离子交换层析

Effect of pH on fractionation of model proteins
考虑因素
• 需要什么样的设备? • 需要什么样的离子交换? •来自百度文库怎么操作分离过程?
离子交换的通用装备
pump P-920
A B
MIXER injection valve V1
W2 W1
columns for AIX, CIX and buffer exchange
excess positive charge
isoelectric point
balanced positive and negative charge
alkaline
excess negative charge
pH 3
R
NH+ 3
COOH
pH 10
COO COO R NH2
R
NH+ 3
-
表面电荷的性质和多少依赖于 pH
Q Sepharose™ Fast Flow SP Sepharose Fast Flow
strong anion exchanger
strong cation exchanger
DEAE Sepharose Fast Flow
CM Sepharose Fast Flow
weak anion exchanger
sample
different buffers
monitor UPC-900
pH
cond
UV
large and small fractions
fraction collection Frac-901 valve FV-903
monitor for UV, conductivity and pH
离子交换填料
交换基团
• 类型 • 密度 • 选择性 • 载量
基质
• 多孔性 • 粒度大小 • 化学性质 • 载量, 流速 • 峰宽, 流速 • 使用寿命可再生性
使用不同的填料优化层析效果
Sample: 0.4 mg conalbumin pI=6.3, 0.8 mg α-lactoglobulin pI=5.8, 1.2 mg soya bean trypsin inhibitor pI=4.5 dissolved in 2 ml start buffer. HiTrap™ DEAE Sepharose™ Fast Flow 1 ml HiTrap Q Sepharose Fast Flow 1 ml HiTrap Q XL 1 ml HiTrap ANX Sepharose 4 Fast Flow high sub 1 ml 20 mM Tris™-HCl pH 7.4 20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl pH 7.4 1 ml/min 150 cm/h Columns:
HiTrap IEX Selection Kit: conalbumin (I), a-lactoglobulin (II) and soya bean trypsin inhibitor (III)
强离子交换的优势
• 在很宽的 pH范围下都带有电荷 • 在很宽的 pH范围下电荷密度不变 • 比较快速容易地达到平衡
e.g. 25 mg HSA/mL, 300 cm/h • 与流速有关 • 也随着pH、样品、离子强度不同而变化
现代填料的要求
• 良好的机械强度，流速快 • 高载量 • 良好的可再生能力 • 不同的操作阶段使用不同颗粒大小的填料
合适 的层析条件
• pH • 添加剂 • 洗脱方式 • 流速
试管检测法确定结合缓冲液的 pH
多孔性与载量
Ion exchanger
Mini Q™ Mono Q™
Porosity
solid very high
Max load/ml
ca 5 mg ca 50 mg
填料和流速
X
机械强度好才能高流速
• 大颗粒允许较大的体积流速
颗粒大小
MiniBeads™ MonoBeads™ SOURCE™ 15 3 µm 10 µm 15 µm micro-purification polishing polishing
谢谢
欢迎访问: www.gehealthcare.com/protein-purification
BPG, FineLINE, FPLC, HiPrep, HiTrap, INdEX, MiniBeads, Mini Q, Mini S, MonoBeads, Mono Q, Mono S, PhastGel, PhastSystem, RESOURCE, Sephadex, Sepharose, SMART, SOURCE, STREAMLINE, Tricorn, UNICORN, ÄKTAexplorer and ÄKTApilot are trademarks of GE Healthcare Ltd, a General Electric Company. GE, imagination at work and GE Monogram are trademarks of General Electric Company. Coomassie is a trademark of ICl plc. All goods and services are sold subject to the terms and conditions of sale of the company within GE Healthcare which supplies them. General Electric Company reserves the right, subject to any regulatory and contractual approval, if required, to make changes in specifications and features shown herein, or discontinue the product described at any time without notice or obligation. © 2006 General Electric Company – All rights reserved. GE Healthcare Bio-Sciences AB, a General Electric Company. GE Healthcare Bio-Sciences AB, Björkgatan 30, SE-751 84 Uppsala, Sweden.
+ + +
阳离子交换基团
Carboxymethyl (CM) Sulphopropyl (SP) Methylsulphonate (S) -OCH2COO -CH2SO3
– – –
-CH2CH2CH2SO3
强离子交换和弱离子交换
strong ion exchangers: capacity is constant over a wide range of pH
Start buffer: Elution buffer: Flow rate:
Running parameters equilibration: 20 ml start buffer sample application: 2 ml wash: 5 ml start buffer elution 40 ml, linear gradient, 0–80 % elution buffer Instrumentation: ÄKTAexplorer™ 100 controlled by UNICORN™ 3.0
SOURCE 30
30 µm
intermediate steps
填料颗粒大小与分辨率
3 µm Mini S™ 10 µm Mono S™
载量类型
总离子载量
e.g. 140 - 200 µmol/mL • 并不重要
有效载量
e.g. 25 mg HSA/mL • 随着pH、样品、离子强度不同而变化
动态载量
weak cation exchanger
weak ion exchangers: capacity varies with pH
为什么选择离子交换层析?
可用于各个纯化阶段和各种规模
• 可控性 • 高选择性 • 高载量 • 浓缩的 • 高回收率
良好的可操控性
Results can be optimised via several factors
50 40 30 20 10 0
M NaCl
1
Column: Sample: System:
RESOURCE™ Q, 6 ml 2 mg crude pancreatin ÄKTAexplorer™ 100, BufferPrep
pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9
0 20 40 60 80 100 0 120 0.5
pH 对电荷性质的影响
COOH
R
NH+ 3
hydrogen gained
COO -
low pH positive charge
R
NH+ 3
high pH negative charge
hydrogen lost
R NH2
COO -
滴定曲线
+
overall charge on protein
acid
elution volume (ml)
不同的方法来配制的 “相同的” 缓冲液
pH 0.5
pH 0.5
A. B.
Citrate 20 mM, pH 4.9 Citrate 20 mM, NaCl 1 M, pH 4.9
A. B.
Citrate 20 mM, pH 4.9 A + NaCl 1 M
pH 值和缓冲能力
离子交换层析
一种广泛应用于各种纯化阶段和规模的层 析技术
什么是离子交换层析?
离子交换层析是一种根据被分离物质的分子表 面电荷性质来分离的吸附层析
通过电荷性质分离
相反电荷性质之间的作用
• 蛋白质上的电荷与填料表面的电荷相互作用，不同 的蛋白质带有电荷性质不同，与填料的作用也就不 同 • 阴离子交换和阳离子交换 • 蛋白质带有负电荷时叫做阴离子交换 • 蛋白质带有正电荷时叫做阳离子交换
在几个试管中各放 1 ml 离子交换填 料 加入不同 pH值的缓冲液 加入样品并摇匀 分析上清中目的蛋白的情况 左图中目标蛋白在pH7.5时完全吸附
结论:
6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
阴离子交换,结合缓冲液选 pH 7.5
pH
滴定曲线实验方法
滴定曲线结果
通过 scouting优化pH
mAU
通过 pH控制选择性
+
anion exchanger
charge on protein
pH 3
pH 10
cation exchanger
-
离子交换过程
平衡
阴离子交 换介质
- - + + + -+ + -+ -
离子交换过程
上样和清洗
- - -+ + -+ -+ + -+
离子交换过程
洗脱
- -- -- - -- - - -+ + - + ++ + + +- + - + - + - -+ -
AU
pH value
AU
pH value
gradient
gradient
volume
volume
To ensure a proper pH value, the sample should be dissolved in start buffer (A), critical with large volume samples Buffering ion concentrations of 20–50 mM are usually sufficient
选择性的原理
Some of the charged regions which will influence ion exchange Different proteins have different charges and different patterns of surface charge
-
离子交换过程
再生
- - ---- - -- - - ++ ++ - - -+ -+
带电荷基团
阴离子交换基团
Diethylaminoethyl (DEAE) Quaternary aminoethyl (QAE) Quaternary ammonium (Q) -OCH2CH2N H(CH2CH3)2 -OCH2CH2N (C2H5) 2CH2CHOHCH3 -CH2N (CH3)3