免疫组化染色操作顺序

精心整理免疫组织化学染色原理和操作步骤

一、免疫组织化学原理

免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。

PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。

生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。

图1.免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）

SP法与ABC法相似，其不同于ABC法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行显色。与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。SP法简化了操作步骤，同时也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免疫绥化染色技术。

二、实验准备：

1.标本准备

图2.SP法原理示意

①石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理

②冰冻组织切片：由病理室常规处理

③细胞爬片：将无菌盖玻片置于六孔板中，接种细胞，待细胞生长达到60％以上后取出玻片，4%多聚甲醛固定2h。

2.试剂准备

①抗体选择

单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位，可避免单克隆抗体的缺点，但是可能出现非特异性杂交。因此，不论选择单克隆还是多克隆抗体，最好同时购买两个货号的抗体，购买抗体时一定要明确是能够做IHC的抗体，

，货号85-9043

③DAB

3.

4.

5.

10

Na242

KH2PO4 4.3g

加蒸馏水至1000ml，充分混匀贮存。

使用时用蒸馏水10倍稀释，调整pH值至7.3—7.4。

②柠檬酸抗原修复液

抗原修复使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，配方如下：

称取柠檬酸10.5g，溶于500ml蒸馏水；称取Na2HPO4·12H2O57.3g，溶于800ml蒸馏水。分别量取358ml柠檬酸溶液和642mlNa2HPO4溶液，充分混匀后调整pH值至6.0，即得2×母液，贮

存备用。

③1%盐酸酒精

浓盐酸与75%酒精按照1:99比例混合，充分混匀。

三、免疫组化操作步骤

1.组织片脱蜡水化

①将组织片依次放入3个装有二甲苯溶液的玻璃缸中浸泡，每缸15min。

②依次放入2个装有无水乙醇的玻璃缸，每缸5min。

2.

3.

4.

液，根

37℃放置20min。

⑤置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5min，更换PBS缓冲液，同法操作3次，甩干。

5.显色

①加链亲和素-辣根过氧化物酶20~50µl（试剂盒中的C液，根据组织块大小进行调整），湿盒内28℃放置5~20min，甩干。

②置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5min，更换PBS缓冲液，同法操作3次，甩干。

③滴加新鲜配制的DAB工作液100µl（以覆盖组织为宜），放置观察反应部位呈现黄褐色时

（3~5min），置装有自来水玻璃缸中涮洗3次；

6.复染

浸入苏木精溶液中复染，放置5min后，用自来水反复涮洗至水不变色，再用1%盐酸酒精分化1—2s后，自来水冲洗后，反蓝水洗2min。

7.脱水、透明和封片

①依次放入95％、95％乙醇溶液的玻璃缸中，每缸浸泡5min，取出；

②依次放入2个无水乙醇的玻璃缸中，每缸浸泡5min，取出。

8.

1.

DAB

性。

2.

）