格。最终确定是生 产线上的某个环节出现了交叉污染。
该案例表明，志贺氏菌污染可能源自食品 生产过程中的交叉污染，需要加强生产过 程中的卫生管理和监控。
案例二：某医院志贺氏菌感染病例诊断
病例背景
某医院收治了一名腹泻患者， 经检测确诊为志贺氏菌感染。
诊断结果
确诊患者感染了志贺氏菌。
诊断过程
对患者进行粪便样本采集，采 用分离培养、生化鉴定等方法 进行志贺氏菌检测。
检验结果的判定
阳性判定
在培养基上出现志贺氏菌菌落，或通过免疫学方 法检测到志贺氏菌抗原或抗体。
阴性判定
未在培养基上出现志贺氏菌菌落，且免疫学检测 结果为阴性。
可疑判定
培养基上出现不能确定是否为志贺氏菌的菌落， 需要进行进一步鉴定。
检验方法的优缺点比较
培养法
优点是灵敏度高、特异性好；缺 点是操作繁琐、耗时长，需要专 业人员操作。
食品中志贺氏菌检验
20g 0.4% 溴麝香草芬兰钠溶液16ml 乳糖12g 氯化钠5g 蔗糖12g 琼 脂20g 甲液20ml HP7.5 ❖ 制法：将蛋白胨、乳糖、水杨素、氯化钠、蔗糖、牛肉膏、胆盐等溶 解于400ml蒸馏水中作为基础液；加琼脂与600ml蒸馏水中，加热溶 解。加入甲液乙液与基础液中，校正HP,再加指示剂。并与琼脂液合 并，冷却，倾注平板，
❖ 7.镜检 从三塘铁琼脂和半固体各一管中挑取生长出来的 菌落，进行革兰氏染色，然后放在显微镜下观察。
❖ 8.结果报告
五． 注意事项
1、志贺菌在常温存活期很短。因此，当样品采集后， 应尽快进行检验。如果在24h内检验，样品可保存在 冰箱内，入欲保存较长时间，必须放在低温冰箱内。 2、迄今没有很好的曾菌培养基。目前仍然认为用GN 肉汤曾菌检查食品中和粪便中的志贺菌是有效的。
注意事项
3、增加鉴别培养基的数目，可以增加志贺菌的 阳性检出率。用于分离的鉴别培养基一般不少于 两个。中等选择性的，HE或SS琼脂平板一个； 弱选择性的。麦康凯或EMB琼脂平板一个。WS 琼脂可作为中等选择性培养基使用，FX琼脂可作 为弱选择性培养基使用。 4、动力的观察非常重要。挑取可疑菌落，除接 种一支三糖铁琼脂外，还要接种一支半固体琼脂。
实验结果
志贺菌在培养基上呈现无 色透明不发酵乳糖的菌落
志贺菌在三糖铁琼脂中底沉产酸，不 产气，斜面产碱，不产生硫化氢 无 动力在，在半固体管内沿穿刺线生长。
实验结果
纹和水珠 ❖ 对试管、玻璃棒、移液管、锥形瓶、烧杯、培养皿进行包
扎：要将报纸裁成5-10公分，成30°卷起，结尾处向上折 叠即。
志贺氏菌检验方法
血清学分型
生化鉴定
志贺氏菌属分群及分型结果 报告
XLD琼脂平板
志贺氏菌
粉红色至无色，半 透明、光滑、湿润、 圆形、边缘整齐或 不齐，直径1 mm～2 mm。
沙门氏菌
菌落呈粉红色，带或 不带黑色中心，有些 菌株可呈现大的带光 泽的黑色中心，或呈 现全部黑色的菌落； 有些菌株为黄色菌落 ，带或不带黑色中心 。
ห้องสมุดไป่ตู้抗力
志贺氏菌属在外界环境中的生存 力，对理化因素的抵抗力较其他肠道杆菌 为弱，对酸敏感 。
一般在潮湿土壤中能存活34天， 37℃水中存活20天，在粪便内（室温）存 活11天。日光直接照射30分钟，56-60℃10 分即被杀死，对高温和化学消毒剂很敏感， 1%石炭酸中15-30分钟即被杀死，对氯霉素、 磺胺类、链霉素敏感，但易产生耐药性。
麦康凯琼脂平板
无色至浅粉红色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘 整齐或不齐，直径2 mm～3 mm。
培养物中出现下述情况之一者即可弃 去：
a）在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长；
b）发酵乳糖或蔗糖的；
c）不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的； d）产气的（福氏志贺氏菌6型可产生少量气 体）；
e）产生硫化氢的；
志贺氏菌检验流程图
检样 25 g（或25 mL）样品+
GN增菌液225 mL
36 ℃±１℃，6 h～8 h
检样 25 g（或25 mL）样品+ 志
贺氏菌增菌肉汤225 mL
41.5 ℃±１℃， 16 h～20 h厌氧培养
XLD琼脂
MAC琼脂或志贺氏菌显色培养基
36 ℃±１℃，20 h～48 h
挑取可疑菌落 TSI，葡萄糖半固体， 营养琼脂斜面
志贺氏菌检测流程
志贺氏菌属检验的标准操作程序【目的】指导检验伤寒、副伤寒沙门氏菌。
【该SOP变动程序】本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。
【标本的采集】由受检者将采便用已蘸有甘油盐水的棉棒自行插入肛门内，轻轻转动，然后取出，插入带有编号的塑料试管中，交给检验科人员。
【检验程序】采便→立即划线接种SS平板→培养后挑取可疑菌落接种三糖铁斜面及半固体培养基→生化学试验→血清学试验→报告检验结果。
【操作步骤】1. 分离培养采便后立即用采便棒划线接种SS琼脂平板。
36±1℃培养18-24小时，挑取无色半透明的光滑菌落分解乳糖或迟缓分解乳糖的光滑菌落，接种三糖铁斜面及半固体，36±1℃培养18-24小时。
2. 生化学试验凡是三糖铁反应符合志贺氏菌属特征者（斜面产碱或不变色，底层产酸，H2S（—），产气（—），但福氏6型产生少量气体）、无动力、革兰氏阴性杆菌、作V-P试验，苯丙氨酸，赖氨酸，柠檬酸盐，葡萄糖铵试验。
其结果全部阴性者，作血清学试验。
3. 血清学试验挑取三糖铁斜面上的培养物，按下列顺序作玻片凝集试验：四种志贺氏——→福氏————→宋内氏————→志贺氏————→志贺氏多价血清多价血清血清 2型血清 1型血清∣ + ∣ +∣ +∣ +∣—∣↓↓↓↓∣福氏菌宋内氏菌志贺氏2型志贺氏1型↓ 1-6型某型+鲍氏 7-11型某组+：组内分型血清———→鲍氏某型血清： 12-15型全部—：加热破坏K抗原，重做凝集试验16-18型福氏菌的鉴定：凡是与福氏多价血清凝集的菌株，可先用3、4，群6，群7，三种因子血清检查，根据群因子血清反应结果，再用型因子血清检查。
福氏菌抗原成分如下。
志贺氏菌的检验
第四天、进一步的 生化试验
凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气 (福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动 力的菌株，可做进一步的生化试验和生化 分型实验。
（一）进一步生化试验
即：葡萄糖铵，西蒙氏柠檬酸盐，赖氨酸和 鸟氨酸脱羧酶，pH7.2尿素，KCN生长，以 及水杨苷和七叶苷的分解， 36℃培养。
志贺氏菌的检验
一、生物学特性 （一）形态与染色
革兰氏阴性短杆菌、无荚 膜，无芽胞，无鞭毛， 有菌毛
2~3um*0.5~0.7um
（二）培养特性
1、需氧或兼氧性厌氧，最适温度37℃，PH6。 4~7.8
2、在普通琼脂和SS平板上，能形成圆形、 微凸、光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、 在中等大小的菌落
2套
• 4、250ml量筒与500毫升广口瓶
酌情
• 7 、不锈钢汤匙1把 ，玻璃珠，杜氏小管 酌情
（一）样品处理
无菌操作称取检样25g，加入装有225mLGN增菌 液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以800010000r/min打碎1min。
（二）增菌培养
放于36℃培养6～8h。
培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微 混浊时即应中止培养。
放于36℃培养18～24h。 结果：乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福 氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力
志贺氏菌在TSI生长的结果（现象）： （1）斜面产碱仍为红色或粉红色； （2）底层产酸不产气，变黄色； （3）不产H2S，不出现黑色。
志贺氏菌在葡萄糖半固体培养基生长：沿线生 长，无动力。
（三）结果报告 综合生化试验结果判定菌型并作出报告
志贺氏菌检验方法
01 Chapter志贺氏菌的特性030201志贺氏菌的致病性引发痢疾志贺氏菌具有较强的传染性，主要通过粪-口途径传播。
传染性强耐药性增强志贺氏菌的传播途径02 Chapter鉴定通过观察细菌的形态、染色特性、生化反应等指标，对分离出的细菌进行鉴定。
分离培养通过采集患者的粪便、尿液、血液等样本进行培养，以分离出志贺氏菌。
药敏试验对分离出的志贺氏菌进行药敏试验，以确定其对抗菌药物的敏感性。
细菌培养法酶联免疫吸附试验（ELISA）免疫荧光抗体技术免疫学检测法聚合酶链式反应（PCR）通过扩增志贺氏菌的基因片段，以检测患者样本中的志贺氏菌。
基因测序对志贺氏菌的基因进行测序，以鉴定其种型和耐药性。
分子生物学检测法03 Chapter粪便样品采集食品样品采集采集对象为可疑污染食品，包括肉类、蔬菜、水果等。
采集方法为选取可疑污染食品，按照食品采样标准进行采集，并尽快送检。
食品样品是志贺氏菌检验的重要来源之一。
水质样品采集04 Chapter样品处理增菌培养样品处理与增菌培养分离培养与生化鉴定分离培养将增菌培养后的样品进行分离培养，以获得单个菌落。
生化鉴定对分离培养得到的菌落进行生化鉴定，包括糖发酵试验、柠檬酸盐利用试验、吲哚试验等，以确定是否为志贺氏菌。
血清学分型与药敏试验血清学分型药敏试验05 Chapter01020304使用无菌容器收集样品，避免容器被污染。
采集容器遵循无菌操作原则，避免样品受到外界污染。
采集方法采集足够量的样品，以便进行后续实验分析。
采集量尽量在发病初期或发病高峰期采集样品，以提高检出率。
采集时间样品采集前的注意事项实验室操作的注意事项实验室环境实验器材实验操作实验试剂检验结果的分析与解读01020304检验结果结果解读结果分析结果报告06 Chapter提高检测灵敏度的方法改进采用先进的扩增技术选择特异性更高的抗体增加样品前处理快速检测技术的研发与应用基于分子生物学技术的其他检测方法探索基于下一代测序技术的检测基于生物信息学的检测THANKS。
食品中志贺氏菌的检验
• （4）凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气 （福氏志贺氏菌6型可产生少量气体），无动力的 菌株，可以做血清学分型和进一步的生化试验。 • 即：凡是三糖铁反应符合志贺氏菌属特征者（斜 面产碱或不变色，底层产酸，H2S（-），产气（），但福氏6型产生少量气体）、无动力；在半固 体管内沿穿刺线生长的菌株，疑是志贺氏菌，可 做血清凝集试验和进一步的生化试验。
Байду номын сангаас
（二）、培养基与试剂 GN培养基 HE琼脂平板 SS琼脂培养基 三糖铁琼脂 麦康凯琼脂 氰化钾培养基 氨基酸脱羧酶试验培养基 伊红美兰琼脂（EMB) 半固体管 葡萄糖铵琼脂 尿素琼脂 西蒙氏柠檬酸盐琼脂 糖发酵管 乳糖发酵管 蛋白胨水、靛基质试剂 志贺氏菌属诊断血清
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食品中志贺氏菌的检验
GB/T 4789.5-2003
• 志贺氏菌属是无鞭毛、无芽孢的革兰氏阴 性杆菌，可引起细菌性痢疾，是一种常见 的肠道传染病菌 • 志贺氏菌在食品中的存活时间较短，在检 验时无理想的增菌方法
• （一）、设备： 培养皿 9cm 均质机 接种针、接种环 显微镜 培养箱
• • • • • • • • • • • • • • • • •
（三）操作步骤 1、增菌 以无菌操作取检样25克（毫升），加入装有225毫升GN增菌液的广口瓶内， 固体食品用均质器以8000r/min~10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨 碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃培养6h~8h。培养时 间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。 2、分离和初步生化试验 （1）取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板一个；另取一环 划线接种于麦康凯琼脂或伊红美蓝琼脂平板一个，于36℃培养18h~24h，志 贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。 （2）挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各一管。一般 应多挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培养18h~24h，分别观察结果。 （3）下述培养物可以弃去： a）在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物； b）在18h~24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物； c）不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物； d）产气的培养物； e）有动力的培养物； f）产生硫化氢的培养物。
志贺氏菌的检验
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目录
• 志贺氏菌简介 • 志贺氏菌的检验方法 • 志贺氏菌检验的实验室操作流程 • 志贺氏菌检验的质量控制 • 志贺氏菌检验的注意事项与预防措施 • 志贺氏菌检验的相关法律法规与标准
01
志贺氏菌简介
志贺氏菌的特性
01
02
03
革兰阴性杆菌
志贺氏菌是一种革兰阴性 杆菌，具有鞭毛，可运动 。
培养要求
志贺氏菌培养需保持一定的湿度和 温度，一般在37℃下培养24-48小 时。
培养结果
志贺氏菌在培养基上生长良好，形 成圆形、隆起、湿润、光滑的灰白 色菌落，具有特征性的黑色中心。
免疫学检测法
免疫学检测原理
利用抗原-抗体反应的特异性， 通过检测血清中是否存在志贺氏 菌抗体来判断是否存在志贺氏菌
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04
志贺氏菌检验的质量 控制
实验室内部质量控制
人员培训
实验室内部质量控制首先要求操作人员具备专业的知识和技能， 并接受过系统培训，确保能够正确、规范地操作。
试剂和设备
实验室应使用经权威部门认可的试剂和设备，并定期进行校准和维 护，确保检测结果的准确性。
样品处理
样品的采集、运输、储存和处理应严格按照无菌操作进行，以避免 样品污染。
增强个人卫生习惯， 如勤洗手、不喝生水 、不吃生食等。
接种疫苗，提高身体 免疫力。
注意食品卫生，避免 食品污染和交叉感染 。
针对志贺氏菌感染的应急处理措施
发现感染者及时隔离治疗，防止疾病传播。
对感染者的密切接触者进行追踪和医学观察。
对可能被污染的环境和物品进行消毒处理。
开展宣传教育，提高公众对志贺氏菌感染的认识和预防 意识。
实验六 食品中志贺氏菌的检验
实验六食品中志贺氏菌的检验一、实验目的要求1、了解食品的质量与志贺氏菌检验的意义。
2、掌握志贺氏菌的生物学特性。
3、掌握志贺氏菌检验的生化试验的操作方法和结果的判断。
4、掌握志贺氏菌属血清学试方法。
5、掌握食品中志贺氏菌检验的方法和技术。
二、原理志贺氏菌属（Shigella）的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌。
临床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。
人类对痢疾杆菌有很高的易感性。
在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。
所以在食物和饮用水的卫生检验时，常以是否含有志贺氏作为指标。
志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2-3μ m ,宽0.5-0.7μ m 。
不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，不运动，有菌毛。
志贺氏菌属的主要鉴别特征为：无鞭毛，不运动，对各种糖的利用能力较差，并且在含糖的培养基内一般不产生气体。
志贺氏菌的进一步分群分型有赖于血清学试验。
三、试剂和仪器（一）最先准备的器材规格名称数量用途1、500ml广口瓶1个稀释样品2、500ml三角瓶1个制增菌液3、250ml三角瓶6个制培养基4、18×180mm试管8支制三糖铁培养基5、13×100mm试管40支制蛋白胨水等6、1ml移液管2支7、10ml移液管 2 支8、直径为90 mm平皿12套制SS、EMB平板9、250ml量筒1支（二）应灭菌的其它器材剪刀1把不锈钢汤匙1把称量纸适量（三）应准备的培养基和试剂培养基总量所用容器1.GN 增菌液225ml/瓶1瓶500ml三角瓶2.EMB培养基100ml/瓶1瓶250ml三角瓶3.SS琼脂100ml/瓶1瓶250ml三角瓶4.三糖铁斜面6ml/支6支15×150mm试管5.葡萄糖半固体培养费基4ml/支5支13×100mm试管6.蛋白胨水2ml/支5支13×100mm试管7.5%乳糖发酵管3ml/支5支13×100mm试管8.甘露醇发酵管3ml/支5支13×100mm试管9.棉子糖发酵管3ml/支5支13×100mm试管10.甘油发酵管3ml/支5支13×100mm试管11.兔血浆3ml/支1支13×100mm试管12.多价血清和26种因子血清四、实验内容样品处理→→选择性增菌→→选择性平板分离→→生化学试验→→血清学试验鉴别→→结果报告第一天样品处理和增菌培养（一）、样品处理无菌操作称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化。
食品生物学检测,志贺氏菌检最简单的实验方法
a b c
A 群：痢疾志贺氏菌 －
a
B 群：福氏志贺氏菌 － － － － － － (＋) ＋
c
C 群：鲍氏志贺氏菌 －
a
D 群：宋内氏志贺氏菌 ＋ － － ＋ － － － ＋ ＋ d
－ － － － － －/＋ － － (＋)
—
-
-
-
-
GB 4789.5-2012
前
言
志贺氏菌检验》。
本标准代替GB/T 4789.5-2003《食品卫生微生物学检验 本标准与 GB/T 4789.5-2003 相比，主要变化如下： ——修改了标准名称； ——修改了培养基和试剂；
——修改了操作步骤中增菌部分和生化试验及附加生化试验部分； ——修改了表2； ——修改了表4。
注 1：+表示阳性；-表示阴性；d 表示有不同生化型。 注 2：在葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验三项反应中志贺氏菌一般为阴性，而不活泼的大肠埃希氏菌、A-D（碱 性-异型）菌至少有一项反应为阳性。
5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据5.3.2的初步判断结果，用5.3.1中已培 养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。 5.5 血清学鉴定 5.5.1抗原的准备 志贺氏菌属没有动力，所以没有鞭毛抗原。志贺氏菌属主要有菌体（O）抗原。菌体 O 抗原又可分为 型和群的特异性抗原。 一般采用 1.2%～1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。
注 1：一些志贺氏菌如果因为 K 抗原的存在而不出现凝集反应时，可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水做成浓菌液，100 ℃煮 沸 15 min～60 min 去除 K 抗原后再检查。 注 2：D 群志贺氏菌既可能是光滑型菌株也可能是粗糙型菌株，与其他志贺氏菌群抗原不存在交叉反应。与肠杆菌科不 同，宋内氏志贺氏菌粗糙型菌株不一定会自凝。宋内氏志贺氏菌没有 K 抗原。
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实验六食品中志贺氏菌的检验
一、实验目的要求
1、了解食品的质量与志贺氏菌检验的意义。
2、掌握志贺氏菌的生物学特性。
3、掌握志贺氏菌检验的生化试验的操作方法和结果的判断。
4、掌握志贺氏菌属血清学试方法。
5、掌握食品中志贺氏菌检验的方法和技术。
二、原理
志贺氏菌属（Shigella）的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌。
临床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。
人类对痢疾杆菌有很高的易感性。
在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。
所以在食物和饮用水的卫生检验时，常以是否含有志贺氏作为指标。
志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2-3μ m ,宽0.5-0.7μ m 。
不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，不运动，有菌毛。
志贺氏菌属的主要鉴别特征为：无鞭毛，不运动，对各种糖的利用能力较差，并且在含糖的培养基内一般不产生气体。
志贺氏菌的进一步分群分型有赖于血清学试验。
三、试剂和仪器
（一）最先准备的器材
规格名称数量用途
1、500ml广口瓶1个稀释样品
2、500ml三角瓶1个制增菌液
3、250ml三角瓶6个制培养基
4、18×180mm试管8支制三糖铁培养基
5、13×100mm试管40支制蛋白胨水等
6、1ml移液管2支
7、10ml移液管 2 支
8、直径为90 mm平皿12套制SS、EMB平板
9、250ml量筒1支
（二）应灭菌的其它器材
剪刀1把不锈钢汤匙1把称量纸适量
（三）应准备的培养基和试剂
培养基总量所用容器
1.GN 增菌液225ml/瓶1瓶500ml三角瓶
2.EMB培养基100ml/瓶1瓶250ml三角瓶
3.SS琼脂100ml/瓶1瓶250ml三角瓶
4.三糖铁斜面6ml/支6支15×150mm试管
5.葡萄糖半固体培养费基4ml/支5支13×100mm试管
6.蛋白胨水2ml/支5支13×100mm试管
7.5%乳糖发酵管3ml/支5支13×100mm试管
8.甘露醇发酵管3ml/支5支13×100mm试管
9.棉子糖发酵管3ml/支5支13×100mm试管
10.甘油发酵管3ml/支5支13×100mm试管
11.兔血浆3ml/支1支13×100mm试管
12.多价血清和26种因子血清
四、实验内容
样品处理→→选择性增菌→→选择性平板分离→→生化学试验→→血清学试验鉴别→→结果报告
第一天样品处理和增菌培养
（一）、样品处理
无菌操作称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均
质器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研
磨使其乳化。
（二）、增菌培养
放于36℃培养6～8h。
培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。
第二天接种选择性平板进行分离培养
（一）、接种选择性平板
取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦
康凯琼脂平板和EMB（伊红美蓝）琼脂平板各1个。
（二）、培养
放于36℃培养18～24h。
结果：志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落
第三天初步生化试验
（一）、接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体培养基
从SS、EMB琼脂平板、挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。
一般应多挑几个菌落，以防遗漏。
经36℃培养18～24h，分别观察结果。
（二）、培养
放于36℃培养18～24h。
结果：乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力
可以弃去的培养物：
a.在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物；
b.在18～24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物；
c.不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；
d.产气的培养物；
e.有动力的培养物；
f.产生硫化氢的培养物。
第四天、血清学分型和进一步的生化试验
凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。
（一）、血清学分型鉴定
从三糖铁琼脂上挑取培养物，做玻片凝集试验。
第1步、先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；
第2步、如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。
第3步、如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。
福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1。
可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。
第4步、4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1～15各型因子血清检查。
如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3～12型多价血清及各型因子血清检查。
表1 福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原
（二）、进一步的生化试验
已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做5%乳糖发酵、甘露醇、棉子糖、甘油的发酵、靛基质试验。
1、接种生化培养基
从三糖铁琼脂上挑取培养物上,拌种到：
5%乳糖、甘露醇、棉子糖、甘油、靛基质培养基中
2、观察试验结果
志贺氏菌属4个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。
但福氏6型的生化特性与A 群或C群相似，见表2。
表2 志贺氏菌属四个群的生化特性
（三）、结果报告：
综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告
五、思考题
1、如何提高志贺氏菌的检出率？
2、志贺氏菌在三糖铁培养基上的反应结果如何？解释这些现象？
3、志贺氏菌检验有哪5个基本步骤？
4、食品中能否允许有个别志贺氏菌存在？为什么？。