第八章 电泳分离技术(高等教学)

高级教育
9
在医院临床检验中，利用电泳技术分析血 清中的酶及同工酶，可以诊断肾病综合症、 心绞痛、肝硬化、肝癌、多发生骨髓瘤、 恶性肿瘤、乙型肝炎、慢性肝炎等疾病； 分析血色素组份，可以判定血细胞的正常 与异常
高级教育
10
一九八四年九月，美国在航天飞机上首先使用 电泳技术提炼了一种治疗糖尿病的新药----胰岛 素β细胞ห้องสมุดไป่ตู้为全世界上百万糖尿病患者带来了福 音。电泳技术在太空的应用，更使它一时身价
百倍，由于太空无重力作用，电泳液中不存在
冷热对流现象，从而不影响分离效果。被分离
的物质纯度高，成本低，如治疗血栓病的尿激
酶，在太空生产，产量可以提高四百倍，售价
可降低百分之九十，美国每年患血栓病的人有 一百多万，只此一项即可节约几亿美元。
高级教育
11
电泳分离：是利用带电粒子在电场中泳
动速度的差别进行分离的方法。
第八章 电泳分离技术
高级教育
1
本章主要内容
一、概述 二、电泳技术原理 三、电泳技术问题和对策
四、在生物技术研究上应用的电泳技 术
五、生物技术产品分离纯化上应用的 电泳技术
高级教育
2
一、概述
电泳技术是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷 酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、 琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场 的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度 进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜 的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量 (%)的方法。
高级教育
4
1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电 泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，
建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法， 并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ 球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术 方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的 诺贝尔化学奖。
高级教育
蛋白分子带电荷的基团：正电荷（氨基、亚氨
基、酰氨基）、负电荷（羧基、苯酚基、巯
基）；
基团所带电荷的性质和数量随溶液环境（如
pH和离子强度）变化。
蛋白分子在电场内迁移所受到的力（F）与
电场强度（E）及蛋白分子的净电荷成正比
关系。
高级教育
18
另一种表示方法：
μ
由上式可知：蛋白质在电场内迁移速度与它的
酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的 分辨率，开创了近代电泳的新时代。30多 年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学
和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等
生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分
析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度： 即"电泳纯"（一维电泳一条带或二维电泳 一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被
上一个点或一薄层样品溶液，然后加电场， 分子在支持介质上或支持介质中迁移。
是应用最广泛的电泳技术之一。
高级教育
14
高级教育
15
高级教育
16
按电场分：常压（<500V，适用大分 子）、高压（>500V，适用小分子） 仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式
高级教育
17
二、电泳技术原理
生物技术研究对象：主要是核酸和蛋白质
应用最普遍的是以滤纸或凝胶作为载体，故称 为纸电泳法或凝胶电泳法。
高级教育
3
电泳技术发展简史
1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电 泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正 负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中 原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗 粒向正极移动，这就是电泳现象。
1909年Michaelis首次将胶体离子在电场 中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液 在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的 电泳移动和等电点。
5
从本世纪50年代起，特别是1950年 Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分 离以后，开创了利用各种固体物质（如各 种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀 粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。
高级教育
6
1959年Raymond和Weintraub利用人工 合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯
I. 实验室中强有力的分析、鉴定和分离技 术——更大规模的制备应用。
II. 与HPLC相比在可靠性、分辨率、使用 的难易度和成本上具优势。
III. 在生物技术研究和产物分离纯化应用的 是区带电泳。
高级教育
12
电泳分类
按分离的原理区分： 区带电泳 移界电泳 等速电泳 等电聚焦
高级教育
13
区带电泳 ：是在半固相或胶状介质上加
净电荷成正比，与它的分子的半径及溶液的黏
度成反比。
高级教育
19
注意：电泳使用的缓冲液的pH值、缓冲剂的类
型、浓度及样品中的盐浓度均需要仔细选择。
原因？
低离子 溶液中，带不同电荷的蛋白分子之间会发
生相静电作用，形成大的分子团，从而影响到迁移
速度；
加大离子强度，可减少此种情况，但会提高电流，
从而产生更多的热量，温度升高会促进蛋白质分子
高级教育
22
① 电泳缓冲液的pH值（决定蛋白分子所带的净 电荷） 调pH值应在允许的范围内（pH4.5-9.5）尽可 能使各组分分子的净电荷数的差异加大。
② 选择适当的缓冲系统（缓冲液种类、浓度和 其他电解质浓度。） 这些都会影响到蛋白质所带的净电荷及蛋白 分子间的相互作用。
③ 表面活性剂的存在会影响蛋白分子间的相互 作用，同时消除了不同蛋白质分子的固有电 荷差异。
人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的 最后、最准确的手段，即"Last Check"
高级教育
7
由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术， 是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展， 己受到人们的充分重视。
高级教育
8
电泳技术的重要性
电泳技术是一种先进的检测手段，与其它 先进技术相配合，能创造出惊人的成果， 可使人们用较少代价获得最优效益。比如 它对解决当前人类所面临的食品、能源、 环境和疾病等一系列迫切问题，都有积极 作用，显示出强大的生命力。因此电泳技 术正越来越多地为人们所重视,广泛应用 于各个领域。
扩散，使电泳区带变宽，降低分辨率。
高级教育
20
应用最广泛的聚 丙烯酰胺电泳， 具有分子筛作用。
实验证明“在分 子筛范围”内蛋 白质的电泳迁移 速率（u）与蛋白 质分子量的对数 成线性关系，如 图。
高级教育
21
三、电泳技术问题和对策
影响迁移率的有3个因素：
各组分的分子净电荷数； 分子量； 电泳系统介质的有效黏滞度。 此3因素又受控于电泳条件。