食品中牛磺酸的测定方法(1)

２ 食品中牛磺酸的测定方法
目前测定食品中牛磺酸的方法主要有荧光法、 氨基酸自动分析法、薄层色谱法，高效液相色谱法 （ＨＰＬＣ）、超微量测定法、酸碱滴定法及衍生化高 效液相色谱法等。衍生化方法有异硫氰酸苯酯 （ＰＩＴＣ） 柱前衍生法、ＯＰＡ （邻苯二甲醛） 柱前衍 生法、ＤＮＦＢ （２，４ － 二硝基氟苯） 柱前衍生化法、 ＯＰＡ 柱后衍生法等。
利用牛磺酸与茚三酮反应后的光密度和牛磺酸 浓度成正比这一原理来测定。 ２．１．２ 测定步骤
将样品进行处理后在氨基酸自动分析仪上检 测，由于牛磺酸与茚三酮反应后的光密度和牛磺酸 浓度成正比，将样品得到的蜂面积与标准图谱中相 对应的峰比较得出牛磺酸含量。这种方法具有较高 的精密度，但对实验仪器要求严格，样品经预处理 可防止其他氨基酸的干扰。 ２．２ 高效液相色谱法 （ＨＰＬＣ） 分析复合氨基酸中 的牛磺酸［８］
（１） 原理。牛磺酸在碱性条件下与丹磺酰氯衍 生化反应。通过测定衍生物含量来测定牛磺酸含 量。
（２） 测定步骤。样品进行预处理后，在碱性条 件下丹磺酰氯柱前衍生，通过 Ｎｏｖａ－ ＰａｋＣ１８ 柱分离， 以 ＮａＡｃ （ｐＨ 值 ７．２） ∶乙腈为 ７５∶２５ 酸缓冲液为 流动相。紫外检测器 ２９０ ｎｍ 处检测，外标法计算 结果。该方法具有前处理简单、操作简便、数据准
很早之前就已研究发现，牛磺酸具有抑制交感 神经作用、降血压作用等功能。近来还发现它具有 促进胆汁酸的分泌提高胆固醇的排泄，从而降低过 量的胆固醇；提高心肌的收缩力，增加从心脏流出 的血流量；促进肝细胞的再生，强化肝脏的解毒作 用；稳定细胞膜，促进胰岛素的分泌等效果。另 外，牛磺酸在眼睛的视网膜上也高浓度存在，作为
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Ｇｏ ｎ ｇ ｙｉ Ｔａｎ ｔ ａｏ 确等特点，且重现性良好。衍生物在水箱中可稳定 １ 星期以上，是一种比较理想易于推广的测定方 法。 ２．３．４ Ｏ ＰＡ （邻苯二甲醛） 柱前衍生法［１３］
（１） 原理。牛磺酸与 ＯＰＡ 在碱性条件下生成 具有强荧光的物质，通过测定衍生物含量来测定牛 磺酸含量。
氨基酸白动分析仪所需反应试液必须在级气中 保存；离子色谱法所用的离子柱价格昂贵，薄层扫 描仪要求质量较高的薄层板。这些方法操作比较繁 复，且仪器不普及，要求条件高，不易于测定方法 的推广应用。亦有报道应用 ＯＰＡ 柱前衍生法测定 牛磺酸，由荧光检测器检测定量，此法灵敏度高， 但测定条件要求严格，易受外界条件干扰，不易操 作。为此我们进行了牛磺酸测定方法的研究，应用 柱前衍生法测定食品中的牛磺酸，样品经衍生后， 通过反相柱分离，在紫外检测器下检测定量。本法 操作简单、灵敏度高、专一性强，且仪器比较简 单，易于推广。 ２．１ 氨基酸自动分析法［７］ ２．１．１ 原理
常用 的 吸 附 剂 有 ＣＭＣ 硅 胶 Ｇ 板 等 可 作 固 定 相，展开剂如正丁醇 － 冰醋酸 － 无水乙醇 － 水 （４∶２∶１∶１） 作流动相；用上行法作为展开方式； 显色剂用 ０．５％ 茚三酮乙醇液，在 １１０ ℃时，烘 ８ ｍｉｎ，对牛磺酸进行分析。待牛磺酸的斑点呈色后， 选择一定波长进行测试。
机体内牛磺酸主要来自对外界的摄取，部分自 由身合成。因植物类食品中牛磺酸含量低，故动物 食品是膳食中牛磺酸的主要来源，海产品中牛磺酸 含量较高。因牛磺酸分子结构中有磺酸基，因此牛 磺酸不能合成蛋白质，而在体内呈游离状态，利用 此原理将牛磺酸与其他氨基酸能进行有效分离。
测定牛磺酸除上述几种常见的方法外，还有荧 光法［２０， ２１］、紫外分光光度法［２２］、超微量测定法、酸 碱滴定法。超微量测定法一般应用于测定微量神经 组织中的牛磺酸；酸碱滴定法比较简单，但测量精 度不够，这里不作介绍。
人体内持有的牛磺酸量约为 ０．１％ ，如体质量
为 ６０ ｋｇ 的人大概含有 ６０ ｇ 的牛磺酸，在身体中主 要存在于一些常动的器官如脑、心脏等。人体内的 牛磺酸可由其他氨基酸合成而来，其含量也受营养 状态的左右。 １．２ 牛磺酸的性质特点
牛磺酸分子量较小，无抗原性，各种给药途径 均易吸收。牛磺酸是一种分子内含硫的氨基酸，也 是广泛存在动物组织中的氨基酸。牛磺酸不作为构 成蛋白质的氨基酸，它在细胞内外以游离形式单独 存在［４］。机体内的牛磺酸除一部分与胆酸结合组成 胆汁，起着促进脂类及脂活性物质消化吸收的生理 功能外，主要以原形从尿中排除，肾脏依据牛磺酸 体内含量调节其排除量，以维持体内牛磺酸含量的 相对稳定，只有极少部分可转变为羟乙磺酸由尿中 排除。牛磺酸也是一种非特异性的生长因子和凝血 因子、一种膜保护剂、一种钙离子内环境稳定调节 剂。有资料显示，牛磺酸的某些功能是由与渗透压 相关的信号通路调控的，但它还有些功能是独一无 二的，这与它的膜保护和蛋白质的磷酸化作用有 关。 １．３ 牛磺酸的生物学功能［５， ６］
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栏目主持人：刘润平 Ｇｏ ｎ ｇ ｙｉ Ｔａｎ ｔ ａｏ
食品中牛磺酸的测定方法
刘慧燕，方海田
（宁夏大学 农学院食品系，宁夏 银川 ７５００２１）
摘要：牛磺酸是一种重要的氨基酸，具有很重要的作用。作为添加剂，已广泛用于药物与食品中，具有进一步
推广使用的前景。文章介绍了目前测定食品中牛磺酸的一些主要方法，包括荧光法、氨基酸自动分析法、薄层
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Ｔｅｌ：０３５１－ ４６０６０８６ Ｅ－ ｍａｉｌ：ｎｃｐｊｇ＠１６３．ｃｏｍ 光从光容细胞向大脑传递的介质。一般来说，牛磺 酸的不足易引起高血压、动脉硬化、心脏机能减弱 以及肝功能下降等症状。 １．４ 牛磺酸的应用前景
综上所述，牛磺酸是体内的正常物质，具有广 泛的生理活性，而且尽管剂量很高也不会有明显的 副作用。对牛磺酸的生理作用及作用机制进行深入 研究，对于多种疾病的防治具有现实意义，同时也 向我们展示了开发利用牛磺酸的广阔前景。
试剂和仪器与 ＯＰＡ 柱前衍生法类似，但离子 交换柱为钠离子交换柱。 ２．４．２ 测定步骤
样品进行预处理后，在钠离子交换柱中被分 离，再与 ＯＰＡ 进行柱后衍生反应，由荧光检测器 测定量。该方法具有灵敏度高，定量淮确等优点， 但分离所需的钠离子交换柱价格昂贵，给测定方法 的推广应用带来了因难。 ２．５ 离子交换法［１４， １５］ ２．５．１ 原理
（２） 测定步骤。样品进行预处理后，按比例加 入定量的 ＯＰＡ 衍生反应试剂，在碱性条件下与样 液中的牛磺酸生成具有强荧光的物质，在开始反应 １ ｍｉｎ 后，终止反应，通过 ＯＤＳ－ Ｃ１８ 反相柱分离， 在荧光检测器下检测定量。该方法样品的前处理简 单、方便、快速。采取的色谱分离条件具有分离时 间短、分离效果好、灵敏度高等优点。这种方法重 现性良好，回收率达 ９９．８９％ 。在 １０ μｇ￣５０ μｇ 的 浓度范围内具有良好的线性，只需使用普通反相柱 就可分离，是理想的测定方法。 ２．４ ＯＰＡ 柱后衍生法［１３］ ２．４．１ 原理
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Ｇｏ ｎ ｇ ｙｉ Ｔａｎ ｔ ａｏ ２．２．１ 原理
样品中牛磺酸经水提取，用亚铁氰化钾、醋酸 锌除蛋白，乙醚脱脂，Ｓｅｐ－ ＰａｋＣ１８ 小柱 净 化 浓 缩 后，用 ＨＰＬＣ 法测定。 ２．２．２ 测定步骤
将样品提取净化后，用 ＨＰＬＣ 在 ２１０ ｎｍ 波长 下检测峰面积，外标法定量计算。本法样品净化比 较好，消除了对牛磺酸测定的干扰，对成分复杂的 样品有较好的测定效果，但其仪器价格昂贵，常规 检测仪器不够灵敏。 ２．３ 柱前衍生化法 ２．３．１ 高 效 液 相 色 谱 ＤＮＦＢ （２， ４ － 二 硝 基 氟 苯） 柱前衍生化法［９， １０］
（１） 原理。可采用国产 Ｃ１８ 反相柱，用异硫氰 酸苯酯 （ＰＩＴＣ） 柱前衍生高效液相色谱法测定复合 氨基酸中牛磺酸的含量。
（２） 测定步骤。采用甲醇流动相体系，在适宜 的色谱条件下，牛磺酸可获得较好的分离，并且在 ８ μｇ／ｍＬ￣４０ μｇ／ｍＬ 浓度范围内与峰面积成良好的 线性关系， 峰 面 积 定 量 的 相 对 标 准 偏 差 为 ０．７％ （ｎ＝５），牛磺酸的 ＰＩＴＣ 衍生物溶液室温存放 ３６ ｈ 不变质。 ２．３．３ 高效液相色谱丹磺酰氯柱前衍生法［１２］
将样品中牛磺酸经离子交换柱提纯后，以薄层 色谱法作定性、定量实验。 ２．６．２ 测定步骤
制备离子交换柱对样品进行预处理后开始测 定。制备薄层板、点样、展开、显色，根据样品 Ｒｆ 值进行定ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ，根据斑点大小及颜色深浅进行半 定量测定。该方法既能进行定性测定，又能定量测 定，操作简便，不需特殊试剂和昂贵仪器，适宜在 基层单位推广应用，但测定不是很精密。
牛磺酸 （ｔａｕｒｉｎｅ） 化学名称为 ２ － 氨基乙磺酸、 β－ 氨基乙磺酸，分子式为 Ｃ２Ｈ７ＮＯ３Ｓ，化学结构式 为 Ｈ２Ｎ－ ＣＨ２－ ＣＨ２－ ＳＯ３Ｈ，分子量为 １２５．１５ 道尔顿； 常温常压下为无色四周针状结晶，无臭，味微酸， 熔点 ３００ ℃，微溶于水，溶于乙酸，不溶于无水乙 醇、乙醚或丙酮；具有抗氧化功能，可作为润湿剂 和生化试剂。
（１） 原理。利用牛磺酸与 ＤＮＦＢ 的衍生化反应 测定牛磺酸含量。
（２） 测定步骤。称取牛磺酸制得牛磺酸对照 液，依次加入溶剂衍生、分离后进样测定；以浓度 为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，制作 标准曲线。将样品在同样步骤下测定，根据色谱峰 面积，由标准回归方程得样液中牛磺酸含量。 ＨＰＬＣ 法分析周期短，分离效率高，结果准确。该 衍生化方法步骤简单。衍生后剩余 ＤＮＦＢ 对牛磺酸 的测定无干扰，操作简便、快速、准确、重现性 好。 ２．３．２ 高效液相色谱法［１１］
通过化学合成法生产的牛磺酸，目前国内主要 采用乙醇胺脂化、磺化路线，最终反应产物为牛磺 酸和硫酸钠的混和物，二者的分离方法将是牛磺酸 纯度和得率的关键。用不同的离子交换树脂和操作 条件，采用离子交换法来分离牛磺酸和硫酸钠。田 代智康采用离子交换分离法，取得在最佳实验条件 下，回收率达 ９８．４％ ，产物的红外光谱图与标准品 一致的结果操作条件。 ２．５．２ 测定步骤