荧光原位杂交演示文稿
荧光原位杂交实验步骤
荧光原位杂交实验步骤嘿，咱今儿个就来讲讲这荧光原位杂交实验步骤哈！这实验呢，就像是一场精心编排的舞蹈，每一个步骤都得踩准点儿。
先说说样本准备吧，这就好比是给舞蹈演员选好合适的服装和道具。
得把样本处理得妥妥当当的，不能有一点儿马虎。
要是样本没弄好，那后面的步骤可就都白搭啦！你说这重要不？接下来是探针标记，这就像是给舞蹈演员化上独特的妆容，让他们在舞台上更加耀眼。
得把探针标记得精准无误，这样才能在后续的过程中准确找到目标呀。
然后就是杂交啦！这就好像是舞蹈演员们在舞台上开始尽情舞动。
要让探针和样本完美结合，就像舞者之间的默契配合一样。
这可不是随随便便就能做到的哟！杂交之后还得进行洗涤，这就好比是舞蹈结束后给演员们清理一下身上的汗水和灰尘。
把那些多余的、不需要的东西都洗掉，只留下最精华的部分。
再之后就是检测啦！这就像是观众们在欣赏舞蹈表演，要能清楚地看到演员们的精彩表现。
通过检测，我们才能知道实验的结果到底怎么样。
最后是分析数据，这就像是对舞蹈表演进行评价和总结。
看看哪些地方做得好，哪些地方还需要改进。
这一步可不能小瞧，它能让我们不断进步呢！你想想看，要是在实验过程中有一步没做好，那不就跟舞蹈中有人跳错了步子一样明显吗？所以啊，每一个步骤都得仔仔细细、认认真真地去做。
做这个实验就跟盖房子似的，每一块砖都得放稳了，房子才能坚固。
咱可不能图快就马马虎虎地做，那最后肯定得出问题呀！这荧光原位杂交实验可是个精细活儿，得有耐心、有细心，还得有那么点儿小技巧。
咱可不能小看了这些步骤，它们就像是一个个小环节，串起来才能完成这个大实验。
就像那句话说的，“千里之行，始于足下”，咱得一步一个脚印地把这实验做好。
总之呢，这荧光原位杂交实验步骤可都不简单，每一步都得用心去对待。
只有这样，咱才能在实验中取得好的结果，才能真正领略到科学的魅力呀！你说是不是这个理儿？。
荧光原位杂交 综述
荧光原位杂交（FISH）综述摘要本文简单介绍了荧光原位杂交（FISH）技术的一些基础理论知识以及常用操作方法和步骤。
关键词：荧光原位杂交;1.发展荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）是一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。
荧光标记的核酸探针只和具有高度相似性的核酸杂交，可用于染色体上基因的定位，或在分子生态学中用来标记不同分类细菌或古菌中的核糖体RNA[1]。
1969年，Pardue等和John两个研究小组发明了原位杂交技术，放射性标记的DNA 或28s RNA 被杂交到细胞制备物上，通过放射自显影技术(m icroautoradiography, MAR)检测杂交位点，这一技术可以在保持细胞形态完整性的条件下，使核酸序列在细胞内被检测[2]。
2.原理通过特定分子的荧光标记探针在细胞内与染色体上特意的互补核酸序列原位杂交，通过激发杂交探针的荧光来检测信号。
由于荧光燃料收到一定波长的（即激发波长）的光激发后会发射荧光（即发射波长），所以就滤光镜选择合适的激发波长的光，即可显示某一特定的荧光染料，于是就可以直接显示特定细胞核中或染色体上的DNA序列间相互位置关系[2]。
原位杂交的处理：染色体上杂交的位点提供了DNA探针序列的定位信息。
所以应用该方法时，需打开维持染色体DNA双螺旋结构的碱基配对以使其形成单链分子（这称为DNA变性）。
只有这样染色体DNA才能与探针杂交。
变性染色体DNA而不破坏其形态的标准方法是将染色体干燥在玻璃载玻片上，再用甲酰胺处理[1]。
3.关于探针的发展早期原位杂交技术中探针是放射性标记的，但这个方法并不令人满意，因为放射性标记很验证同时满足灵敏度和分辨率这两个原位杂交成功的必要条件。
灵敏度要求放射性标记具有高中辐射能（例如用32P标记），当标记物能量过高时，会因为信号散射导致分辨率过低。
如果使用低辐射能的放射性标记物，如3H可以得到较高的分辨率，但由于灵敏度低而需要长时间曝光，并由此导致背景过高，难以分辨出真正的信号。
荧光原位杂交技术在临床病埋中的应用 ppt课件
Blue单通道
荧光原位杂交技术在临床病埋中的 应用
二、常用探针种类
• 单色探针(single color probe, SC) • 双色探针(dual color probe, DC) • 三色探针(triple color probe, TC) • 双色分离探针(dual color, break apart probe. DC,BCR) • 双色单融合探针(dual color, single fusion. DC, SF
CCND1基因为重要预后因子，与多种肿瘸的转移、 复发等相关。在高凤险们GIST中扩增，在低风险和中等 风险GIST中无扩增，其表达与GIST有预后相关性。
MDM2基因扩增宣GIST患者有预后相关性。
荧光原位杂交技术在临床病埋中的 应用
前列腺癌
• 探针：PTEN/CEN10 FGFR1/CEN8 ERG
套细胞淋巴瘤
• 探针：CCND1/IGH（双色双分离探针）
CCND1基因位于11q13，IGH基因位于14q32。 CCND1/IGH融合基因导致CCND1蛋白过度表达，可促进细胞 增生。
• CCND1/IGH融合基因检测意义
CCND1基因重排和(或)高表达是MCL的特征，FISH探 针检测CCND1/IGH的阳性率可以达到96%。
• 检测意义：
PTEN基因缺失，前列腺癌患者预后差。 FGFR1基因扩增是前列腺癌患者传递激素抵抗的重 要过程。 没有ERG基因改变的前列腺癌患者8年生存期达90%。
荧光原位杂交技术在临床病埋中的 应用
神经母细胞瘤、神经胶质瘤
• 探针：1p36/1q25 19q13/19p13 NMYC/2q11
• MALT1及API2/MALTI融合基因检测意义
荧光原位杂交(FISH)范文
FISH-荧光原位杂交实验（原位杂交）1.实验目的通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。
掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。
2. 实验原理荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。
目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。
FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
杂交所用的探针大致可以分为三类：1）染色体特异重复序列探针，例如a卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。
间接标记是采用生物系标记的dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。
荧光原位杂交步骤
荧光原位杂交步骤
嘿，朋友们！今天咱就来讲讲荧光原位杂交这档子事儿的步骤哈。
首先呢，你得准备好你的样本，这就好比要做饭得先有食材呀！样
本处理得精细妥当，这可是基础中的基础呢。
然后呢，就是探针的准备啦。
这探针就像是一把钥匙，得找对了才
能打开那扇神秘的知识大门哟！精心挑选和制备合适的探针，那可不
能马虎。
接下来呀，就是杂交啦！把样本和探针放在一起，让它们亲密接触，就好像一场浪漫的约会，得让它们好好相处，产生奇妙的反应呢。
这
过程可得小心翼翼，温度啦、时间啦，都得把握得恰到好处，不然可
就搞砸咯！
再之后呢，就是洗去那些多余的东西啦。
就跟咱洗脸似的，把那些
不需要的脏东西洗掉，只留下最精华的部分。
这一步可不能随便，得
仔仔细细地洗干净。
然后呢，就是检测啦！看看杂交的效果怎么样，是不是达到了我们
想要的结果。
这就跟验收成果一样，满心期待着能有个好的呈现。
最后呀，就是分析数据啦！这可需要咱瞪大了眼睛，仔细去琢磨、
去研究。
就好像侦探在找线索一样，从那些数据里找出我们需要的信息。
你想想啊，这荧光原位杂交就像是一场精心编排的舞蹈，每个步骤
都是一个优美的动作，只有每个动作都做到位了，这场舞蹈才能精彩
绝伦呀！咱可不能在任何一个步骤上掉以轻心，不然怎么能得到准确
又可靠的结果呢？
所以啊，朋友们，要想把荧光原位杂交做好，就得一步一步慢慢来，就像盖房子一样，一砖一瓦都得垒好咯！咱得用心去对待每一个环节，这样才能在科学的海洋里畅游无阻呀！你们说是不是这个理儿呢？。
荧光原位杂交技术样本
硕士学位论文荧光原位杂交技术及其在环境领域内应用Fluorescence in situ hybridization technology and its application inthe field of environment作者姓名： **学科、专业：环境科学与工程学号： ********指导教师： ***完成日期： /3/26大连理工大学Dalian University of Technology摘要荧光原位杂交（FISH）是当代分子生物学及基因工程中广泛应用新技术，本文概述了FISH实验原理、实验流程以及技术问题等。
总结了某些实验核心环节操作要点和注意事项，并对荧光原位杂交技术在环境微生物监测方面应用做了综述。
运用FISH技术在环境样品上直接原位杂交，不但可以测定不可培养微生物形态特性及丰度，并且可原位分析它们空间及数量分布。
并且展望了FISH技术将来。
核心词：荧光原位杂交技术；探针；环境微生物；监测AbstractFluorescence in situ hybridization （FISH）is a new technology which is widely used in modern molecular biology and genetic engineering. This article summarizes the experimental principle，process and technical issues of FISH .Also we summarize some operation points and matters needed attention of key steps，and review application of FISH in environmental microbe monitoring. Using FISH technology directly in the environmental samples，can not only measure the morphology and abundance of uncultured microorganisms，but also analyse their spatial distribution and quantity in situ. And look forward to the future of FISH.Key Words：Fluorescence in situ hybridization technology；Probe；Environmental microbes；monitoring目录摘要............................................................................................. 错误!未定义书签。
荧光原位杂交实验(FISH)
荧光原位杂交实验（FISH）荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。
目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。
1实验方法原理：荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。
目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。
FISH 的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
杂交所用的探针大致可以分类三类：1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。
间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。
荧光原位杂交实验
实验四荧光原位杂交实验一、实验目的1.掌握核酸杂交的基本原理、过程和操作；2.熟练掌握荧光显微镜的使用方法；3.掌握Image J软件进行图像融合的方法；4.理解荧光原位杂交技术的应用。
二、实验原理核酸杂交是以碱基互补为基础、以双链核酸分子在特定条件下的变性和复性为手段，对核酸分子进行定性和定量检测。
两条互补的核苷酸单链在特定条件下退火形成异质双链；应用荧光标记的探针与待检测材料中的单链核酸进行特异性结合，形成可悲检测的杂交双链核酸。
在显微镜下观察并记录结果。
本实验所用探针是位点特异性标记探针GSP myc，是由SpectrumOrange （552/576）直接标记的荧光DNA探针，长度为200bp，能识别8号染色体的着丝粒部位的α卫星序列。
三、实验器材和试剂防脱载玻片（premiere公司），医用砂轮，20×20mm盖玻片，橡皮胶，平板加热器，杂交盒，恒温水浴锅，玻璃染色缸，香柏油，荧光显微镜拍照系统，MYC基因扩增检测试剂盒。
四、实验步骤1.样品处理1）取细胞培养悬液5ml（107 cell）,2000rpm离心5min，去上清；2）加入10ml的0.075M KCl，吹打混匀，静置3min；3）37℃水浴箱低渗30min；4）加固定液2ml，吹打混匀，室温预固定10min；5）2000rpm离心5min，去上清；6）沉淀加固定液5~10ml，吹打混匀，-20℃冰箱静置30min；7）2000rpm离心5min，去上清。
2.制片1）取一张干净的载玻片，用砂轮在背面划“一”标记，尽量在中间或靠下端标记；2）加50ul固定液重悬细胞，取4ul悬液滴加到载玻片上的标记位置，室温晾干；3）平板加热器上烤片，60℃30min，显微镜下观察细胞密度；4）PBS洗涤3min；5）1%多聚甲醛室温固定10min；6）PBS洗涤3min；7）70%、90%、100%梯度乙醇脱水2min；8）取出玻片，室温晾干。
荧光原位杂交（FISH）前处理实验步骤详解及案例分析
荧光原位杂交（FISH）前处理实验步骤详解及案例分析FISH样本前处理真的头疼样本本身的差异，实验多因素的影响都可能会影响杂交效率导致探针信号不佳别着急今天小编以乳腺癌FFPE样本为例从实验步骤的原理入手为你梳理FISH实验前处理实验步骤标本要求1. 标本的类型（1）手术切除标本；（2）粗针穿刺活检标本；（3）麦默通活检标本；（4）大于100个癌细胞的细胞学标本。
2. 标本的固定所有乳腺癌标本离体后都应尽快固定（1h内）。
固定时应将标本每隔5～10mm切开，并可在组织间嵌入纱布或滤纸等物。
固定液量与所浸泡组织的比例应足够。
固定时间以6～72h为宜。
3. 固定液类型3.7%中性（磷酸缓冲）甲醛固定液。
4. 切片厚度以4～5μm为宜。
——对标本的要求来源于《乳腺癌HER2检测指南（2019版）》。
需要注意：1.标本固定的两个时间点很关键。
一要及时固定（1h内）。
固定不及时，细胞发生自溶，DNA降解，DAPI下观察，标本呈现核很浅，甚至有糜烂现象，信号无或缺失严重。
二要注意固定时间以6～72h为宜。
对于小的穿刺标本，建议固定6-24小时，而手术切除的大标本以24小时以上为佳。
2.切片厚度影响。
切片太薄（实际厚度<3um），容易消化过，且信号出现很大比例的丢失，影响结果判读（图1）；切片太厚（实际厚度>5um），难于消化，容易出现高背景，信号层面增多影响观察判读（图2）。
图1 切片太薄FFPE样本杂交图（HER2探针，Ｘ1000倍）图2 切片太厚FFPE样本杂交图（HER2探针，Ｘ1000倍）实验步骤分解1. 玻片预处理1.1 玻片放入65±5℃恒温箱中烤片过夜；【使组织细胞紧紧粘附，后续洗涤等处理时不至于脱落；烤片后立即脱蜡，可减短脱蜡时间、增强脱蜡效果，烤片不短于两小时。
】1.2 取出玻片，将其放入二甲苯中室温脱蜡30分钟；【相似相溶原理，可用环保试剂代替二甲苯。
】1.3 取出玻片，再将其放入另一缸二甲苯室温继续脱蜡10分钟；1.4 取出玻片，再将其放入无水乙醇中室温10分钟；【去除残留二甲苯。
荧光原位杂交(FISH)_ppt课件
肽核苷酸（PNA）探 针 PNA寡聚物是一类 新分子，其结构与 DNA相似。但在PNA 中，没有核糖-磷酸基 骨架，其骨架是不带 电的肽链(聚酰胺）。
PNA与DNA杂交时也 遵循碱基互补配对原则
与DNA相比，PNA对热稳定、与DNA 的结合不依赖于离子强度，因此杂交 时，受探针变性温度和溶液PH的影响 较小，鉴于这些特点和优点，PNA有 望取代DNA或RNA作为FISH的探针。 但由于PNA探针只能通过化学方法进 行合成，而且合成费用高，因此迄今 所用的PNA探针还仅限于染色体的泛 着丝粒和泛端粒探针。
基本原理
根据碱基互补配对原则，同源的DNA-DNA、 DNA-RNA和RNA-RNA两条单链在一定条 件下能结合成双链。用放射性或非放射性 物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补的 cDNA作探针，与组织切片或细胞内待测核 酸(RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用 放射自显影等方法予以显示，在光镜或电 镜下观察目的 mRNA或DAN 的存在与定位。
探针的制备
探针（probe)是指用于检测特定基 因或转录产物存在或表达的DNA、 RNA或寡核苷酸序列。
杂交实验所选择的核酸探针可以分 为三种：化学合成、克隆和PCR。
探针的分类
根据化学组成，可以将探针分为DNA、 RNA、PNA及寡核苷酸探针。 DNA探针 这类探针应用最广，可以通过化 学合成、克隆或PCR技术获得。 RNA探针 一般用RNA聚合酶体外转录克隆 的DNA序列获得。RNA-RNA杂交分子在所 有可能的杂交分子中最稳定，但RNA探针 容易被RNase降解。
FISH的基本原理
FISH基本原理是利用同源互补的待检染色 体与用生物素、地高辛标记过的核酸探针, 经变性- 退火- 复性,形成待检DNA与核酸探 针的杂交体。使探针与荧光素标记的特异亲 和素之间发生免疫化学反应,最后用荧光显 微镜对待测DNA进行定性、定量或相对定位 分析。
荧光原位杂交(FISH)技术.ppt
3. 去处rubber cement以及盖玻片 4. 将第一张玻片放到0.4X SSC/ 0.3% NP-40，73±1oC，轻轻
摇动玻片3 secs. 重复剩下3张玻片，洗2 mins
__ 不要同时将4张玻片放入conplin缸中 __ 保证玻片在洗液的时间不要超过2mins
需要的主要设备
荧光显微镜 在荧光显微镜下，DNA探针上
的荧光基团在一定波长的激发光激发后会发 出一定颜色的光线。射入光激发荧光分子， 荧光分子随后发出光子，发出的光子具有较 长的波长 – 较低的能量荧光标记的探针与其 靶标结合后 – 将能检测到荧光信号
水浴箱2台、热台1个，恒温箱1台。（或 者只需1台FISH杂交仪）。
将滴好的片子放在2×SSC中，37 ℃ 1小时老化。
将玻片放到新鲜配置的胃蛋白酶溶液37 ℃杂交预处理 13 mins 。
PBS洗，后固定液固定10分钟，PBS洗，晾干后70%的酒精1 min，85%的酒精1 min，100%的酒精1 min 酒精梯度脱水 。
实验程序3 变性杂交
玻片变性，73±1 ℃ 5mins 。关键步骤！！ 20 ℃ 冷冻的70%的酒精1 min85%的酒精1 min100% 的酒精1 min 酒精梯度脱水 。在45-50 ℃热台上使 玻片完全干燥 。---保持DNA单链状态。
二、细胞间期和分裂中期相中的染色体计数
识别和确定染色体易位
单个位点或基因的缺失/扩增
中期分裂相染色体涂片识别某染色体
FISH技术优点
标本多样性：细胞涂片（绒毛、精子、卵裂
球PGD等） 脱落细胞收集制片（羊水等）。
客观判断 高灵敏性 高特异性 定量分析、重复性好 在同一标本中同时评价多个基因的改变 DNA的稳定性
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❖1974 年，Evans第一次将染色体显带技术 和原位杂交技术结合起来,提高了基因定位 的准确性。
❖1975 年,Manning 等最先在溶液的分子杂交 中,使用非放射性标记,通过细胞色素C 将生 物素与RNA 分子连接起来。
FISH的基本原理
❖FISH基本原理是利用同源互补的待检染色 体与用生物素、地高辛标记过的核酸探针, 经变性- 退火- 复性,形成待检DNA与核酸探 针的杂交体。使探针与荧光素标记的特异亲 和素之间发生免疫化学反应,最后用荧光显 微镜对待测DNA进行定性、定量或相对定位 分析。
发展历史
❖1974年Evans首次将染色体显带技术和染 色体原位杂交联合应用，提高了定位的准 确性。
❖1977 年Rudkin发明了用间接免疫荧光法检 测目的DNA 的非同位素原位杂交(NISH)。
❖1981 年，Langer 等首次采用生物素标记的核苷 酸探针成功地进行了染色体原位杂交,建立了非放 射性原位杂交技术 。至此,以荧光标记的探针在细 胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。
❖1985 年，原位杂交技术被引进到植物。
荧光原位杂交演 示文稿
（优选）荧光原 位杂交
基本原理
❖根据碱基互补配对原则，同源的DNA-DNA、 DNA-RNA和RNA-RNA两条单链在一定条 件下能结合成双链。用放射性或非放射性 物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补的 cDNA作探针，与组织切片或细胞内待测核 酸(RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用 放射自显影等方法予以显示，在光镜或电 镜下观察目的 mRNA或DAN 的存在与定位。
❖20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记 的原位杂交，即FISH技术。
❖1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列 定位到G显带标本上，标志着染色体定位技 术取得了重要进展。
❖1969 年Gall 和Pardue 以及Pardue 等人利 用放射性同位素标记的核酸探针对DNA进 行了杂交,开创了RNA-DNA 的同位素原位 杂交技术。
❖1986 年，Cremer 与Licher 等分别证实了荧光原 位杂交技术应用于间期核检测染色体非整倍体的 可行性,从而开辟了间期细胞遗传学研究。
❖20世纪90年代，随 着人类基因组计划 的进行，由于绘制 高分辨人类基因组 图谱的需 探针的制备 探针标记 杂交 （染色体显带） 荧光显微镜检测
PNA与DNA杂交时也 遵循碱基互补配对原则
❖与DNA相比，PNA对热稳定、与DNA 的结合不依赖于离子强度，因此杂交 时，受探针变性温度和溶液PH的影响 较小，鉴于这些特点和优点，PNA有 望取代DNA或RNA作为FISH的探针。 但由于PNA探针只能通过化学方法进 行合成，而且合成费用高，因此迄今 所用的PNA探针还仅限于染色体的泛 着丝粒和泛端粒探针。
荧光原位杂交
❖荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization， FISH）是在20世纪80年代 末在放射性原位杂交技术的基础上发展起 来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧 光标记取代同位素标记而形成的一种新的 原位杂交方法，探针首先与某种介导分子 (reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫 细胞化学过程连接上荧光染料。
1
放射性同位素
❖3H、35S、125I、32P等
22 非放射性物质
荧光素、生物素、地高辛等
❖同位素原位杂交的不足之处： ❖1、不稳定 ❖2、高背景 ❖3、曝光时间长 ❖4、结果统计处理繁琐 ❖5、同位素的使用和处理
几种原位杂交技术
❖1 基因组原位杂交技术 ❖2 荧光原位杂交技术 ❖3 多彩色荧光原位杂交技术 ❖4 原位PCR
探针标记
❖为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂 交，有必要对探针加以标记，以便在结合部 位获得可识别的信号。
❖荧光原位杂交得探针常用荧光素或地高辛进 行标记。
❖探针标记可以采用均匀标记和末端标记的方 法。
均匀标记
❖对探针进行标记时，可复制合成一段新探针 分子，在复制合成过程渗入标记核苷酸，从 而使整个新分子被均匀地标记。其显著的特 点是标记不局限一个位点，而是均匀地渗入， 探针的信号强。
结果分析
DNA RNA PNA
将探针置于载玻片上
在荧光显微镜下观察 检测
杂交
加盖玻片 变性
探针的制备
❖探针（probe)是指用于检测特定基 因或转录产物存在或表达的DNA、 RNA或寡核苷酸序列。
❖杂交实验所选择的核酸探针可以分 为三种：化学合成、克隆和PCR。
探针的分类
❖根据化学组成，可以将探针分为DNA、 RNA、PNA及寡核苷酸探针。
❖寡核苷酸探针 它是根据探针靶序列的碱基 顺序用化学方法合成的单链DNA，其长度 为15-20核苷酸。由于分子小，因此更容易 渗透到细胞的目标区域；但也正由于分子小， 限制了其所能携带的荧光基团或报告分子数 目，并最终导致杂交后荧光信号较弱。因此 这类探针仅实用于对重复单位较短的高度重 复序列的荧光原位杂交分析。
❖DNA探针 这类探针应用最广，可以通过化 学合成、克隆或PCR技术获得。
❖RNA探针 一般用RNA聚合酶体外转录克隆 的DNA序列获得。RNA-RNA杂交分子在所 有可能的杂交分子中最稳定，但RNA探针 容易被RNase降解。
❖肽核苷酸（PNA）探 针 PNA寡聚物是一类 新分子，其结构与 DNA相似。但在PNA 中，没有核糖-磷酸基 骨架，其骨架是不带 电的肽链(聚酰胺）。
❖均匀标记有切口平移法、随机引物法和 PCR扩增等方法。
• 切口平移法可对环状或线性双链DNA进行标记。一 般对克隆的DNA片段用这种方法标记的效果较好。
• 该方法使用时应注意： • A.只能标记双链DNA 使用探针时要预先变性后再
使用，而且标记时DNA片段不太小 • B. DNA酶I使用的量要合适 太多会将DNA模板切碎，