高效液相色谱法简介
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图 六通进样阀
3、分离系统
分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。
色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛
板（滤片）、接头、螺丝等组成。色谱柱一般用
内部抛光的不锈钢制成。其内径为2～6mm，柱长 为10～50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定
相。柱温一般为室温或接近室温。
色谱柱
标准柱型： 4.6mm或 3.9mm L: 15-30cm 填料粒度：5-10m
高效液相色谱法是以液体作为流动相的色谱
法，它是利用样品中各组分在色谱柱中固定相和流 动相相间分配系数或吸附系数的差异，将各组分分 离后进行定性、定量分析。
发展历史
20世纪初，俄国植物学家茨维特提出经典液相色 谱法。
1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的 局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大 分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经 典液相色谱。
发展趋势： 填料粒度小 柱径小
装柱技术：干法：填料粒度大于20m时可用。
湿法（匀浆法）：配成悬浮液。高压泵压入 色谱柱，洗净备用
4、检测系统
检测器是HPLC仪的三大关键部件之一。其作用 是把洗脱液中组分的量转变为电信号。
要求：
灵敏度高 噪音低（即对温度、流量等外界变化不敏感） 线性范围宽 重复性好 适用范围广
梯度洗脱有两种实现方式：
一是高压梯度（内梯度），利用两台高压输液泵，将两种不同
极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合均匀后再进入色谱柱。
二是低压梯度（外梯度），通过比例调节阀，将两种不同极性
的溶剂按一定的比例抽入一台高压泵中混合，随后打入色谱柱。
高压梯度
低压梯度
2、进样系统
早期使用隔膜和停流进样器，装在色谱 柱入口处。现在大都使用六通进样阀或自动 进样器。进样装置要求：密封性好，死体积 小，重复性好，保证中心进样，进样时对色 谱系统的压力、流量影响小。
3）高压泵
输液泵应具备如下性能：①流量稳定②流量范 围宽③输出压力高，一般应能达到150～300 kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀。
高压泵按排液性质可分为：恒压型和恒流型。
注射型泵------输出精确，无脉动，需更换溶剂而中断工作。
◆恒流泵
往复型泵------造价低廉，溶剂更换方便，但存在脉动。
分类：
1）按原理可分为光学检测器（如紫外、荧光、示差折
光、蒸发光散射）、热学检测器（如吸附热）、电化学检 测器（如极谱、库仑、安培）、电学检测器（电导、介电 常数、压电石英频率）、放射性检测器（闪烁计数、电子 捕获、氦离子化）以及氢火焰离子化检测器。
高速——流速为0.1～10.0 mLeabharlann Baidu/min。 高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中
同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
第二节 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪基本装置
检测器 进样阀 色谱柱
流动相 高压泵 注入样品液
流出液
色谱处理机
高效液相色谱仪的组成
高效液相色谱法
High-Performance Liquid Chromatography，HPLC
主要内容
第一节 概述 第二节 高效液相色谱仪 第三节 高效液相色谱类型 第四节 固定相和流动相的选择 第五节 图形结果分析及其应用
第一节 概述
高效液相色谱（HPLC）也叫高压液相色
谱（high pressure liquid chromatography）、高速 液相色谱（high speed liquid chromatography）、 高分离度液相色谱（high resolution liquid chromatography）等。
1960年代末，科克兰（Kirkland）、哈伯、荷瓦 斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界 上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱 的时代。
20世纪70年代，高效液相色谱法开始广泛应用。
高效液相色谱的特点
高压——压力可达150～300 kg/cm2。色谱
柱每米降压为75 kg/cm2以上。
高效液相色谱仪一般可分为四个主要
部分：高压输液系统，进样系统，分离系
统和检测系统。此外还配有辅助装置：如
梯度淋洗，自动进样、馏分收集及数据处
理等。
1、高压输液系统
1 ） 贮 液 器 ： 1-2L 的 玻 璃 瓶 ， 配 有 溶 剂 过 滤 器 (Ni合金)，其孔很小约2 m，可防止颗粒物进
入泵内。 2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通 过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透 过膜从溶剂中除去（气泡会影响检测）。
（3）自动进样。用于大量样品的常规分析。
（4）阀进样。一般HPLC分析常用六通进样阀，其关
键部件由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成。 由于阀接头和连接管死体积的存在，柱效率低于隔膜进样 （约下降5~10%左右），但耐高压（35~40MPa），进样 量准确，重复性好（0.5%），操作方便。
（使用较多）
对流量变化敏感的检测器会有噪声
干扰，此时可连接一脉动阻尼器。
◆恒压泵--------压力恒定，但流量不恒定（现在已经较少使用）。
输液泵操作注意事项：
防止固体微粒进入泵体 流动相不应含有腐蚀性物质 防止溶剂瓶内的流动相被用完 不超过规定的最高压力 流动相一般应该先脱气
4）梯度淋洗装置：
HPLC有等强度(isocratic)和梯度(gradient)
洗脱两种方式。等度洗脱是在同一分析周期
内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，
性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个分
析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极 性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、 性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以 缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高 检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重 现性。
HPLC进样方式可分为：
（1）隔膜进样 （2）停流进样 （3）自动进样 （4）阀进样
（1）隔膜进样。使用微量注射器进样。装置简单、
死体积小。但进样量小且重现性差，常规分析使用受 到局限。
（2）停流进样。可避免在高压下进样。但在
HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新启动时往往会 出现“鬼峰”；另一缺点是保留时间不准。在以峰的 始末信号控制馏分收集的制备色谱中，效果较好。
3、分离系统
分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。
色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛
板（滤片）、接头、螺丝等组成。色谱柱一般用
内部抛光的不锈钢制成。其内径为2～6mm，柱长 为10～50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定
相。柱温一般为室温或接近室温。
色谱柱
标准柱型： 4.6mm或 3.9mm L: 15-30cm 填料粒度：5-10m
高效液相色谱法是以液体作为流动相的色谱
法，它是利用样品中各组分在色谱柱中固定相和流 动相相间分配系数或吸附系数的差异，将各组分分 离后进行定性、定量分析。
发展历史
20世纪初，俄国植物学家茨维特提出经典液相色 谱法。
1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的 局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大 分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经 典液相色谱。
发展趋势： 填料粒度小 柱径小
装柱技术：干法：填料粒度大于20m时可用。
湿法（匀浆法）：配成悬浮液。高压泵压入 色谱柱，洗净备用
4、检测系统
检测器是HPLC仪的三大关键部件之一。其作用 是把洗脱液中组分的量转变为电信号。
要求：
灵敏度高 噪音低（即对温度、流量等外界变化不敏感） 线性范围宽 重复性好 适用范围广
梯度洗脱有两种实现方式：
一是高压梯度（内梯度），利用两台高压输液泵，将两种不同
极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合均匀后再进入色谱柱。
二是低压梯度（外梯度），通过比例调节阀，将两种不同极性
的溶剂按一定的比例抽入一台高压泵中混合，随后打入色谱柱。
高压梯度
低压梯度
2、进样系统
早期使用隔膜和停流进样器，装在色谱 柱入口处。现在大都使用六通进样阀或自动 进样器。进样装置要求：密封性好，死体积 小，重复性好，保证中心进样，进样时对色 谱系统的压力、流量影响小。
3）高压泵
输液泵应具备如下性能：①流量稳定②流量范 围宽③输出压力高，一般应能达到150～300 kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀。
高压泵按排液性质可分为：恒压型和恒流型。
注射型泵------输出精确，无脉动，需更换溶剂而中断工作。
◆恒流泵
往复型泵------造价低廉，溶剂更换方便，但存在脉动。
分类：
1）按原理可分为光学检测器（如紫外、荧光、示差折
光、蒸发光散射）、热学检测器（如吸附热）、电化学检 测器（如极谱、库仑、安培）、电学检测器（电导、介电 常数、压电石英频率）、放射性检测器（闪烁计数、电子 捕获、氦离子化）以及氢火焰离子化检测器。
高速——流速为0.1～10.0 mLeabharlann Baidu/min。 高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中
同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
第二节 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪基本装置
检测器 进样阀 色谱柱
流动相 高压泵 注入样品液
流出液
色谱处理机
高效液相色谱仪的组成
高效液相色谱法
High-Performance Liquid Chromatography，HPLC
主要内容
第一节 概述 第二节 高效液相色谱仪 第三节 高效液相色谱类型 第四节 固定相和流动相的选择 第五节 图形结果分析及其应用
第一节 概述
高效液相色谱（HPLC）也叫高压液相色
谱（high pressure liquid chromatography）、高速 液相色谱（high speed liquid chromatography）、 高分离度液相色谱（high resolution liquid chromatography）等。
1960年代末，科克兰（Kirkland）、哈伯、荷瓦 斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界 上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱 的时代。
20世纪70年代，高效液相色谱法开始广泛应用。
高效液相色谱的特点
高压——压力可达150～300 kg/cm2。色谱
柱每米降压为75 kg/cm2以上。
高效液相色谱仪一般可分为四个主要
部分：高压输液系统，进样系统，分离系
统和检测系统。此外还配有辅助装置：如
梯度淋洗，自动进样、馏分收集及数据处
理等。
1、高压输液系统
1 ） 贮 液 器 ： 1-2L 的 玻 璃 瓶 ， 配 有 溶 剂 过 滤 器 (Ni合金)，其孔很小约2 m，可防止颗粒物进
入泵内。 2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通 过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透 过膜从溶剂中除去（气泡会影响检测）。
（3）自动进样。用于大量样品的常规分析。
（4）阀进样。一般HPLC分析常用六通进样阀，其关
键部件由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成。 由于阀接头和连接管死体积的存在，柱效率低于隔膜进样 （约下降5~10%左右），但耐高压（35~40MPa），进样 量准确，重复性好（0.5%），操作方便。
（使用较多）
对流量变化敏感的检测器会有噪声
干扰，此时可连接一脉动阻尼器。
◆恒压泵--------压力恒定，但流量不恒定（现在已经较少使用）。
输液泵操作注意事项：
防止固体微粒进入泵体 流动相不应含有腐蚀性物质 防止溶剂瓶内的流动相被用完 不超过规定的最高压力 流动相一般应该先脱气
4）梯度淋洗装置：
HPLC有等强度(isocratic)和梯度(gradient)
洗脱两种方式。等度洗脱是在同一分析周期
内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，
性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个分
析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极 性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、 性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以 缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高 检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重 现性。
HPLC进样方式可分为：
（1）隔膜进样 （2）停流进样 （3）自动进样 （4）阀进样
（1）隔膜进样。使用微量注射器进样。装置简单、
死体积小。但进样量小且重现性差，常规分析使用受 到局限。
（2）停流进样。可避免在高压下进样。但在
HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新启动时往往会 出现“鬼峰”；另一缺点是保留时间不准。在以峰的 始末信号控制馏分收集的制备色谱中，效果较好。