β-葡聚糖酶活力测定方法的研究进展
β-葡聚糖酶活力测定
β-葡聚糖酶活力测定方法• 1 原理•β-葡聚糖酶(EC.3.2.1.6)水解1，3（4）-β-D-葡聚糖苷键，放出还原糖基团与3，5-二硝基水杨酸(DNS试剂)发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖的含量成正比关系，在540nm测其光的吸收值，查标准曲线（以葡萄糖计），可得到还原糖的量，据此计算β-葡聚糖酶的活力。
• 2 仪器和设备• 2.1 分析天平：精度0.0001g• 2.2 恒温水浴：精度±0.2℃• 2.3 计时表• 2.4 分光光度计• 2.5 沸水浴器• 2.6 振荡混合器• 2.7 pH计: 精度0.01pH单位• 3 试剂和溶液• 3.1 0.1M乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH5.0）•溶液A:量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸溶液。
•溶液B:称取8.2g醋酸钠，溶解定容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。
•使用时以A:B =3:7的比例混合，低温冷藏备用。
• 3.2 1%的β—葡聚糖溶液的配制•准确称取0.25gβ—葡聚糖放入100ml锥形瓶中，加2ml无水乙醇摇匀到无可见颗粒。
加20ml无离子水混合15分钟，盖紧塞子在沸水中煮5分钟，放置室温自然冷却，或用自来水流水降温。
将已冷却到室温的底物溶液倾入一只25ml容量瓶中，加入2.5ml1M醋酸缓冲液（pH5.0），并用无离子水定容到25ml。
• 3.3 3,5—二硝基水杨酸（DNS）溶液•溶液A:称分析纯的NaOH 104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3,5－二硝基水杨酸。
•溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。
•将A、B溶液混合，加入1200ml水，定容5000ml，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后过滤使用。
• 3.4 0.1%苯甲酸• 0.1g苯甲酸加入大约80ml无离子水中溶解，用无离子水定容至100ml。
β-葡萄糖苷酶研究进展
ＤＯ ：０ ３ ６ ／ ．Ｓ Ｎ． ６ ２７ ８ ． ０１ ． ． １ Ｉ １ ． ９ ９ Ｊ Ｉ Ｓ １ ７ ＿９ ３ ２ ２ ０１ ０ ６
Ｉ葡 萄 糖 苷 酶 研 究 进 展 ３ 一
杨 晓 宽
（ 北科技师范学 院食 品科 技学院 ， 河 河北 秦 皇岛 ， ６Ｏ ） Ｏ Ｏ ４ ６
列， 并用定点突变的方法证明了保守序列中的２ Ｇｕ 个 ｌ 分别是酸、 碱基团和亲核基团。也有试验通过 自杀底物共价修饰
和定点突变试验证 明了这种结论 【 】 …。
２ 一 葡萄糖苷 酶的理化性质及催化 反应机制
２ １ Ｂ葡萄 糖 苷酶 的理 化 性质 ． 一
ｐ葡萄糖苷 酶有 胞内酶和胞外酶 之分 ， 生物体 内只含有胞 内 ｐ葡萄糖苷 酶 ， 有 的只含 胞外 ｐ葡 萄糖 苷酶 ， 一 有些 － 也 － 但
发现 ， 两种来源 的百 催化 反应时按 同一种机制进行 ， 孽 即在催化糖苷键 的裂解 反应时都遵循双取代反应机 制。其 反应方程
如下 ：
ｎ ｝ｓ Ｅ ｓ ｓ ｓ ＥＳ Ｅ Ｓ 。
第１ 步是酶与底物键合成米 氏复合物 Ｅ （ Ｓ 反应速率 墨 和
） 。第 ２步是酶一底物 中间体 （ －） Ｅ Ｓ 的形成（ 反应速率
耐盐 和耐热特性 ， 有更广 的应用范 围。瞿丽莉 ， 均均等 研 究 了固体发酵 法制 备 Ｂ葡 萄糖苷 酶及其 在纤维 素水解上 朱 ．
的应用 。王 冰冰 ， 夏黎 明等 研 究 了黑 曲霉 Ｂ 葡萄糖苷酶基因的克隆及其在里 氏木霉 中的表达 ， 酵试验表 明， － 发 基因表
达产物可 以在 ｃｈ 信 号肽 的引导下顺利 地 向细胞外 分泌 。发 酵 ４ ， ｂｌ ８ｈ 重组 菌株 的纤维 二糖 酶活 力可 以高达 ５ ３Ｉ ・ ． Ｕ
_葡萄糖苷酶活性测定方法的研究进展
第26卷第2期2007年3月 食品与生物技术学报Journal of Food Science and Biotechnology V o l.26 N o.2M ar. 2007 文章编号:1673-1689(2007)02-0107-08 收稿日期:2006-12-29.作者简介:李华(1959-),男,重庆梁平人,教授,博导,主要从事分子生物学及葡萄与葡萄酒方面研究.Email :putj@β-葡萄糖苷酶活性测定方法的研究进展李华, 高丽(西北农林科技大学葡萄酒学院,陕西杨凌712100)摘 要:介绍了葡萄和葡萄酒中β-葡萄糖苷酶的研究概况,理化性质、酶活测定方法,以及不同来源的酶活检测的研究概况,并且经过分析提出以对硝基苯基β-D -葡萄糖苷(pN PG )为底物检测葡萄浆果中的β-葡萄糖苷酶酶活的关键影响因素:粗酶液的制备、酶最适反应温度、最佳反应时间、缓冲液类型和pH 及最佳吸收波长。
关键词:葡萄;β-葡萄糖苷酶;活性中图分类号:Q 55文献标识码:AResearch Advance on Methods of determining β-Glucosidase ActivityLi Hua , GAO Li(Colleg e of Enolo gy ,N o rthwest Univ ersity of A g riculture &Fo restry ,Yangling 712100,China )Abstract :Aro ma is one o f the impor tant factors that determining the character and quality o f w ine.β-g lucosidase is a kind of key enzy me w hich releasing aroma precurso rs.In this manuscript ,the prog re sses of the chemical pro perties ,determination methods ,and the source o f β-g lucosidase w ere review ed.On the o ther hand ,the key facto rs that involv e in the β-gluco sidasedetermination method w ith p -Nitrophenyl -β-D -gluco py ranoside as substrate as follow :tem perature ,reactio n tim e ,buffe r type ,pH and abso rb w avelength.Key words :g rape ;β-glucosidase ;activities 典型的葡萄酒风味主要源于葡萄中的挥发性化合物,然而葡萄浆果中存在着游离态和结合态两大类呈香物质。
酶法测定大麦提取物β-葡聚糖含量研究
ｅｚ ｍｅ ５ ｍＬ） ｒ ０ ｎ ｔｅ ｒ ｉ ｔ ０ｍＬ， ｍＬ ３ Ｇ ｕ ｏｉａｅ ２Ｕ／ ｗｅｅａ ｄ ｄｉ ｎｙ （ ０Ｕ／ ｆ ；ｈ ｎ ｅ ｌ ｅ ３ ｏ ６ ｍｉ ｗｅ ｄ ｕ ｄ ０ｌ － ｌｃ ｓ ｓ（ ｍＬ） ｒ ｅ ｄ ｄ ｎ
０５ｍＬｈ ｄｏｙａｅ ｇｕ ｏｅ ｏ ｔｎ ｆ ｙ ｒｌ ａｅ ｒｍ ａ ｄ ｒ — ｌｃ ｄｓｍｐｅ ｓ ｅｅｍｉｅ ． ｙ ｒ ｌ ｔ， ｌｃ ｓ ｎｅ ｔ ｄｏｙ ｔ ｆ ｓ ｃ ｏｈ ｓ ｏ ｓ ｎ ａｄＢ ｇｕ ａ ａ ｔ ｎ ｎ ａ ｌ ｗａ ｔｒ ｎ ｄ ｄ
维普资讯
ｌ ２
粮食 与油脂
２０ 年第 ５ ０６ 期
酶法测定 大麦提取物 ｐ 一葡聚糖含量研 究
连 喜军 １鲁 晓 翔 １ 保 松 品科 学学院 ， 津 １天 天
２ 上 海 交通 大学农 业 与生物 学院 ， 海 ． 上
ｐ ｅ ｏ — ｕ ｐ ｕｒｃａ ｉ ｔ ｏ ｓｍ ａｎｌ ｅ ｎ ｏ ｏ ｎｔ ｗｉ ｉ ｏｏ ｃ ｕ ａ ｙ． ｈ ｎ ｌｓ ｌ ｈ ｉ ｃ ｄ ｍｅ ｈ ｄ ｗａ ｉ ｙ ｕｓ ｄ ｉ ｕｒｃ ｕ ｒ ｙ ｔ ｔ ｐ ｒａ ｃ ｃ Ｔｈｅｄｅｅ ｉ ａ ｉ ｈ ｓ ｒ ｔｒ ｎ ｔ ｍ ｏｎ ｍｅｈｏ ｐｐ ｉ ａ ｅ ｔ ｕ ｏ ｎ ｒ ｗａ ｓａ ｌｓ ｅ ｔｂ ｓ ｆｅ ｚ ｍ ｅｍｅ ｈ ｄ ｗｉ ｈ ｎ ｅｏｆＬｉ ｈ ｎａ ｅ ｂ ｔ ｄ ａ ｌｃ ｂｌ ｏ Ｏ ｃ ｕ ｔｙ ｓｅ ｔ ｂ ｉｈ ｄ ａ ａ ｅｏ ｎ ｙ ｔ ｏ ｔ ｃ ａ ｇ ｃ ｅ ｓ ｙ ｒ ｈ
３０ ３ ； ０ １４
２ １０ ） ０ １ １
摘 要 ：目前 国际认 可 Ｂ 一葡聚糖 含 量测 定 方 法是 酶 法 ， 法测 定 成本 高 ， 国 目前 多采 用苯 酚 一 此 我
β-葡聚糖测定方法
β-葡聚糖酶活力测定方法(NY/T911-2004)∙ 1.原理β-葡聚糖酶能将木聚糖降解成还原性糖。
还原性糖在沸水浴条件下可以与3,5-二硝基水杨酸（DNS)试剂反应显色反应。
反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比。
因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中β-葡聚糖酶的活力。
∙ 2. 操作∙ 2.1.标准葡萄糖曲线的制作2.1.1 吸取PH5.5的0.1M乙酸-乙酸钠+缓冲溶液4.0mL,加入DNS试剂5.0mL，沸水浴加热5min。
用自来水冷却至室温，用水定容至25.0mL,制成标准空白样。
2.1.2 分别吸取葡萄糖溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL和7.00mL,分别用PH5.5的0.1M醋酸缓冲溶液定容至100mL,配制成浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg、0.60mg/mL和0.70mg/mL葡萄糖标准溶液。
2.1.3 分别取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00mL（做两个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2.0mL缓冲液94.4)和5.0mLDNS试剂。
电磁振荡3s-5s,沸水浴加热5min。
然后用自来水冷却到室温，在用水定溶液至25mL。
以标准空白为对照调零，在540min处测定吸光度A值。
以葡萄糖糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。
每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线∙ 3. 酶样测定吸取10.0mLβ-葡聚糖溶液,37℃平衡20min。
吸取10.0经过适当稀释的酶液，37℃平衡10min。
∙吸取2.00mL经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入到刻度试管中，再加入5mLDNS试剂，电磁振荡3s-5s。
然后加入8.0g/lβ-葡聚糖溶液2.0ml，37℃保温30min,沸水浴加热5min。
国际标准酶法测定β葡聚糖含量的研究
粮油食品科技 第 !$ 卷 #**) 年 第 ) 期
用量继续增加， 酶解液的吸光度基本保持不变， 说明 此时 ! % 葡聚糖使用量与测定过程中酶用量已经达到 平衡， 因此 ! % 葡聚糖的使用量选为 ! " &’(。 图 - 为纤 维 素 酶 （浓 度 为 &*5 , ’(） 的加量对! % 葡聚糖的 水 解 作 用。 由 图 - 可 知， 在 选 定 的 * " !’( 纤维素酶对! 6 - " *’( 纤维素 酶 加 量 范 围 内， %葡 聚 糖的水解结果基 本 相 同， 说 明 添 加 * " !’( 的 酶 量 已 经可以将 ! " &’( 的 ! 所以 纤 维 素 % 葡聚糖彻底分解， 酶的添加量选为 * " !’(。
供。 高温" （"& 万5 6 78） 、 糖化酶 （"& 万 5 6 78） 、 ! 淀粉酶 纤维素酶 （%& 万 5 6 78） 由天津市诺奥 科 技 发 展 有 限 公司提供。 大麦 ! 葡萄糖氧化 ! 葡聚糖标准品， ! 葡聚 糖 酶， ! 酶! 过氧化 酶 试 剂 盒 （ 9:;:< ） 试 剂 盒 购 于 =>?7@ 公 司。 浓硫酸 （分 析 纯） ， 苯酚 （分 析 纯） ， 乙醇 （分 析 纯） ， 葡萄糖标准品 ! 葡聚糖试剂盒购于伊普瑞斯科技有限公司。 ! " $ # 实验方法 "$#$ " " $# $ #
葡聚糖的测定方法国外一般采用的是酶法此法具有准确性高的优点但其成本太高且测定使用药品不易购买测定时间长
粮油食品科技 第 "’ 卷 #&&, 年 第 , 期
β-葡萄糖苷酶的研究进展
β-葡萄糖苷酶的研究进展综述食品研究与开发2oo5.V oL26.No.6一葡萄糖苷酶的研究进展许晶张永忠孙艳梅东北农业大学应用化学系哈尔滨150030摘要:本文简述了B一葡萄糖苷酶的理化性质,催化反应机制,酶活性测定方法及其在食品工业中应用.关键词:B一葡萄糖苷酶;性质;反应机制;应用l83一==ISOMERESEARCHADV ANCEOFB—GLUCOSIDASEXUJingZHANGY ongzhongSUNY anmei DepartmentofAppliedChemistry,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin,150030 Abstract:Thearticlebrieflydiscussedthephysicalandchemicalproperties,thecatalyticmec hanism,methodsofenzymeactivitydeterminationof13-glucosidaseanditsapplicationinfoodindust ry.Keywords:13-glucosidase;characteristic;reactionmechanism;applicationB一葡萄糖苷酶(.beta.一Glucosidase)系统名称为B—D一葡萄糖苷葡萄糖水解酶(.beta.一D—glucosideglucohydrolase;EC3.2.1.21).1837年,被Liebig和Wohler首次在苦杏仁中发现,后被发现存在于自然界许多植物中,还存在于一些酵母,曲霉菌,木酶菌及细菌体内[1].它起初引起人们的注意是因为它参与了纤维素材料的生物转化.B一葡萄糖苷酶是纤维素酶系中的一个组分,它主要作用于B一(1,4)糖苷国家"十五"重大科技专项"农产品深加工技术与设备研究开发"项目编号:2001BA501A02B作者简介:许晶,女,1979年9月出生,理学学士;助教,在读硕士, 研究方向:食品化学专业.键,还能作用于B一(1,1),(1,2),(1,3),(1,6)糖苷键.对于低聚葡萄糖聚合度越小,它的水解能力越强[.多年来,许多学者分别从苦杏仁,葡萄,刀豆,玉米,黑樱桃,水稻,大豆中分离纯化了B一葡萄糖苷酶[.现将B一葡萄糖苷酶的理化性质,催化反应机制,酶活性测定方法及其在食品工业中应用简述如下.113一葡萄糖苷酶的理化性质1.1相对分子量B一葡萄糖苷酶的相对分子质量一般在40000-250000之间[4].不同来源的B一葡萄糖苷酶的相对分子量由于其结构和组成不同而差异很大.例如,的营养保健食品,因而博得了产地群众的青睐.胡颓子果实,根,叶药用,收敛止泻,镇咳解毒.常见临床配方:①治疗风湿性关节炎疼痛,胡颓子根100g,黄酒6OraL,猪脚250g,加水煮1时许,取汤一碗,连同猪脚一同服食.②治疗吐血,便血,咯血,月经过多,胡颓子根30-6Og,煎服.③治疗支气管哮喘,慢陛支气管炎,胡颓子叶15g,枇杷叶15g,水煎服.④治疗咳嗽,鲜胡颓子叶30g,水煎,加白糖少许服用.⑤治疗痢疾下血,用胡颓子15g,乌梅20g,水煎服.⑥治疗月经不调,血崩,用胡颓子15g,山萸肉20g,水煎服.除此之外,胡颓子的鲜花含芳香油,可作调香原料.茎皮纤维是造纸和制纤维板的原料.植株可作园林绿化树,配植于花丛或林缘,颇有特色.胡颓子树对多种有害气体抗性强,特别适于工厂污染区的绿化.胡颓子的野生资源非常丰富,耐干旱瘠薄,适应性很强,对土壤要求不严,常生于山坡疏林下或林缘灌丛的阴湿环境,也发现于向阳山坡或路旁.繁殖非常容易,结果早,加之营养价值高,特别是氨基酸,维生素C和矿质元素含量丰富,开发利用的前景非常广阔[1].参考文献:[1]刘孟军.中国野生果树[M].北京:中国农业出版社,1998[2]张福平等.粤东地区野果植物资源[J].中国野生植物资源.2003,22(3):13-16[3]中国科学院研究所.中国高等植物图鉴(1-5册及补编1—2册)[M].北京:科学出版社,1985收稿日期:2005一O1—25一==2DD5.V o1.26.J,fO.6食品研究与ic}发ServeW.M.Kengen等人研究的古细菌Pyrococcus furiosus分泌的B一葡萄糖苷酶的分子是由四个亚基构成的四聚体,其分子量在230000左右;而中国科学院微生物研究所的曾宇成等所测出的海枣曲霉的B一葡萄糖苷酶由两个亚基构成,分子量为200000左右;由Day&Withers等人从Agrobacterium 中分离出的野生性B一葡萄糖苷酶是一种二聚体,由两个分子量质量为50000的B一葡萄糖苷酶的亚基构成.有的菌株本身含有胞内和胞外B一葡萄糖苷酶,因此,有时来源于同一菌株的B一葡萄糖苷酶,是二种不同分子量酶的混合物.1.2等电点(pI),最适pH及pH稳定性大部分B一葡萄糖苷酶的pI都在酸性范围,并且变化不大,一般在3.5-5.5之间,但最适pH可以超过7.0,而且酸碱耐受性强[.如:Paavilainen等人从Alkalophilus中就分离出细胞外B一葡萄糖苷酶, 其最适pH就在6-9之间,而在pH4.0—10.2以外还具有一定的催化活性;中国台北学者李约昆(音译)等人从Flavobacteriummeningosepticum中分离出的B一葡萄糖苷酶其pI在9.0左右,最适pH是5.0E.1.3最适温度及热稳定性B一葡萄糖苷酶的最适温度在40一ll0℃之间都有分布.一般来说,来自古细菌的B一葡萄糖苷酶其热稳定性和最适温度要高于普通微生物来源的B一葡萄糖苷酶.如古细菌Pyrococcusfuriosus的B一葡萄糖苷酶其最适温度102—105oC,100℃时的半衰期为85h;而李约昆等人分离出的B一葡萄糖苷酶最适温度在50—55℃之间,在60℃下于磷酸盐缓冲液中,其活力在15min后只余1%.对于工业应用来说,酶的热稳定性越高越有利,因此,从嗜热细菌中分离出B一葡萄糖苷酶逐渐引了人们的兴趣.至于来自嗜热性微生物的B一葡萄糖苷酶为何具有如此强的耐热稳定性还未获得共识.据MichaelW.Bauer 等人对来自嗜热性和非嗜热性B一葡萄糖苷酶的分析认为,两者在相互演化过程中发生的酶修饰作用并不改变酶的活性中心,也不改变其专一性,只是将酶蛋白结构作部分调整以适应高温环境[63.2B一葡萄糖苷酶的催化反应机制2.1反应机制[]M.W.Bauer等人对分别来自嗜热菌Pyrococcus furiosus和非嗜热菌Agrobacterium的B一葡萄糖苷酶进行研究发现,两种来源的菌催化反应时按同一种机制进行,即在催化糖苷键的裂解反应时都遵循双取代反应机制.其反应方程式如下:EsEP第一步是酶与底物键合形成米氏复合物ES(反应速率K.和K一.);第二步是酶一底物中间体(E—S)的形成(反应速率K2);酶的亲核基团按酸催化机制进攻异头碳,形成共价的糖基酶中间体(E—S).在这一过程中,B一葡萄糖苷酶的活性中心可根据不同类型的底物而相应发生一定程度的结构变化,从而使B一葡萄糖苷酶可以和多种糖类底物结合,这一步决定了B一葡萄糖苷酶具有的底物专一性;第三步是中间体的水解:由水按碱催化机制对异头碳进攻,形成B一葡萄糖基产物并使酶回复其初始的质子化态.其中,糖苷基酶中间体的形成和水解过程经历了共价结构的氧碳鲼正离子过渡态.另外,B一葡萄糖苷酶在整个反应过程中其构型严格保持不变.2.2活性中心结构[]在多数B一葡萄糖苷酶中起催化作用的残基是二个谷氨基酸残基,其中,靠近N一端的谷氨酸起酸/碱作用,另一氨基酸起亲核试剂的作用.但Grabnitz等人研究发现来自Clostridiumthermoce1.1um的B一葡萄糖苷酶的活性部分在N一端的130个氨基酸区域,该区的个性特征是氨基酸序列中心基团His—Asn—Glu—Pro,存在于该区域的具有催化作用的残基是相隔35—55个氨基酸的His和Glu,其中质子化态的完全保持残基Hisl21作为质子供体与Glu166协同稳定氧碳鲼正离子.而高度保持的c一端附近的残基也许参与了酶与糖苷基底物的键合,其中在该区的一些微小差异与不同B一葡萄糖苷酶的底物特异性有关.2.3底物特异性[8]几乎所有的B一葡萄糖苷酶对底物的糖基部分结构的专一性较差,能袭解C一0糖苷键,c—S键,c—N键,C—F键等;有些对糖基部分的C和C:构形也不专一,能同时水解B一葡萄糖苷键和B一半乳糖苷糖,有些甚至c位的专一性也不高,能水解木糖.但在所有底物中,B一葡萄糖苷酶对纤维二糖的活性最强.2.4反应抑制剂[9]Kempton等人研究发现Agrobacterium13一葡萄糖苷酶的一系列有机物抑制剂都与底物和过渡态结构相似,并且所有的抑制剂直接与底物竞争.有相似的过渡态结构即意味着带有相同的正电荷和综述食品研究与拜发2oo5.V oL26.NO.6相似的半椅状结构,这些抑制剂能与酶键合得更为紧密.比如,最好的抑制剂是反应过程中有相似过渡态结构的gluconolactone和gluconopheylurethane 而不同位置正电荷(如1-dexynojirimycin)的抑制剂与酶的亲和力就相对较弱,非半椅状结构(如椅式构形的is0pr0pyl—p—D—thi0uc0pyran0side和船式构形的l,6一anhydro—p-glucopyranose)的抑制剂与酶的亲和力更弱.这些抑制剂都直接与底物有竞争作用.在无机抑制剂Ag对B一葡萄糖苷酶有强的抑制作用,Hg及4mol/L脲也有较强的抑制作用,而Cu",Pb",SDS及EDTA等常见抑制剂对该酶活力无明显影响.3B一葡萄糖苷酶活性的测定方法加]1.Bamsh和swiain法:它以水杨苷作底物,酶解产物用4一氨基安替比林作显色剂,使释放出来的水杨醇显色,再用分光光度法比色测定.2.荧光法:利用伞形酮(7一轻基香豆素)与4一甲基伞形酮具强烈荧光的特点,将它们生为无荧光的底物,以此测定.3.以对硝基苯基一p—D一葡糖苷(P—NPG)作为底物进行酶解,底物水解后释放出来的配基对硝基苯酚可直接在400~420am之间测定.4B一葡萄糖苷酶的应用B一葡萄糖苷酶能参与生物体的糖代谢["],对维持生物体的正常生理功能起着重要作用.如它在酶解纤维素时就起着至关重要的作用,它把由纤维素酶降解生成的纤维二糖和三糖转化成可发酵的葡萄糖.B一葡萄糖苷酶的生物学功能使它在生产中有着广泛的应用.4.1作为食品风味酶应用[12目前,B一葡萄糖苷酶的主要应用是在食品工业中.随着食品工业的发展,风味化学的研究也引人关注.近年来,人们着重研究水果风味物质在水果中存在的前体,包括一些二级代谢产物,如糖苷类物质.这一研究领域在风味研究中被认为"前体分析".法国的Cordonnier等人1974年首次提出葡萄中可能存在键合态的不挥发的萜烯类化合物.80年代澳大利亚的Williams等人对葡萄做了比较深人细致的工作,发现葡萄中的一些风味物质如萜烯醇和芳香醇等不但以游离的形式存在,而且还以糖苷键合态的形式存在,并指出,糖苷键合态化合物的含量大大超过其游离态的含量.Engel和Tressl等经研究指出,许多水果中含有单萜烯糖苷,C(13)降异185==I类萜糖苷,倍半萜烯糖苷以及其它的糖苷,几乎所有的天然糖苷是B一糖苷,所以可以利用B一葡萄糖苷酶水解水果中的风味前体物一糖苷,释放出挥发性糖苷配基,用以增强葡萄酒等果酒,果汁香气.因此B一葡萄糖苷酶作为水果风味增香酶最合适. Shoseyov等(1990)报道分离到一株产内切B一葡萄糖苷酶的黑曲霉,用该酶来处理玫瑰红葡萄酒及西番莲果汁,通过GC—MS分析及感官评定,结果表明:葡萄酒中的单萜,苹果醇,苯乙醛等风味物质有明显提高.J.L.Iborra等(1992)则研究了甜杏B一葡萄糖苷酶水解苦藏花素,产生藏花醛(可作食品风味添加剂)的过程.可以预见,随着研究的不断深人和发展,运用这一生物技术手段提高果制品的天然风味的研究有着广泛的应用前景.4.2在青梅脱苦中应用B一葡萄糖苷酶在青梅脱苦中也有重要作用[13].梅果中有人体所需的多种氨基酸和有机酸,但也含有大量的苦味物质,主要是苦杏仁苷.据方祖达和五德裕(1988)报道,约七分成熟的新鲜梅子含苦杏仁苷高达784ppm,若是九分成熟者约含260～270ppm,约为前者三分之一.由此可见,愈成熟的果实愈不苦,但成熟的梅子制得的果汁仍然苦涩难以接受,这就是梅子过去都没有被利用做成纯天然果汁饮料的最大原因.而B一葡萄糖苷酶却可以把苦杏仁苷分解为苯甲醛及氢氰酸和两分子葡萄糖,而使苦味大大减少.虽然分解出的氢氰酸有时可使人食后中毒,但氢氰酸可在加热过程中蒸发掉,而且据七十年代《美国农业联合会》报道,一定剂量的苯甲醛和氢氰酸混合物具有防癌效果.4.3在降解纤维素中应用B一葡萄糖苷酶的另一主要应用是用于降解纤维素[14,15].纤维素酶转化纤维成葡萄糖的过程细节和作用机理还不清楚或未有定论.一般认为由内切葡聚糖作用于微纤维的非结晶区,纤维二糖水解酶再从非还原端依次分解产生纤维二糖和三糖,后者再由B一葡萄糖苷酶水解成葡萄糖.纤维素是葡萄糖以B一1,4糖苷键结合的聚合物,为植物细胞壁的构成成分,占植物干重的1/2—1/3.全球一年间由光合作用生产的纤维素达1000亿吨,是最丰富的可再生资源.将植物纤维应用于发酵食品工业原料,对人类将是一个重大的贡献,可以使我们摆脱对谷物粮食的绝对依赖,缓和世界资源紧缺.4.4在水解大豆异黄酮中应用一,,1862oo5.V o1.26.NO.6食品研究与并发综述我国水果果皮的利用现状和前景鲍金勇赵国建杨公明1.华南农业大学食品学院广州510642;2.西北农林科技大学食品科学与工程学院杨凌712100摘要:本文简述了水果果皮的结构性质和我国水果果皮加工的现状,分析了水果果皮在利用中所存在的问题,并提出相应的解决措施.关键词:水果果皮;利用现状;展望THEUTILIZINGCURRENTSITUATIONOFCHINESEFRUITPEELANDTHEPROS PECTBAOJinyongZHAOGuojianYANGGongming1.CollegeofFoodScience,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,510642B一葡萄糖苷酶还可以用来水解大豆异黄酮,制备高活性的大豆异黄酮苷元产品[16].酶水解条件温和,多采用弱酸性的缓冲溶液,大豆异黄酮苷元不易变性,是工业上制备富含大豆异黄酮苷元产品的十分有前途的途径.不过目前高活性的大豆异黄酮糖苷水解酶还在研制阶段,也没有进行工业化.大豆自身含有的内源B一葡萄糖苷酶水解活性不强,水解效率只有22-29%[73.添加足量的高活性酶(如苦杏仁和酵母中提取B一葡萄糖苷酶[1)可使水解达到100%.4.5其它应用[1.6.2]B一葡萄糖苷酶还可应用于乳品工业来分解乳糖,与其它酶协同作用生产葡萄糖与单细胞蛋白.多酚化合物是一类较好的天然抗氧化剂,它们在植物体中主要是以糖苷的形式存在,而苷元(即游离多酚)的抗氧化活性和防癌功效比其糖苷大得多.应用B一葡萄糖苷酶催化水解这类糖苷是一类生产天然抗氧化剂的好方法.应用p一葡萄糖苷酶可以生产天然色素.如栀子蓝色素(Gardeniablue)就是以茜草科植物栀子(GardeniaJasminoidesEllis)为原料,通过p一葡萄糖苷酶的作用而产生的一种天然色素.通过基因突变改变p一葡萄糖苷酶的氨基酸序列中活性中心中的氨基酸残基,可使p一葡萄糖苷酶的催化水解作用变为催化糖苷键生成的酶.如Withers用基因突变的方法[191把Agrobacterium3-葡萄糖苷酶358位上的谷氨酸残基用一丙氨酸替代使其成为合成低聚糖的酶.参考文献:[1]李远华.B一葡萄糖苷酶的研究进展.安徽农业大学, 2002,29(4):421—425[2]DriskillL.E.;BauerM.W.;KellyR.M.BiotechnologyandBioengineering.1999,66(1),51～6o[3]孙艳梅,张永忠.大豆B一葡萄糖苷酶的提取及其酶学性质的研究.食品工业科技,2004(1)[4]MichaelW.Bauer,RobertM.Kelly.Biochemistry,1998,37: 17170～17178[5]Julieb.Kempton,StephenG.Withes.Biochemistry,1992,31: 9961—9969[6]彭喜春等.B一葡萄糖苷酶的研究现状及应用前景.江苏食品与发酵,2001(12)[7]NamehukM.N.,andWitherss.G..Biochemistry,1995,34, 16194～16202[8]YiQ.BiotechnolBioen,1998,6o(3):385-390[9]Pitsons.M..Enzyme&MicrobialTichnology,1997,210): 183—190[10]王华夫,游小青.茶叶中B一葡萄糖苷酶活性的测定.中国茶叶,1996(3):16—17[11]LiY aw—kuen.J.Chn.Chem.Soc.(Taipei),1998,269(26): 17537—17541[12]顾卫民.B一葡萄糖苷酶的特性及其在食品工业中的应用. 江苏食品与发酵,2003(1)[13]陶宁萍.苦杏仁苷酶在纯天然青梅果汁中的应用.南京农业大学硕士论文,1993[14]周晓云.酶技术.石油工业出版社,1995[15]陈驹声.酶制剂生产技术,1994[16]孙艳梅,张永忠.水解制备大豆异黄酮苷元研究进展.食品研究与开发,2002(3)[17]MatsuuraM.,ObataA.J.FoodSci.,1993.58(1),144—147[18]PandiatanN.,HettiarachchyN.JuZ…YFoodChem.and Toxicology.2000,65(3),403—407『19]22Withers,eta1.UnitedStatesPatent5716812 收稿日期:2005-03-07。
β-葡聚糖研究进展
法获得． 提取 方法的不 同会 影响到 一葡聚糖 的质量、 结构 、 分子 质量 以及其他 功能和属 性． 阐述 了口
～
应 用进 行 了概 述 ．
关键词 ： 卢一葡聚 糖 ； 提取； 结构 ； 保 健 功 能 中图分类号 ： Ｑ ９ ３ ５ 文献标识码 ： Ａ 文 章编 号 ： １ ６ ７ ２— ０ ９ ４ ６ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ５— ０ ５ １ ６— ０ ５
ｇ ｌ ｕ ｃ ａ ｎ ｉ ｎ ｆ ｏ ｏ ｄ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｔ ｓ ｗａ ｓ ａ ｌ ｓ ｏ ｄ ｉ ｓ ｃ ｕｓ ｓ ｅ ｄ．
Ｋｅ ｙ ｗｏｒ ｄｓ： 一ｇ ｌ ｕ ｃ ａ ｎ；ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ；ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｕ ｒ ｅ；ｈ ｅ ａ ｌ ｔ ｈ ｆ ｕ ｎ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ
。
ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｕ ｒ ｅ，ｍｏ ｌ ｅ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ ｗｅ ｉ ｇ ｈ ｔ ａ ｎ ｄ Ｓ Ｏ Ｄ ｏ ｎ．Ｆ ｕ ｔｈｅ ｒ ｌ ｌ ｎｏ ｒ ｅ
一
，
ｈ ｅ ａ ｌ ｔ ｈ ｉ ｍ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ａ ｎ ｄ ｕ ｔ ｉ ｌ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ３ ／
对 于 降低胆 固醇 水平 有显 著差异 ．
致 卢一 葡聚糖在结构上是 以 一（ １ —３ ） 键连接 的 纤维三糖和纤维四糖为主体 ， 并由较长 的 一（ １ —
研究表明 ， 每５ ０ ｇ 碳水化合物中的 １ ｇ 葡聚糖 可以降低 ４ 个单位的血糖指数 ， ４ ｇ 的／ ３一 葡聚 糖会显著降低正常机体的葡萄糖和胰岛素反应 ， 并 且大麦 卢～ 葡聚糖比燕麦 一 葡聚糖具有更好的调 控葡萄糖和胰岛素作用． 食用具有高含量 一 葡聚
β-葡聚糖酶
植物β－1，3－葡聚糖酶的研究进展β-1,3-葡聚糖酶参与了植物的多种生长发育过程，包括细胞分裂、小孢子发生、花粉萌发、育性、韧皮部胼胝质去除、受精、种子萌芽及植物生长调控等过程。
20世纪70年代以前，对β-1,3-葡聚糖酶的研究主要集中于它对植物本身不同发育阶段的作用，随着分子生物学技术在植物抗病基因工程中的逐步应用，β-1,3-葡聚糖酶基因的抗病研究取得了快速发展。
目前，β-1,3-葡聚糖酶基因在植物抗病基因工程研究中已被认为是最具吸引力的基因之一。
1 β-1,3-葡聚糖酶基本生物学特性和分类已知的β-1,3-葡聚糖酶均属于糖基水解酶第十七家族，其成员具有共同的氨基酸序列结构：(LIVM)一x一(LIVM-FVW)3一(STAG)-E-(ST)-G- W-P-(Srr)-X-G．(Lan等，1998)，β-1,3-葡聚糖酶分为外切酶和内切酶，目前主要研究的是内切酶。
它的分子量为32-37kD，等电点从酸性到碱性。
它的作用底物为以β-1,3-苷键连接起来的多聚糖，以随机作用方式将多聚糖分解成为糊精或寡聚糖。
各种类型的β-1,3-葡聚糖酶已从多种植物中分离出来。
根据其等电点、定位、mRNA表达模式及序列的同源性等特点可将其分为四种不同类型。
I类葡聚糖酶为碱性，主要存在于液泡中，体外具较强抑菌活性。
碱性β-1,3-葡聚糖酶通常具有1个液泡定位的羧基末端多肽(carboxyl terminal polypetide，CTPP)结构，CTPP中往往含有糖基化位点即CTPP切除信号氨基酸结构， CTPP的缺乏使得β-l,3-葡聚糖酶分泌到胞外，因此，CTPP存在与否成为β-1,3-葡聚糖酶分类的重要依据。
现已分离出三种编码I类葡聚糖酶的cDNA，它的前体蛋白含有N一端信号肽及C一端液泡导向肽序列。
在根及老叶中组成型表达．占可溶性蛋白的5％-10％，且主要分布在叶的表皮细胞层中。
受病源菌、乙烯、水杨酸、伤口、UV等因素诱导，但被auxin ／cytokine所抑制，并受发育的调节。
β-葡萄糖苷酶研究进展
β-葡萄糖苷酶研究进展β-葡萄糖苷酶研究进展1.1问题的提出及意义随着能源危机、⾷物短缺、环境污染等问题正⽇益严重地困扰着整个世界，寻找开发新能源、节省粮⾷、减少环境污染显得越来越重要。
纤维素类物质是⾃然界中存在的最廉价、最丰富的⼀类可再⽣资源。
全世界每年的植物体⽣成量⾼达100-500亿吨⼲物质，其中⼀半以上为纤维素和半纤维素[1]。
纤维素在⼀定条件下可以被⽔解成单糖，单糖可再通过微⽣物发酵⽣产各种有⽤的产品，如饲料、燃料、化⼯原料、⾷品、药品等，并且可取代⽬前的淀粉原料发酵⽣产的各种产品，以及由化⼯燃料合成⽣产的部分有机产品[2,3]。
开发⾼效转化⽊质纤维素类可再⽣资源的微⽣物技术，利⽤⼯农业废弃物等发酵⽣产⼈类急需的燃料、饲料及化⼯产品，即化⼯原料的“绿⾊化”，具有极其重要的意义和光明的发展前景。
纤维素酶是⼀类能够降解纤维素⽣成葡萄糖的酶的总称，它是⼀类复杂的复合物，称之为纤维素酶系,根据其中各酶功能的差异，可将其分为三⼤类：(1)内切β- 1，4- 葡聚糖酶(endo- β- 1, 4- glucanase，EC3.2.1.4，也称Cx 酶)，作⽤于纤维素分⼦内部的⾮结晶区或羧甲基纤维素，随机⽔解β - 1 ，4 - 糖苷键，将长链纤维分⼦截断，产⽣⼤量⼩分⼦纤维素；(2)外切β- 1，4-葡聚糖酶(exo- β- 1, 4- glucanase，EC3.2.1.91，也称C1 酶)，作⽤于纤维素线状分⼦末端，⽔解β - 1 , 4 - 糖苷键，每次从纤维素链的⾮还原端切下⼀个纤维⼆糖分⼦，可以⽔解微晶纤维素；(3)β-葡萄糖苷酶(cellobiohydrolase,EC2.1.21，简称CBH)，⽔解纤维⼆糖和短链的纤维寡糖⽣成葡萄糖[4]。
3种酶协同作⽤，完成对纤维素的降解。
1837年，Liebig 和Wohler ⾸次在苦杏仁中发现β-葡萄糖苷酶[5]。
后来研究发现，β-葡萄糖苷酶存在于植物[6]、昆⾍[7]、酵母、曲霉及细菌体内。
06β-葡聚糖酶活力的检测方法
一个β-葡聚糖酶单位相当于在规定条件(PH=4.8，40℃)下每小时释放出具有相当于1μmol葡萄糖反应力的还原性碳水化合物所需的酶量（μmol／hr）。
溶液A：0.2 mol/L Na2HP04·H20：取Na2HP04·H20 35.6g或Na2HP04·12H20 71.62g，用蒸馏水溶解后定容至1000mL。
1
W—实际参与反应的酶量，即0.5×————（注：稀释倍数定义同前）
稀释倍数
10-反应时间
60－每小时即60分钟
180－葡萄糖分子量
注：每个样品同时做的两支平行试管，其相对误差=土l0%，超过此范围，试验应重做。
批准
日期
审核
日期
编制
日期
生效日期：
待测酶液的制备：精确称取一定量“四分法”采样取得的样品约1.000g于50mL试管中，加入19mL蒸馏水于漩涡混合器中震荡至溶解，放于40℃±2℃浸泡45min，浸提过程中每15min振荡一次。浸提后取上清液作为待测酶液。
待测液用蒸馏水稀释到适当倍数，控制测定OD值在0.2—0.4之间，精确吸取此稀释液0.5mL，加入PH5.O缓冲液1.0mL（每个样品作2－3个不同浓度的梯度，每个梯度同时作两支平行试管），置50℃水浴锅预热。
取酒石酸钾钠182g，溶于500mL蒸馏水中加热，于热溶液中依次加入3.5—二硝基水杨酸6.3g，NaOH 2lg，苯酚5g，亚硫酸钠5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色试剂瓶中，室温下放置15天以后使用，使用有效期一个半月。
称取β—葡聚糖0.5g溶于蒸馏水定容于100mL容量瓶中。该溶液只能当天用当天配。。
β-葡聚糖酶活性测定
β葡聚糖是由葡萄糖单体通过β，和β，糖苷键连接而成地型葡萄糖聚合物，它主要存在于单子叶禾本科谷实中地糊粉层和胚乳细胞壁中.β葡聚糖酶属于水解酶类，能有效地降解β葡聚糖分子中地β，和β，糖苷键，使之降解为小分子.由于在饲料中，大麦地β葡聚糖含量较高，难以被单胃动物消化利用，而且对饲料中各种养分地消化利用具有明显地干扰和抑制作用，成为麦类饲料中地抗营养因子.在饲料中添加β葡聚糖酶，能有效地消除β葡聚糖地抗营养作用，促进饲料中各种养分地消化和吸收利用，增进畜禽健康.在啤酒生产中，添加β葡聚糖酶可以加快麦汁和啤酒地过滤速度、提高麦汁得率、增加可发酵糖地含量.此外，β葡聚糖酶在造纸工业、日化工业等其它许多方面也有着广泛地应用，对β葡聚糖酶地研究将越来越受到人们地重视.β葡聚糖酶活力地测定方法主要有种：还原糖测定法（分光光度法）、粘度测定法和底物染色法.其中还原糖测定法简便实用，比较准确，而且结果重复性好，是广泛使用地一种酶活测定方法.其原理是：β葡聚糖酶能将β葡聚糖降解成寡糖和单糖，其具有地还原基团在沸水浴条件下可与试剂发生显色反应，显色地深浅与还原糖量成正比，而还原糖地生成量又与反应液中β葡聚糖酶地活力成正比，因此，可以利用比色测定反应液地吸光度值来计算还原糖地生成量，从而得出β葡聚糖酶地活力.但在该测定方法地具体操作中存在一些影响酶活力测定结果地因素，本文即对还原糖法测定β葡聚糖酶活力地几个重要影响因素进行研究，并得出最佳测定条件.材料与方法菌株与培养基发酵产酶菌株黑曲霉（）菌株，由本实验室保藏.固态发酵培养基麸皮、米糠、、微量元素液、蒸馏水，值，℃灭菌.微量元素液地组成为：溶液、、·、、、蒸馏水.发酵培养条件三角瓶装培养基（干料计），接种量为每瓶孢子悬液(×)，发酵温度℃，培养.试剂与溶液β葡聚糖溶液准确称取β葡聚糖()，加入无水乙醇润湿，再加入缓冲液，同时缓慢加热直至β葡聚糖完全溶解，冷却至室温，用缓冲液定容至，底物溶液℃保存，内用完.葡萄糖标准贮备溶液( )称取烘干至恒重地无水葡萄糖，精确至，用水溶解并定容至.葡萄糖标准溶液分别吸取葡萄糖标准贮备溶液、、、、、、于容量瓶中，用水定容至，盖塞，摇匀备用.试剂称取，二硝基水杨酸，置于约水中，逐渐加入氢氧化钠，在℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸钾钠、苯酚(重蒸) 和无水亚硫酸钠，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至，过滤.贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置后使用.粗酶液地制备取固体发酵曲于三角瓶中，加入缓冲液，振荡抽提，过滤离心去除孢子后，℃保存备用.缓冲液乙酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲配制液见叶宝兴主编《生物科学基础实验》（）.标准曲线地制作方法按表规定地量，分别吸取葡萄糖标准溶液、缓冲溶液和试剂于各管中（每管做个平行样），混匀.将标准管同时置于沸水浴中，反应.取出，迅速冷却至室温，用水定容至，盖塞，混匀.在波长处测量吸光度.以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程.酶活力测定方法取支刻度具塞试管，分别加入β葡聚糖底物溶液（由值乙酸乙酸钠缓冲液配制），置℃水浴中保温.在其中一支试管中加入稀释酶样，混匀，置于℃水浴中准确反应，加入试剂至两支试管中，混匀.在另一支试管(空白管)中加入稀释酶样，同时将两支试管放入℃水浴中反应，取出置于冷水中冷却至室温，加水定容至，盖塞混匀，在处测量酶样对空白地吸光度，计算酶活力.酶活力计算标准曲线：.式中：——吸光度；——葡萄糖量()；——斜率；——截距.式中：——与μ之间地换算系数；——酶液稀释倍数；——葡萄糖分子量；——测定所取酶液量()；——反应时间（）.β葡聚糖酶活力单位定义：在测定条件下，每分钟水解β葡聚糖产生μ还原糖（以葡萄糖计）所需地酶量，定义为一个酶活力单位（）.结果与讨论最佳吸收波长地确定按照上述标准曲线地制作方法，分别测定在不同波长处地吸光度，制作标准曲线，见表、图.在分光比色测定时，波长地选择不仅需要考虑灵敏度，同时还要考虑数据地稳定性和重复性.试验测定了不同波长处地值制作标准曲线.由表、图可以看出，在相同地糖浓度时，随着波长地升高，值呈下降趋势.在波长为时，测得地值最大，灵敏度最高，但数据地稳定性较差;在波长为时，测得数据地稳定性较好，但是灵敏度偏低；在波长为时，测得地数据灵敏度较高，而且稳定性也较好.所以，最佳测定波长确定为.线性回归方程为：，.葡萄糖沸水浴显色反应时间地确定分别以种不同浓度地葡萄糖标准溶液与试剂经沸水浴显色反应发现，沸水浴时间不同对显色反应结果影响较大，如图所示，种糖浓度反应结果相似，均为在～之间，反应速度较快，值增加幅度较大；～之间，反应趋于平缓，值增加缓慢；以后，所测得地值基本保持不变，说明显色反应已经完全，因此，沸水浴显色时间确定为.酶活力测定底物浓度地确定底物浓度是决定酶解反应速度地重要因素.测定β葡聚糖酶活力时底物浓度一般配制在之间，这个浓度范围达到了酶活力测定时底物过量地要求，既可保证酶和底物地充分反应，又可降低底物中小分子低聚糖对测定结果地影响，试验选用底物浓度为.酶活力测定反应时间地确定（见图）不同种类地酶其线性反应时间地范围也不同，在酶地线性反应时间内测定地酶活力较为准确.在相同反应体系下，试验测定了酶解反应从～时产生地还原糖地量.由图可以看出，酶解产生地还原糖在前内线性关系较好，产物生成量与反应时间成正比，在～之间产物生成速率逐渐减慢，以后产物生成量几乎不再增加.因此在～时处于一级反应阶段，产物生成速度一致，是酶活力测定地最佳时间，但反应时间短产物含量低时测定酶活力，会受到粗酶液中其它水解酶作用或底物纯度等因素对酶活力测定带来地干扰，选择产物生成量在以上地时间比较好，因此应选择作为酶活力测定地反应时间.酶活力测定缓冲液种类地确定（见图）缓冲液地种类和值对酶地活性影响较大，同一种酶在不同缓冲液和不同值时测定地活性不同.只有在某种缓冲液和某种值范围内才表现出最大活性.一般认为酶分子处在最适值时，其活性基团地解离状态最易与底物结合，而处在其它值时，改变了活性基团地解离状态，酶和底物结合减弱，活性就降低.由图可知，试验测定了种不同缓冲液体系条件下地酶活，随着值地增大，种缓冲液体系测得地酶反应活性均呈现出先增加后下降地趋势，但乙酸乙酸钠缓冲液体系测得地酶活力明显高于其它两种缓冲液体系.因此，在β葡聚糖酶活力测定时应选用乙酸乙酸钠缓冲液体系.酶活力测定最佳值地确定选择乙酸乙酸钠缓冲液体系，其它反应条件不变，改变缓冲液体系值进行酶活力测定，如图所示，当值为时，测得地值最大，酶活力最高.因此，酶活力测定应在值时进行.酶活力测定反应温度地确定（见图）酶解反应时地温度对酶反应速度影响较大，当其它条件不变时，温度每改变℃，反应速度可相差以上.本文在乙酸乙酸钠缓冲液值时，测定了不同温度条件下酶解反应时地产物生成量，如图所示，随着温度地升高，测得地值呈现先升高后下降地趋势，在温度为℃时，测得地值最大，产物生成量最多，酶活力最高.因此，β葡聚糖酶活力测定应在℃下进行.结论通过以上对还原糖法β葡聚糖酶活力测定条件地研究，可以看出在进行酶活力测定时，测定波长、沸水浴显色时间、底物浓度、酶解反应时间、反应缓冲液种类以及反应值均对酶活力测定有较大影响.经试验确定β葡聚糖酶活力地最佳测定条件为：β葡聚糖底物浓度，值乙酸乙酸钠缓冲体系，酶解反应温度℃，酶解反应时间，沸水浴显色，测定波长.。
β-葡聚糖酶的研究进展及在饲料方面的应用
Ａｂ ｔ ｃ ： ｈ ｈｒｃｅ，ｔ ｃ ｒ ｆ 一 ｕ ａ ｎ ｅｃｎｔｕｉ ， ｏ ｅｏ ｔ ｎｏ 一 ｓ ａ ｔ Ｔ ｅｃ ａａｔ ｓｕ ｔ ｅｏ ￣ ｃ ｎａ ｄｔ ｏ ｓｔｔ ｎ ｍ ｄ ｆ ｃｉ ｆ ｒ ｒ ｒ ｕ ３ １ ｈ ｉ ｏ ａ ｏ ３ １
ｇ ｕ ａ ａ ｅ ｗｅｅ ｓ ｍｍａｉｅ ｅ ｐ ｐ ｒ ｌ ｃ ｓ ｒ ｕ ｎ ｒ ｄ ｉ ｔ ａ ｅ ．Ａｔ ａ ｔ ｅ ａ ｐ ｉａｉ ｎ ｉ ｅ ｄ ｔ ｅ ｓ ｄ ｉ ｃ ｉｎ ｏ ｚ ｎ ｈ ｓ ｐ ｌ ｔ ｎ ｆ ｄ ａ ｔ ｙ ｄ ｒ ｔ ｆ ｌ ｔ ｈ ｃ ｏ ｅ ｎ ｈ ｕ ｅ ｏ ｈ ｎ ｙ ｎ ｆ ｔ ｒ ｒ ｎ ｉａ ｅ ． ｔ ｅ ｅ ｚ ｍｅ ｉ ｕ ｕ ｅ ｗｅ ｅ ｉ ｄ ｃ ｔｄ
Ｌ ｕ ｌｉ Ｒｅ ｉｉ Ｗ ａ ｇ Ｒｕｍｉ Ｗ ａ ｇ Ｔｅ ｆ ｉ ｉＣｈ ｎ ｅ ｎ Ｈａｘ ａ ｎ ｉ ｎｇ ｎ ｎｇｅ
（ ｅａｔｅｔ ｆ ｏｄＥ ｇ ｅｒ ｇ Ｓ ａｄｎ ｓｔｔ ｏ ｉ ｔｎ ｕｔ ， ｉａ ５ １０ Ｄ ｐｒ ｎ ｏ ｎｉ ｅｉ ， ｈｎ ｏｇＩ ｔｕｅ ｆ ｇ ｄｓ ｙ Ｊ ｎ２ ０ ０ ） ｍ ｏＦ ｎ ｎ ｎｉ Ｌ ｈ Ｉ ｒ ｎ
一
１１ ３ ，４糖苷键 —
３ １ １－ ，３糖苷键
固 ０ ／ Ｈ
图 一１ Ｂ一葡聚 糖结 构 ２ Ｂ一葡聚 糖酶 的组成 、 用方式 作
１ 所示－ 。大麦 ｐ一 ２ Ｊ 葡聚糖约含 ７ ％Ｂ一（ ，） ０ １４ 糖苷键和 ３ ％Ｂ一（ ，） ０ １３ 糖苷键 ， 一般分为水溶
中相应糖苷键之 比为 １４ ２３ ：． ｌ 。大麦 中的 Ｂ一 Ｊ 葡聚糖在细胞壁 中是不溶 的， 而且粘度很大 ， Ｊ 在啤酒酿造过程 中会影 响麦汁过滤速度及 啤酒 的质 量 ， 在麦 类 饲料 工 业 中是 一 种抗 营 养 因子 ，
燕麦β-葡聚糖分析检测方法研究进展
艟 与 析 一 潮 分
燕 麦 Ｉ葡 聚 糖 分 析 检 测 方 法 研 究 进 展 ］ ｌ 一
邹 丽 萍 田 晶 徐 龙 权 伏 萃 翠 吴 文 忠 ， ， ， ，
（． 连 工 业 大 学 ， 宁 大 连 １６ ３ ；２ 大 连 医诺 生 物 有 限 公 司 ， 宁 大 连 １６ ０ ） １大 辽 １０４ ． 辽 】 ６０
燕 麦不 但富 含蛋 白质 、 不饱 和脂 肪酸 、 物质 以 矿 及 各 种 维 生 素 ， 且 还 含 有 非 常 丰 富 的 Ｊ葡 聚 糖 。 而 ３ 一 前 人研 究结 果表 明 ，一 Ｊ葡聚糖 具 有 降低 胆 固 生 理 功 能 ， 一 种 良 清 提 是 好 的 营 养 添 加 剂 。 目前 ， 麦 ８葡 聚 糖 已 经 引 起 了 燕 一 国 内 外 学 者 的 广 泛 关 注 和 研 究 热 潮 ｌ ， Ｊ葡 聚 １ 而 ３ 一 糖 的 分 析 检 测 方 法 在 整 个 研 究 过 程 中更 是 起 到 了 关 键 的 作 用 。本 文 较 为 详 细 地 阐 述 了 燕 麦 Ｊ葡 聚 糖 的 ３ 一 分 析 检 测 方 法 ， 括 含 量 分 析 、 对 分 子 质 量 分 析 和 包 相 结 构 分 析 ， 在 此 基 础 上 提 出 了 燕 麦 Ｇ葡 聚 糖 研 究 并 过 程 中各 阶 段 较 为 有 效 的 分 析 方 法 。
ｏ ｔ ｈｏ ｇ ｕ ａ ，ｔ ｒ ｕ ｈ ｓ ｍｍａ ｉ ｎ ｈ ｅ ｅ ｒｈ ｆ ｄ ｎ ｓｏ — ｌｃ ｎ ｉ ａ ｙｖ ｒ ｕ ｎ ｌｓｓａ ｄ ｄ ｔ ｃ ｉｎ ｍｅ ｈ ｄ ｔ ｏ ｒ ｉ ｇｔ ｅｒ ｓ ａ ｃ ｉ ｉ ｇ ｆ ｇ ｕ ａ ｏ ｔｂ ａ ｉ ｓａ ａｙ ｉ ｎ ｅ ｅ ｔ ｔ ｏ ｓａ ｍｅ ｚ ｎ ｐ ｎ ｏ ｏ ｈ
β葡聚糖研究进展
β葡聚糖研究进展-葡聚糖的研究进展程彦伟李魁赵江燕麦β－葡聚糖就是一种存在于大燕麦皮中的天然非淀粉类水溶性植物糖,其基本结构就是由D葡萄糖以β14,β1-3糖苷键连接而成的线性多糖, 这两种糖苷键的比例大致为7:3。
燕麦β－葡聚糖就是一种水溶性膳食纤维,因其具有的黏性阻碍淀粉、蛋白质等物质的消化与吸收,并可增殖消化道有益菌,所以可对人体具有一些极为有利的生理功能:具有显著的降血脂、降血糖及提高免疫能力,维持肠道微生态环境等。
另外,它还能加快确定人群的免疫细胞。
对细菌感染的反应并控制住细菌感染的位置,使感染面尽快恢复;作为化妆品的有效成分,可以提高皮肤抗过敏能力,激活免疫功能, 延缓皮肤衰老。
燕麦水溶性膳食纤维与燕麦葡聚糖,可有效降低餐后血糖浓度与胰岛素水平,降低胆固醇与预防心血管疾病、燕麦纤维食品易被人体吸收,并且因含热量很低,既有利于减肥,又适合心脏病,高血压与糖尿病患者食疗的需要。
降低胆固醇早在多年,科学家就发现bata一葡聚糖能够减少肠胃吸收脂肪酸的速率,降低人体胆固醇的合成、随着bata一葡聚糖研究的日趋成熟,学者们先后在动物及人体实验水平上进行了大量的实验,证实了bata一葡聚糖在降低胆固醇与低密度脂蛋白方面具有特异的生理功能、科学家发现bata一葡聚糖对胆固醇的影响主要在于能显著降低血浆中总胆固醇(TC)与低密度脂蛋白胆固醇(LDI一TC),而对高密度脂蛋白(HDL)与甘油三醋(TG)没有明显影响仁。
燕麦葡聚糖对高血脂人群有明显的降低胆固醇的作用。
有关燕麦葡聚糖降低胆固醇的机理目前有四种假说:①可结合胆汁酸,增加了胆汁酸的排泄,从而降低胆汁酸水平与血浆胆固醇浓度。
②可被肠道中微生物发酵而产生短链脂肪酸,可抑制肝脏中胆固醇的合成。
③可促进LDL一C分解。
④可在消化道中形成高粘度环境,阻碍消化道对脂肪,胆固醇与胆汁酸的吸收。
降血糖每天食用葡聚糖燕麦食品后,患者血糖水平可降低约50%,使用燕麦食品有显著降低血糖作用燕麦汗葡聚糖可通过降低血脂含量,改善血液流动性能,加快糖类成分在吸收利用过程中的转运速度与效率,同时对糖尿病所并发的肝肾组织病变有良好的修复作用,并且可有效降低肝糖原的分解,从而导致血糖降低。
β-葡聚糖酶活性测定(精)
β-葡聚糖酶活性测定β-葡聚糖是由葡萄糖单体通过β-1，3和β-1，4糖苷键连接而成的D型葡萄糖聚合物，它主要存在于单子叶禾本科谷实中的糊粉层和胚乳细胞壁中。
β-葡聚糖酶属于水解酶类，能有效地降解β-葡聚糖分子中的β-1，3和β-1，4糖苷键，使之降解为小分子。
由于在饲料中，大麦的β-葡聚糖含量较高，难以被单胃动物消化利用，而且对饲料中各种养分的消化利用具有明显的干扰和抑制作用，成为麦类饲料中的抗营养因子。
在饲料中添加β-葡聚糖酶，能有效地消除β-葡聚糖的抗营养作用，促进饲料中各种养分的消化和吸收利用，增进畜禽健康。
在啤酒生产中，添加β-葡聚糖酶可以加快麦汁和啤酒的过滤速度、提高麦汁得率、增加可发酵糖的含量。
此外，β-葡聚糖酶在造纸工业、日化工业等其它许多方面也有着广泛的应用，对β-葡聚糖酶的研究将越来越受到人们的重视。
β-葡聚糖酶活力的测定方法主要有3种：还原糖测定法（分光光度法）、粘度测定法和底物染色法。
其中还原糖测定法简便实用，比较准确，而且结果重复性好，是广泛使用的一种酶活测定方法。
其原理是：β-葡聚糖酶能将β-葡聚糖降解成寡糖和单糖，其具有的还原基团在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应，显色的深浅与还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比，因此，可以利用比色测定反应液的吸光度值来计算还原糖的生成量，从而得出β-葡聚糖酶的活力。
但在该测定方法的具体操作中存在一些影响酶活力测定结果的因素，本文即对还原糖法测定β-葡聚糖酶活力的几个重要影响因素进行研究，并得出最佳测定条件。
1 材料与方法1.1 菌株与培养基1.1.1 发酵产酶菌株黑曲霉（Aspergillus niger）A47菌株，由本实验室保藏。
1.1.2 固态发酵培养基麸皮70 g、米糠27 g、NH4NO3 2.95 g、微量元素液0.05 ml、蒸馏水100 ml，pH值5.0，121 ℃灭菌20 min。
β-1,3-葡聚糖酶活性的测定
β-1，3-葡聚糖酶活性的测定在植物染病或处于其他逆境条件下，可诱导细胞大量合成β-1，3-葡聚糖酶。
该酶水解昆布多糖，内切β-1，3-葡萄糖苷键，产生还原末端。
可通过测定还原糖表示酶活力。
1.仪器设备恒温水浴、分光光度计、研钵、高速冷冻离心机、透析袋等。
2.操作方法1)试剂配制①铜试剂：称取12g酒石酸钾钠（NaKC4H4O3·4H2O），24g无水碳酸钠，16g碳酸氢钠，分别溶于200ml蒸馏水中后混匀。
另称硫酸铜4g（CuSO4·5H2O）溶于200ml蒸馏水，缓缓加入并搅拌到上述混合液中。
再称取无水硫酸钠180g，溶于其中，置沸水浴20min，冷却后过滤，最后定容至1000ml备用。
此液易出现结晶，应保存在20℃以上。
②砷钼酸试剂：25g钼酸铵[（NH4）6Mo7O24·4H2O]溶于450ml蒸馏水，加入22ml浓H2SO4，充分混匀。
另称取3g砷酸氢二钠（Na2HAsO4·7H2O），溶于25ml蒸馏水后，与上述钼酸铵溶液混合，37℃保温24~48h，贮于棕色瓶备用。
2）标准还原糖测定：将500μg/ml的葡萄糖溶液准确稀释至150μg/ml，用此再稀释成数种不同浓度的葡萄糖溶液。
然后取几支干净试管，分别加入不同浓度的葡萄糖溶液0.5ml，并加0.5ml铜试剂，置沸水浴10min后，自来水冷却。
加入0.5ml砷钼酸试剂，混匀，再加入3.5ml蒸馏水，于分光光度计660nm处测定光密度，并作光密度-还原糖浓度标准曲线。
3）酶蛋白的提取和活力测定①酶蛋白的提取：将植物材料加5倍量0.05mol/L的乙酸钠缓冲液（pH5.0），充分研磨，于15000×g 离心15min后，将上清液置透析袋中，用提取液在4℃下透析过夜。
经离心取上清液，放于冰箱备用。
②酶活力的测定：取0.4ml的1mg/ml昆布多糖（Sigma公司，溶于上述乙酸缓冲液），加入0.1 ml酶液，于37℃保温15min，立即加入0.5ml铜试剂，混匀，并于100℃水浴10min，置冷水中冷却，再加入0.5ml砷钼酸试剂，呈现蓝色后加蒸馏水3.5ml，660nm处比色，对照标准曲线求出样品液中的还原糖量。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
卩•葡聚糖酶活力测定方法的研究进展
张永勤,曾凡伟
【摘要】本文综述了葡聚糖酶活力的测定方法，如黏度法、生色底物法、琼
脂糖扩散法、酶联免疫吸附分析法(ELISA)和目前使用较多的还原端基法，如
3,5--硝基水杨酸(DNS)法、Somogyi-Nelson法、二金鸡纳酸(BCA)法和最新涌现的用于微量测定的3-甲基-2-苯并唾哩酮腺(MBTH)法，并就还原端基法介绍了其具体实验手段,如试管法、罐法、微孔板法、流动注射法(FIA)。
分析了方法中存在的问题并展望了葡聚糖酶活力测定方法研究的发展趋势，如安培法和等温滴定量热法等。
【期刊名称】食品科学
【年(卷)，期】2011(032)019
【总页数】5
【关键词】葡聚糖酶；测定；DNS法；MBTH法；微孔板法；流动注射法; 试管法；罐法
葡聚糖是一类非淀粉多糖，由P-1,3和/或P-1,4糖苜键连接的D型葡聚糖聚合物，如图1所示[1],是谷物类细胞壁的主要成分之一,约占其干质量的5.5%[2],也广泛存在于褐藻、酵母、大型真菌、细菌等其他微生物的细胞壁[3] 中。
高分子质量的葡聚糖分子间及分子内的相互作用较强且不够稳定[4],因而常呈黏性。
葡聚糖酶属于水解酶类，水解「葡聚糖的卩-1,3和/或p-1,4 糖苜键，目前广泛应用于食品、植物病害防治、饲料、生物质能源、造纸、纺织、医药等行业。
如，在糖化过程中可减轻或消除高分子质量阡葡聚糖引起的过滤困难和啤酒中的凝胶沉淀,增加低分子质量卩-葡聚糖在啤酒中的含量，以。