斑马鱼原位杂交实验方案

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TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验方法与流程

TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验⽅法与流程HEREDITAS (Beijing)2013年4⽉,35(4):533―544ISSN /doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html实验指南收稿⽇期:2012?12?30;修回⽇期:2013?02?05基⾦项⽬:国家重⼤科学研究计划项⽬(编号：2012CB945101和2011CBA01000)和国家⾃然科学基⾦项⽬(编号：31110103904)资助作者简介:沈延,博⼠,研究⽅向：斑马鱼遗传与发育机制。

Tel ：010-********;E-mail:yshen@/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html 通讯作者:张博,博⼠,教授,研究⽅向：斑马鱼遗传与发育机制。

E-mail:bzhang@/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html 致谢:感谢祖尧为改进检测技术做出的贡献。

⽹络出版时间:2013-3-515:03:12URL:/doc/1a6ad63daaea998fcc220ed0.html /kcms/detail/11.1913.R.20130305.1503.002.htmlDOI:10.3724/SP.J.1005.2013.00533TALEN 构建与斑马鱼基因组定点突变的实验⽅法与流程沈延,黄鹏,张博北京⼤学⽣命科学学院,细胞增殖与分化教育部重点实验室,北京100871摘要:类转录激活因⼦效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)是最近发展起来的⼀类新型的⼈⼯核酸内切酶,它由特异性的TALE DNA 结合结构域和⾮特异性的Fok Ⅰ核酸内切酶切割结构域组成。

TALEN 能够根据⽤户需要切割特定的核苷酸靶序列,造成DNA 双链断裂,从⽽诱导该靶序列产⽣indel 突变,⽬前已成功地应⽤于多个物种或体外培养细胞的基因组定点突变。

(标准)斑马鱼胚胎原位杂交material&protocol

器（Ｉ６１、Ｈ－－）进针器（Ｎ１）支架（Ｊ１，本ＮｒｓｉＭ－５、１Ｇ－）日ａｉｇｈｅ
公司产品；
１显微注射用针，由Ｄｕｍｎ公司１毛细玻璃管拉制而成；３．ｒｍｏｄ０川
１．４拉针仪（ＥＡＰ）ＨＫＰ５，日本ＨＫ公司产品；ＩＥＡ１．５荧光解剖镜（Ｘ－２，日本ＯＹＰＳＳＺ１）ＬＭＵ公司产品；１．６数码相机（９５，本ＮＫＮＥ９）ＦＩＩＯ公司产品；主要试剂、试剂盒、酶、载体和菌株
１．各种限制性内切酶、４ＤＡＴ－Ｎ连接酶、ｌｏ片段均为Ｎｗｇａｄｌｂ公司ＫｅｗｎｅＥｌｎＢｏａｓｎｉ
产品；
２ＰＲ应试剂，．反Ｃ包括：ａ酶、应缓冲液、ＮＰＴｑ反ｄＴ等均购自上海申能博彩生物公司：３位杂交试剂：Ｓ６．原ＰＲＡ聚合（５反应缓冲液和ｌｍＤＮ酶含ｘ０Ｍ０ＴＴ溶液）ＴＲ、７ＮＡ
ＳＡＴｇｎｃｏｄ部分序列５ＡＧＡＴＧＡＣＡＧＡＡＴ３ＭＲＯｉｕｌｔｅｌｏｅｉ＇ＡＣＧＧＴＴＡＣＣＧＧ－’ －作为５＇端
ＰＲ引物，进行ＰＲ扩增ｃＮＣＣＤＡ．ＰＲ反应体系：ＣＦｒ－ｔｎｃＡｄＮｉｔｒｓＳａＤ１１４１ＸＲｅｂｆｒ０ＣｕＰ５１４５ＸＴＭｉＰｘ０Ｎｄ１１４
斑马鱼平滑肌特异性基因Ｓ２的克隆、表达和功能研究Ｍ２ａ
Ｌｎ，９７０ｏｇ１９）ＰＲ产物克隆到ＴｅａｖｃｏＣ－ｓｙｔｒ上，通过连接、转化、小量抽提、限制性内切酶ｅ酶切、电泳鉴定出正确克隆，具体步骤参考《子克隆实验指南（分第三版），并通过测序验证其正确性。大量抽提ＧＴ－ｃＮＴ质粒，分别采用限制性内切酶ＳｌＡＡ１Ａ－Ｄａｌ

斑马鱼的原位杂交技术

斑马鱼的原位杂交技术整理人邵明:将特定时期的斑马鱼胚胎在多聚甲醛中C4%4o固定过夜第一天：、洗1PBST2x5min、剥膜2、洗3PBST5min可选步骤蛋白酶处理前的胚胎不处理(: K: 24hpf, 24hpf-的胚胎蛋白酶处理分钟以后的胚胎处理半小时48hpf10ug/ml K15, 48hpf,然后洗PBST3x5min)、C5min4hyb- 65o孵育、C4h（可选步骤: 可将胚胎置于hyb+中-20oC长期储存）5hyb+ 65o孵育、加探针(探针孵育置于冰上65oC10min, 5min, 655oC-孵育过夜65oC先将然后使用).第二天：、回收探针, I2x30min1（探针可以重复使用10次以上）洗液孵育探针的温度、洗液孵育探针的温度2II 1x15min、洗液孵育探针的温度3III 2x30min、室温4MABT 3x5min、封闭液孵育室温5 4h、AP, 4oC (-20oC, 61:2500 Anti DIG-稀释于封闭液中孵育过夜稀释好的抗体保存于可重复使用3次以上。

)第三天、回收抗体1、2MABT 2x30min3、PBST 2x30min、平衡缓冲液左旋咪唑4+0.5mg/ml （60mg/ml左旋咪唑储液稀释120倍）孵育10min、显色液中孵育直到信号足够强为止。

5试剂配方固定液: 4% 多聚甲醛（paraformaldehyde）in 1XPBSWeigh 2 g PFA and dissolve it in 50 ml 1XPBS. (PFA is hard to dissolve.) Incubate the mixture at 65oC for around 2 hours. Shake the mixture during the incubation). After dissolved, the solution is stored at 4oC.10XPBS stock solution: mix 76 g NaCl, 9.9 g Na2HPO4, 3.6g NaH2PO4. Dissolve them in less than 1 liter nanopure water, adjust to pH7.0 and a final volume of 1 liter. Autoclave for 35 minutes to sterilize.130 mM NaCl = 10 X 0.13 X 58.44=76 g NaCl7 mM Na2HPO4 = 10 X 0.007 X 142 = 9.9 g Na2HPO43 mM NaH2PO4 = 10 X 0.003 X 120 = 3.6 g NaH2PO4Paraformaldehyde (PFA) (Mallinckrodt 2621).（注意所用的试剂有没有结晶水）Proteinase K (Sigma P-2308); Stock solution (10 mg/ml = 10 ug/ul): weigh 10 mg proteinase K and dissolve in 1 ml nanopure water. Aliquot 50 ul each and store at -20oC. Thaw at room temperature before usage. Long storage may appear to see white precipitate after thawing. V ortex the tube and make sure the precipitate be mixed evenly.20XSSCFor 1 liter: 1 X 3 mol = 3 X 58.44 =175.3 g NaCl1X 0.3 mol = 0.3 X 294.1 = 88.2 g Na3.Citrate.2H20adjust pH=7 using HCl. autoclave 35 minutes for sterilizeization.（注意所用的试剂有没有结晶水）Yeast RNA: dissolve 50 mg RNA in 1 ml nanopure water (50 mg/ml); store at -20oC肝素（Heparin） (Sigma H3393): dissolve 50 mg heparin in 1 ml nanopure water (50 mg/ml); store at -20oCMAB X 2 liters pH7.5100 mM Maleic acid (Sigma M-0375) = 23.2 g (2 X 0.1 X116.1)150 mM NaCl = 17.5g (2 X 0.15 X 58.44)add solid (? g) to adjust pH=7.5, autoclave for 35 minutes to sterlize.Blocking regent (1096 176, Boehringer Mannheim, now Roche?). 10% stock solution. Weigh 10 g blocking regent and dissolve it in 100 ml MAB, shaking and heating in a microwave oven for 1 minutes (?), autoclave for 25 minutes and then aliquot into 14 ml and store at -20oC.50mg/ml 酵母RNA：称取2g酵母RNA干粉（生工），加入40ml去离子水，超声振荡溶解，-20oC保存。

斑马鱼胚胎整体原位杂交_6.22

斑马鱼胚胎整体原位杂交(Whole-mount in situ hybridizations in zebrafish embryos)北京大学遗传与发育生物学实验室整理者：肖安版本：V6.22 Build 2006-8-17说明：小号宋体文字为操作提示，其中下划线标记者为以下数步均需注意的内容；小号楷体文字为影响结果的重要步骤提示，注意控制记录其操作处理的条件和时间，以在重复实验探索最适条件时进行适当调整。

在整个实验中应当注意：(1) 由于环境中存在大量RNA酶，RNA在常温下极易降解。

因此，涉及RNA的操作，在探针去除之前，以及探针的合成与纯化过程，必须严格防止污染。

操作需要要戴乳胶手套进行，使用专用枪头、离心管、电泳槽等，尽量缩短RNA 在常温或37℃放置时间，电泳使用高电压短时间的程序，每次必须更换新电泳液。

实验间隙中RNA放置在-20℃，过夜或更长时间保存在-80℃。

(2)如同时对多管进行吸去溶液和加入溶液工作，应当按照同样的顺序依次操作，以保证其处理时间基本一致。

避免漏加溶液。

(3)注意所加溶液与胚胎温度的差异，应当先预热再使用。

一般溶液加入量为1mL左右，管平放以使胚胎分散与溶液充分接触，但探针杂交一步溶液过少可竖直放置。

(4)吸取胚胎的枪头应剪去尖端以扩大开口。

吸时动作要轻。

任何时候都要防止丢失胚胎，可在换前一管溶液时将后一管竖直放置让胚胎沉降一会以免吸走。

(5)注意保护标签，并且易混淆标签必须设法分辨(如6和9)。

第一天以下操作需戴乳胶手套。

1 水溶液体系重新处理 (Rehydration)。

1.1吸去恢复到室温的胚胎中的甲醇(MeOH)，用70%, 50%, 30%的 MeOH的PBST溶液依次处理5分钟。

梯度稀释的目的是防止胚胎收缩，可适当多添加几个浓度梯度。

稀释时间宁长勿短。

特别注意保护标签，MeOH为有机溶剂，易腐蚀油性笔书写的标签。

1.2 PBST处理5分钟，两次。

2 蛋白酶消化和随后的固定(Proteinase digestion and post fixation)。

Le 斑马鱼nanos1基因在配子发生中的原位杂交研究

遗!传!"#"$%&’(!)*+,+-."!"!#"#$%&!$&#$!’’$研究报告收稿日期!!’’#(((’"修回日期!!’’$’(!’基金项目!国家%)*计划!国家高技术研究发展计划项目"!编号#!’’(++!!!’"("和国家自然科学基金项目!编号#*’!"’)"$"资助%,-../01234567892:2;<18/9<=>0/?0<@:A /0B 8?7C 2D 79/=/?5E 2:2<0D 7<93F 2G 2=/.@291!;/H !’’(++!!!’"("$;<18/9<=;<1-0<=,D 829D 2I /-93<18/9/A 6789<!;/H *’!"’)"$"&作者简介!陈云贵!(&""’"$男$硕士研究生$研究方向#鱼类分子遗传学通讯作者!宋!平$J K @<8=#.89?:/9?.:"5<7//H D /@H D 9!"斑马鱼#$#%&’基因在配子发生中的原位杂交研究陈云贵(!宋!平(!吕道远(!周!伟(!桂建芳!!(H 武汉大学生命科学院发育生物学教育部重点实验室$武汉#*’’"!(!H中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室$武汉#*’’"!"摘!要!利用组织原位杂交技术$以地高辛标记的反义E ;+为探针$检测了斑马鱼!$/-+01*1+0"-/-02(基因在卵子发生及精子发生中的表达分布特点$初步探讨了该基因在斑马鱼配子发生中可能的功能)结果表明#在斑马鱼卵子发生中$-/-02(@E ;+均匀分布于卵原细胞和各时期卵母细胞的胞质中(在卵原细胞和#*$期卵母细胞中$-/-02(@E ;+的杂交信号十分强烈$而较晚期卵母细胞中信号明显减弱)在斑马鱼精子发生中$-/-02(@E ;+可在精原细胞和初级精母细胞中检测到)-/-02(@E ;+的阳性信号在精原细胞中极为强烈$在初级精母细胞中较为微弱$而精子细胞中没有阳性信号)结果初步表明$斑马鱼-/-02(基因对生殖干细胞K 卵原细胞和精原细胞的维持和正常功能可能起着重要作用)关键词!原位杂交(斑马鱼(-/-02((卵子发生(精子发生(生殖干细胞中图分类号!L &$*!!!文献标识码!+!!!文章编号!’!$*M &""!!!’’$"’#M ’$%&M ’)()*+,%#)-"./01"&&2%#%34"51$32&-!6$#2%1"12%"#$#%&’6*12#78$9")%7"#"&2&5,2#&2)*:,512+2;$)2%#6B J ;N -9K O -8($,P ;O>89?($Q RF </K N -<9($S B P T U 28($O T V W 8<9K I <9?!!(3(45006078+7*(4+*-4*29:5/-;-+<*12+=>$9:5/-#*’’"!$?5+-/(!3(=/=*@*>8/A 01/=01>07B 1*25C /=*1"4060.>/-D)+0=*45-060.>$%-2=+=:=*07!>D 10A +060.>$?5+-*2*’4/D *E >07(4+*-4*2$9:5/-#*’’"!$?5+-/"<5&)1$=)#T :89?+-2+=:7540838X <18/9/918::-2:2D 18/9:Y 817F V O<918:29:2E ;+.0/42$17238:1084-18/9/A X 240<A 8:7!$/-+01*1+0"-/-02(@E ;+3-089?//?292:8:<93:.20@<1/?292:8:Y <:3212D 123$<931722Z .02::8/9<93A -9D 18/9/A -/-02(3-089?X 240<A 8:7?<@21/?292:8:Y <:.02=8@89<08=5:1-3823H C 7202:-=1:Y 202<:A /==/Y :#-/-02(@E ;+-98A /0@K =538:.20:23170/-?7/-1172D 51/.=<:@/A //D 512:<1<==:1<?2:H ,10/9?2Z .02::8/9/A -/-02(@E ;+Y <:/4:20G 2389//K ?/98<<93:1<?2#*$//D 512:$4-1172:8?9<=42D <@2Y 2<[2089=<120:1<?2//D 512:H ,10/9?2Z .02::8/9/A -/-02(@E K ;+Y <:3212D 12389:.20@<1/?/98<<9302=<18G 2=5Y 2<[20:8?9<=Y <:A /-9389.08@<05:.20@<1/D 512:4-19/-/-02(@E K 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6:"中的-/-02($-/-02!和-/-02*%"$%&$以及人类!!*E02/F+*-2"中的-/-02(%&&$并对其功能展开了广泛研究)果蝇的J/-02蛋白?G末端具有两个在进化上高度保守的锌指结构域$对于J/-02蛋白结合E;+活性及其功能是必需的%(’&)在果蝇中$因富集于受精卵末端的母源-/-02E;+翻译$产生一个从后到前逐渐降低的J/-02蛋白梯度%((!(*&)J/-02蛋白与K:E+6+0蛋白共同作用$抑制母源5:-45A/4L@E;+在胚胎后部的翻译$从而指导腹部发育%(#$($&)缺少-/-02基因仍可形成极细胞$但这些极细胞不能迁入胚胎性腺$不能分化为具有功能的生殖细胞%()$("&)在线虫与斑马鱼中$-/-02(基因同样不为原始生殖细胞!>O6:$.08@/038<=?20@D2==:"形成必需$但若缺少该基因的功能$>O6:也不能迁入胚胎性腺$过早地分化并死亡$说明-/-02(基因的功能在于指导>O6:正常迁移并且维持其生殖细胞命运%#$)&)在爪蟾中$H4/=K!E;+是生殖质组分$定位于成熟卵母细胞的植物极皮层$在卵子发生中不翻译)\D<1蛋白在体外能结合E;+$可能调控某些>O6:专一E;+的翻译%$$(%&)在小鼠中$-02(基因的合子在中枢神经系统中表达$不为正常发育所必需%"&)-02!基因敲除雄鼠精巢发育不良$精巢中完全缺失生殖细胞)-02*基因敲除小鼠>O6:的形成不受影响$但精*卵巢同样发育不良$完全缺失生殖细胞%%&)为了进一步探讨该基因在脊椎动物生殖细胞增殖和分化中的功能及其意义$本研究以斑马鱼的精巢和卵巢为材料$以F V O!地高辛"标记的-/-02基因的反义E;+为探针$通过组织切片原位杂交的方法$对该基因在斑马鱼卵子发生和精子发生过程中的表达及可能的功能进行了分析)(!材料和方法’@’!实验用鱼实验用斑马鱼购于武汉市武胜路花鸟虫鱼市场)’@A!重组质粒根据已发表的斑马鱼-/-02(基因的D F;+序列%)&$设计>6E引物$正向引物$]K O6CC C CC6C 6C C6C6K*]$反向引物$]K C6+66+C O CC O+C C C K *])以斑马鱼精巢D F;+为模板$扩增出一段#""4.的片段)将该片段克隆于.O J^K C载体!>0/K @2?<"中$作为合成E;+探针的模板)’@B!主要试剂与药品;C>,21$,>)+C"E;+./=5@20<:2均为^_V 公司产品)F V O K((K T C>和:722.<918K F V O K+>I<4 A0<?@291:为E/D72公司产品);_C+_6V>检测试剂盒为华美公司产品)’@C!实验方法(H#H(!质粒载体的转化!扩增与抽提按文献%(&&操作)(H#H!!质粒载体的酶切线性化在)’%Q的总反应体系中$带有目的基因核糖探针模板的重组质粒均为(%?)对于J2+#的酶切反应$含有#T J2+#!华美公司"(对于(F5#的酶切反应$含有#H$T(F5#!华美公司")酶切反应在*"‘保温#7后$异丙醇沉淀过夜)经"’a乙醇洗涤空气干燥后$溶于!’%Q F J>6K B!P$琼脂糖凝胶电泳检测其浓度)(H#H*!地高辛标记核糖探针的体外转录合成体外转录地高辛标记核糖探针按文献%!’&$并稍加修改进行)(H#H#!性腺组织切片的原位杂交!("冰冻切片的制备#在M!$‘$将性腺切片成(’!(!%@的切片$贴于载玻片上)!!"性腺组织切片的预杂交和原位杂交#在预杂交液!$’a甲酰胺的#b,,6"中*"‘预杂交($@89以上)滴加*’!#’%Q含$!(’9?探针的杂交液$盖上盖玻片)#!‘温盒杂交过夜)!*"杂交后漂洗#!b,,6和(b,,6各漂洗*次$每次(’@89)再用E;<:2+在*"‘消化未杂交E;+探针*’@89)再’H(b,,6漂洗#次$每次(’@89)!#"杂交信号的免疫检测!染色"#_-A A20 V!(’’@@/=+QC08:K B6=$.B"H$$($’@@/=+Q;<6="漂洗!次$每次(’@89)经抗体封闭液!_-A A20V c’H (a C081/9b K(’’c!a羊血清"浸泡*’@89)然后免!"#遗!传!"#"$%&’(!)*+,+-."!’’$!!!!!!!!!!!!!!!!!"卷!疫结合#<918K F V O K+>按(d$’’稀释于稀释于封闭液中$滴加于切片上$湿盒中孵育!7)_-A A20V洗*次$每次(’@89)在_-A A20$!(’’@@/=+QC08:K B6=$ .B&H$$(’’@@/=+Q;<6=$$’@@/=+Q^?6=!"中浸泡(’@89)每片覆盖$’-Q显色液$湿盒中暗处显色’H$至#7)终止反应#用_-A A20&!(’@@/=+QC08:K B6=$.B%H’$(@@/=+QJ F C+"浸洗!次$每次$@89)最后系列乙醇’二甲苯脱水透明)中性树脂封片$显微镜检)!!实验结果A@’!斑马鱼卵子发生中#$#%&’9D E<的原位杂交检测结果斑马鱼-/-02(@E;+在卵原细胞和#*$*&*’期卵母细胞的胞质中均能检测到$但不存在于细胞核中!图($+")在卵原细胞和#*$期卵母细胞中$-/-02@E;+的杂交信号非常强烈$均匀地分布于整个胞质中!图($+*($F*($J")随着卵母细胞的生长发育及卵黄的积累$&*’期卵母细胞胞质中-/-02(@E;+的杂交信号明显减弱$但仍然是均匀地分布于整个胞质中!图($+*($J")A@A!斑马鱼精子发生中#$#%&’9D E<的原位杂交检测结果斑马鱼-/-02(@E;+的杂交信号可在精原细胞和初级精母细胞中检测到!图!+*!F")在精原细胞中$-/-02(@E;+的阳性信号极为强烈$初级精母细胞中信号较为微弱$而精子细胞中没有阳性信号!图!F")图’!斑马鱼#$#%&’基因在卵子发生中的原位杂交分析+#-/-02(基因反义链探针杂交结果(_#-/-02(基因反义链探针杂交结果(6#-/-02(E;+杂交信号在卵原细胞和#期卵母细胞中很强烈$均匀地分布于胞质中(F#-/-02(E;+杂交信号在&期卵母细胞中明显减弱(J#-/-02(基因正义链探针杂交结果(I#成熟卵巢B J染色P?#卵原细胞(#*$*&*’表示各时期卵母细胞(O e#生发泡)+#放大倍数为(’’(_*J*I#放大倍数为(’’(6*F#放大倍数为#’’) F27@’!6")"=)2%#%3;"51$32&-#$#%&’"/01"&&2%#+*12#7%%7"#"&2&5,2#&2)*-,512+2;$)2%# 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:12@D2=="的功能和存活而并非调控其形成%!$&)最近的研究发现$;<9/:蛋白在果蝇幼虫卵巢的>O6:及成虫卵巢中的生殖干细胞中高表达$在分裂增殖中的胞囊细胞也有表达(并证实$;<9/:蛋白在卵子发生中通过阻止生殖干细胞过早分化$来维持其干%"#遗!传!"#"$%&’(!)*+,+-."!’’$!!!!!!!!!!!!!!!!!"卷!细胞自我更新的属性$而不为生殖干细胞之后的卵子发生事件所需%!)&)在斑马鱼中$母源-/-02(E;+也是生殖质组分$在早期胚胎中的表达模式与另一生殖质组分’’’</2/E;+一致$即在>O6:中特异表达)反义吗啡啉实验证明$斑马鱼>O6:的形成并不需要-/-02(基因$但它是>O6:正常迁移*存活及发育必需的%)&)在线虫和小鼠中的研究结果与之一致%#$%&)但至今未见对-/-02基因在鱼类配子发生中的表达和功能研究的报道)本研究结果显示$在斑马鱼卵子发生中$-/-02(@E;+在卵原细胞及#*$期卵母细胞中表达极高(在&*’期卵母细胞中也能检测到其存在(-/-02(@E;+在各时期卵母细胞中都是均匀分布的!图($_*6*F")-/-02( @E;+在卵原细胞中的高表达提示$-/-02(基因在斑马鱼卵巢中可能起着与其在果蝇中相同的作用$即维持生殖干细胞’卵原细胞的自我更新和正常功能)在爪蟾中$-/-02同源物H4/=G!E;+在#期卵母细胞中定位于线粒体云!@81/D7/9308<=D=/-3"%!"&)在卵子发生中$H4/=G!E;+连同生殖质一起迁移至成熟卵母细胞的植物极皮层%(%$!%&$但它在卵子发生中并不翻译%(%&$提示其对卵子发生可能并无直接作用$而是作为母源物质储存在卵母细胞中$在未来胚胎>O6:的发育中起着作用)斑马鱼-/-02(@E;+在#*$期卵母细胞中也有较高表达$较晚期的卵母细胞中也能检测到!图($6*F")斑马鱼卵母细胞中的-/-02(E;+可能同样仅仅作为母源物质$留作调控胚胎>O6:迁移与发育之用$而对卵原细胞之后的卵子发生可能并无调控作用)是否果真如此$还有待研究)精子发生也是一个典型的干细胞系统$-/-02基因在该过程中同样有着重要作用)在-02基因突变雄蝇精巢中$精子束极少甚至没有$在精巢前部积累了比野生型多得多的初级精母细胞$表明这类细胞的分化延迟或受阻(同时-02基因突变雄蝇大多表现出致育缺陷$说明-02基因突变雄蝇的精子发生确实受到影响%!$&)在小鼠中$-02!基因主要在雄性生殖细胞中表达$-02*基因在迁移中的>O6:中表达)-02!基因敲除雄鼠和-02*基因敲除雄鼠的精巢发育不良$重量只有野生型的(+*$#周龄精巢中完全没有生殖细胞%%&)在人类成体组织中$-02(基因只在精巢中表达(在成熟精巢中$ -02(基因在生殖干细胞’精原细胞中表达最高$减数分裂中的初级精母细胞中也有表达$但在减数分裂后的生殖细胞中不表达%&&)本研究结果表明$在斑马鱼精子发生中$-/-02(基因在精原细胞中表达极高$在初级精母细胞中表达较低$在次级精母细胞*精子细胞及精子中不表达!图!$+*F")据此推测$-/-02(基因不仅对于维持生殖干细胞’精原细胞的存活与功能有重要作用$并且在随后的减数分裂中也可能起着调控作用)总之$斑马鱼-/-02(基因在生殖干细胞’卵原细胞和精原细胞中有极为活跃的表达$表明该基因应该对于生殖干细胞的维持与功能有着重要作用)在斑马鱼中$-/-02(基因如何维持生殖干细胞并维持的自我更新与功能还有待继续研究)参考文献#D"3"1"#="&$!%(&!U<9?6$Q27@<99E H;<9/:8:172=/D<=8X23./:1208/032120@8K 9<9189F0/:/.78=<H?*66$(&&($))#)*"!)#"3%!&!>8=/9^$U28:4=<1F+H+9<9/:7/@/=/?89=22D7H$*<*60F G E*-=$(&&"$(!#$(""(!("%’3%*&!^/D78X-[8f$,<9/B$f/4<5<:78,$;8:78@85<K I-g8:<Y<$6$ I-g8:<Y<C H J Z.02::8/9<932G/=-18/9<05D/9:20G<18/9/A9<9/:K 02=<123?292:89B530<H$*<M*-*2"<06$!’’’$!(’$$&(!)’!3 %#&!,-40<@<98<@$f$,253/-ZO H9/:K(<939/:K!$1Y/?292:02=<1K 231/F0/:/.78=<9<9/:$02?-=<12.08@/038<=?20@D2==32G2=/.K @291<93:-0G8G<=89?/*-015/A D+=+2*6*./-23$*<*60F E*-=$ (&&&$(!)$#%)(!#%"(3%$&!Q-8:^/:h-20<$6<05=I/008:1<==$N8S7/-$^<05Q/-f89?H+ @E;+=/D<=8X231/172G2?21<=D/012Z/A H*-0F:2//D512:29K D/32:<.0/1289Y817<-/-02G=8[2X89D 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*-=/6)+060.>$!’’’$!("$!!(!!!&"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""3欢迎订阅%动物学杂志&!!,动物学杂志-是由中国科学院动物研究所*中国动物学会主办的科技期刊$亦是中国自然科学核心期刊)主要报道动物学领域的最新研究成果$介绍有创见的新思想*新学说*新技术*新方法)报道范围既有宏观生态研究$又有微观实验技术)报道层次既有科学前沿性*资料性的$也有技术性*知识性的)稿件内容涉及范围广$实用性强$主要栏目有#研究报告*珍稀濒危动物*技术与方法*研究简报和快讯*科技动态等等)读者对象为动物科学领域的研究*教学*技术*管理人员及广大业余爱好者)根据中国科技信息所信息研究中心!’’#年发表的数据$,动物学杂志-各项统计指标有了很大的提高$除了被国内各大数据库收录外$已分别被国外著名数据库英国,动物学记录-*美国,化学文摘-*俄罗斯,文摘杂志-收录),动物学杂志-双月刊$()开$((!页$每册定价!$元$全年($’元$国内外公开发行)国内邮发代号#!M #!!(国外发行代号!6/32;/H "#_^$%)全国各地邮局均可订阅)如未能在当地邮局订到$可与编辑部直接联系)本刊对在校学生及个人订户"折优惠!直接与编辑部联系订阅")地址#北京市北四环西路!$号,动物学杂志-编辑部!!邮编#(’’’%’(电话#!’(’")!$%(#"$(J K @<8=#g /-09<="8/X H <D H D 9)网址#4803H D 789<g /-09<=H 921H D 9)欢迎投稿*欢迎订阅*欢迎刊登广告)’"#遗!传!"#"$%&’(!)*+,+-."!’’$!!!!!!!!!!!!!!!!!"卷!。

斑马鱼原位杂交试验方案

斑马鱼全胚胎原位杂交技术Form Dr. Kevin第一节原位杂交技术的历史Joseph G. Gall被誉为现代细胞生物学的一位奠基人，他在染色体结构和功能领域作出了杰出贡献，并发明了原位杂交技术（力situ hybridization，ISH）。

自Gall同他的研究生Mary Lou Paudue和Susan Gerbi在1969年利用放射性标记DNA在爪蟾组织切片中检测基因表达后，原位杂交技术逐渐发展为一种能使研究人员在一个染色体上定位并确定出基因和特殊的DNA序列的强大方法，推动了分子生物学的巨大进步。

Kathleen H. Cox于1984年发明了用单链RNA探针进行原位杂交的技术。

ISH技术在斑马鱼中的应用始于Westerfield等利用该技术在斑马鱼切片中检测基因的表达。

同年，Nusslein-Volhard等将Cox 建立的RNA原位杂交技术进行了改进，用地高辛（digoxin）标记的RNA在斑马鱼胚胎中检测基因表达。

2008年，Bernard Thisse等将该技术进一步优化，使之更敏感，也提高了基因表达检测的分辨率，我们在这里介绍的整胚原位杂交技术主要参照Thisse实验室2008年版本（Thisse, C. and Thisse, B., 2008, High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. protoc. 3 : 59 - 69）。

第二节原位杂交技术的原理原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。

原位杂交步骤-自己整理的1

原位杂交步骤-⾃⼰整理的1荧光原位杂交试剂及其配制⽅法（以下试剂均需⽤RNase-free⽔配制）：1×PBS：NaCl 8g⁄L、KCl 0.2 g⁄L、Na2HPO4 1.44 g⁄L、KH2PO4 0.24 g⁄L，溶于DEPC处理的去离⼦⽔中，⽤pH 计测其pH，再⽤NaOH调其pH为7.4；PBST：PBS加0.1%吐温-20；LiCI：配4M LiCI 100ml需要LiCI．H20 25.6g，配好后加⼊千分之⼀的DEPC，37℃，12h放置，⾼温灭菌。

4%多聚甲醛（4%PFA）：准确称取40g多聚甲醛，溶于1000ml的1×PBS中，避光于摇床（37℃，160r⁄m）上，待其全部溶解后，⽤棕⾊瓶分装成⼩体积包装，保存于－20℃。

（注：本⽅法与其他⼀些⽂献⽤NaOH和HCl先后调节pH⽽促其溶解的⽅法略有不同，因是考虑到pH的稳定性；另外之所以采⽤上述⽅法使多聚甲醛缓慢溶解⽽没有采⽤⽂献中提及的⽤NaOH调节其pH⾄10促其溶解后再⽤HCl调节pH的原因，除了⽤⼀般的pH试纸测量配置好的4%多聚甲醛的pH不够准确外，也因为不能⽤pH计对其酸碱度进⾏测量，因为它会损坏pH 计）。

取以上各成分，溶于DEPC处理过⼀定量的纯⽔（或双蒸⽔）中，测定其pH(放置⼀段时间待其pH稳定后)，据此以HCl或NaOH来调节其pH值⾄7.4，定容⾄所要求的体积。

（注：根据实际情况，因DEPC处理过的⽔其pH会下降，故本实验中实际上是⽤1mol⁄L的NaOH来调节其pH）。

75%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按75%（V／V）⽐例溶于PBST；50%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按50%（V／V）⽐例溶于PBST；25%甲醇／PBST：将⽆⽔甲醇按25%（V／V）⽐例溶于PBST；HYB－溶液：50%甲酰胺（V／V）、5×SSC（终浓度）、0.1%吐温-20（终浓度）、RNase-free⽔（－20℃）pH6.2HYB＋溶液：HYB－溶液、500ug／ml酵母tRNA、50ug／ml（终浓度）肝素，（－20℃）；pH6.250%甲酰胺／2×SSCT：50%甲酰胺（V／V），2×SSCT（终浓度）；2×SSCT：2×SSCT（终浓度），0.1%吐温-20；MAB马来酸缓冲液（Maleic acid buffer）：100mM maleic acid，150mM NaCl，pH 7.5(20℃)，溶于双蒸⽔，⽤浓缩或固体的NaOH调节pH 为7.5，并过滤除菌（sterile）MABT:MAB，使⽤前加⼊0.1%吐温-20；10×Blocking reagent（阻断剂）：将阻断试剂（Blocking reagent）溶于马来酸缓冲液中，摇晃并在加热器或微波炉上加热，使其终浓度为10％（w/v）；此储存液（原液）需⾼温除菌？（is autoclaved）并分装后保存于－20℃。

荧光原位杂交FISH实验步骤与方法(精选文档)

荧光原位杂交FISH实验步骤与方法（精选文档）（文档可以直接使用，也可根据实际需要修改使用，可编辑欢迎下载）FISH 实验步骤一、实验仪器：荧光显微镜:高速离心机：可达12000r/min高压灭菌锅：160C以上杀菌恒温箱：为杂交提供恒定温度恒温水浴锅照相机(与荧光显微镜配套)：荧光捕捉图片二、试剂的配制：1 、0.2mol/ L (pH7.4 磷酸缓冲溶液(PB试剂为NaH2P04 2H20 和Na2HP04 12H2O。

-----0. 2M 的NaH2P04溶液：31.2g NaH2P042H20,加蒸馏水1000mL溶解-----0. 2M 的Na2HP04溶液:71.632g Na2HP0412H2O 加蒸馏水至1000ml 溶解----0. 2M (pH7.4 磷酸缓冲溶液(PB : 19ml 的NaH2P04溶液和81ml 的Na2HP04溶液充分混合高压灭菌，常温保存。

2、0.03 mol/ L 磷酸盐缓冲溶液( (PBS)试剂为NaCl 和磷酸缓冲溶液PB——0.03MPBS溶液：22.8gNaCI , 150ml磷酸缓冲溶液(PB，加蒸馏水至1000ml，混匀——0.02 MPBS溶液：取100ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml——0.01 MPBS溶液：取50ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml高压灭菌，常温保存3、4%多聚甲醛溶液（1000ml）（在通风橱内进行操作）-----将略小于2/3体积的水（660ml）加热到50C,------40g多聚甲醛PFA，边搅拌边加入到水中，继续保持60C——1滴2mol/LNaOH溶液，立即澄清，但仍有小颗粒。

——1/3体积的PBS溶液，——用Hcl将pH调至7.2，定容，---- 用孔径为0.22卩谥勺滤膜过滤，—4 C保存最多保存两天，或者取少量保存在-20 C o（加热时温度不宜过高，为60C -65C，否则PFA容易降解，配置好后应尽快使用，否则固定效果较差）。

斑马鱼整体原位杂交protocal

整体原位杂交（WISH）（此实验需要全程在摇床上进行）1）胚胎准备，需确定胚胎地具体时间。

2）固定：将收取胚胎用4％PFA室温固定2h（或者4℃过夜）3）PBST漂洗胚胎，2次，5min/次4）分别用50％、100％甲醇溶液胚胎脱水，各1次，5min/次5）更换新鲜100％甲醇，并将胚胎储存在－20℃固定2小时(或过夜)6）复水：分别用甲醇：PBST为3：1，1：1，1：3溶液漂洗胚胎，各1次，5min/次7）用PBST漂洗胚胎2次，5min/次。

8）增加胚胎的通透性：proteinase K（10μg/ml，用PBST稀释）处理胚胎，24hpf胚胎5min，胚胎8min，3dpf胚胎15min，5dpf胚胎27min。

处理过后用，PBST漂洗，然后4％后固定，室温30-40min。

9）用PBST漂洗胚胎2次，5 min/次，同时HB 60℃预热10）预杂交：吸除PBST，加入HB，60℃，5min；更换新鲜HB溶液，60℃，3-4小时，68℃ 10分钟。

11）加探针：取出探针，取出迅速置于冰上；回收HB溶液，加入探针，60℃，过夜12）回收探针（可以重复使用3-5次），储存在－20℃，将50％甲酰胺/2×SSCT及0.2×SSCT 68℃预热，漂洗2次，20min/次13）分别用2×SSCT和0.2×SSCT溶液在68℃漂洗胚胎，各2次，20min/次14）PBST漂洗胚胎，2次，5min/次。

15）封闭：现配2％羊羔血清（PBST稀释）用做封闭，室温至少1h16）抗体：用2％羊羔血清稀释抗体（anti-dig-AP），1：5000，4℃，过夜（或1：2000,RT,2h）17）回收抗体（可以重复3次），用PBST室温下漂洗胚胎，2次，10min/次18）用buffer9.5T溶液孵育胚胎，2次，10min/次，目的是提供碱性条件19）加入NBT/BCIP染液，染色适当时间（20-60min），待信号显现，加PBST终止反应，3次，10min/次20）用4％PFA固定胚胎，室温固定1h后，PBST漂洗2次，10min/次21）将胚胎储存在70％甘油中，4℃保存，备用。

在拔尖人才教学中开设斑马鱼原位杂交实验探索

ｐｒｅｔｅｃｉｇＤｍｎｔｔｎＣｎｒｏｉｕｎＵｉｒｔｉｔｄｃｄｔｅｗｒｓｃｎａｒｏｅｏａｉ — ｂａｉ，ａｄｅｉｎｌａｈｎｅｏｓａｉｅｔｆｅａｎｖｓｙｎｏｕｅｏｌＳｅｏｄｍｊｄｌｒｎｓｚｒｓｍａＴｒｏｅＳｈｅｉｒｈｄｏｍｇｍｓｅｆｈｎ
常见模式生物有酵母、虫、蝇、线果斑马鱼、鼠、小拟南
芥等。而斑马鱼因其多方面的优点成为模式生物家族中重要的一员，到越来越多的重视和利用，受目前斑马鱼被广泛应用于发育生物学、传学、肿瘤学、物遗药
学、毒理与环保等方面的研究中。作为国家级实验教学示范中心，四川大学生物科
拔尖人才班学生实验所用斑马鱼为Ｔｂｇｎ系，ｕｉｅｎ
２ ℃ 淡水中饲养，用１８采４ｈ光照／０ｈ黑暗的光照周１
期。实验开始后，由学生自己负责斑马鱼饲养，同时对实验室性成熟的斑马鱼进行配对繁殖，收集各个发育时期的胚胎，进行前期脱水、固定、保存以备后面的实验使用。通过一段时间的饲养，学生不仅掌握了斑马鱼养殖与繁殖技术，并且能够了解斑马鱼胚胎发育的
结合中心的实验条件，秉承拔尖人才培养理念，我们设置了 “ 马鱼发育相关基因ｃｉ斑ｒ２原位杂交实ｐ
验 ” 具体实验方案如下。，
２１斑马鱼成鱼及胚胎培养．

斑马鱼相关实验操作

斑马鱼相关实验操作斑马鱼⼈⼯繁殖、受精和胚胎发育⼀、实验⽬的了解斑马鱼的⽣活和繁殖习性，掌握斑马鱼⼈⼯繁殖技术，了解斑马鱼受精、胚胎发育过程和形态模式形成的特点。

⼆、斑马鱼的⽣活和繁殖习性斑马鱼（Danio rerio）为热带鱼类，可在⼀年内多次产卵。

在合适的养殖条件下，4⽉龄的斑马鱼即性成熟；性成熟后每1-2周可以产卵⼀次，⼀条雌鱼⼀次可以产出数百颗卵⼦。

斑马鱼产卵受温度和光照长度的调节。

最适产卵⽔温为28.5℃，产卵的光调节周期为光照14⼩时，⿊暗10⼩时。

为防⽌⾃然产卵，性成熟的雌、雄斑马鱼必须分开养殖。

斑马鱼具有下列特点：1、繁殖周期短，不受季节限制，容易获得所需要的精⼦、卵⼦和胚胎材料。

2、⼩型鱼类，可在实验室⾼密度养殖，饲养成本低。

3、是脊椎动物，具有和⼈类相似的器官和组织。

4、体外受精、体外发育，胚胎培养条件简单。

5、胚胎透明，可以在活体上直接观察器官的发育。

6、发育周期短，在28.5℃温度下培养，受精后24⼩时即可以形成个体的基本结构。

因此，斑马鱼现在选择作为发育⽣物学研究的模式动物。

三、实验器材和材料斑马鱼养殖系统，⼤塑料盆（直径约58cm）两个，塑料筛框（直径约36cm）⼀个，中号塑料盆（直径约36cm）1个，加热棒，加⽓泵，12cm培养⽫若⼲，9cm培养⽫若⼲，数个胶头滴管。

曝⽓⽔10L。

性成熟雌、雄性斑马鱼。

四、实验内容和程序实验前⼀天的准备：1、在实验前⼀天的早上向2个⼤塑料盆中放⼤半盆⼲净的⾃来⽔，放⼊⽓泵和加热棒，将加热棒温度调整⾄28℃（每个加热棒都有差异，需要放⼊温度计，根据温度计指⽰的实际温度调节和校准温度计），以供斑马鱼催产繁殖时使⽤。

2、曝⽓⽔将⼲净的⾃来⽔烧开后冷却，将⽓泵放⼊其中进⾏曝⽓，以为培养胚胎之⽤。

3、斑马鱼的选取和催产雌雄鱼的鉴别：性成熟的雄鱼体型修长，腹部较⼩，⽽雌鱼腹部较⼤。

选鱼的时间在实验前⼀天的晚上，在选取斑马鱼之前需要喂⾷红⾍，喂⾷后1⼩时才开始选鱼。

斑马鱼整体原位杂交的技术改良

Ｏ，ｔｆｐｏｅｎｓｉｅｔｎａｄｓｂｔｔｏｏｒｔｎＳｉｍｅｏｒｔｉａｅＫｄｇｓｉｎｕｓｒｅｃｌｕａｉ．ＴｅｉｒｖｄｈｂｄｚｔｎｒｓｌｈｗｅＳｈｇｐｃｆｉｏａｏｈｍｐｏｅｙｒｉａｉｅｕｔｓｏｄＵｉｈｓｅｉｃ— ｉｏｓｉｔ，ｄｓｉｃｏｏａｉｎａｄｌｗｂｃｇｏｎｎｎｉａｅｒｃｉｌｍｅｈｄｏｅｒｆｈｅｒｏｗｈｌ — ｕｔｉｉｙｙｉｔｔｃｌｒｔｎｏａｋｒｕｄａｄｉｄｃｔｄａｐａｔｔｏｆｚｂａｓｍｂｏｅｍｏｎｎｓｔｈ — ｎｏａｉｙｕ
摘要：斑马鱼整体原位杂交技术广泛应用于基因表达谱、基因间相互关系和突变体筛选等方面，是研究斑马
鱼发育相关基因功能的重要技术。本文从杂交探针的制备、度的选择和洗脱以及胚胎的脱色、白酶Ｋ消浓蛋
化、底物显色等方面进行了摸索、进及简化，得了背景低、色清晰、改获着特异性高的实验结果，预示了简单实
ＦＡＮｎ－ｅＨｏｇｙ，ＰＥＮＧＺｏｇｌ，ＸＥＨｕ－ｉｇ，ＹＡＷｕｚｏｈｎ —ｕＩａｐｎＵＮ —ｈｕ，ＷＡｕ — ｕＮＧＹｅｑｎ，ＤＥＮＧｒｎ，ＷＡｏｇｑ，ＭＯＸｉｏｙｎｕＮＧＹｎ－ｉａ — ａｇ，Ｌｏｇ— ｉｇ，ＩＹｎｑｎＸｉ —ｈｈｕｓａ

斑马鱼(Danio rerio)胚胎免疫反应:补体基因在早期胚胎以及LPS刺激胚胎中的表达

斑马鱼(Danio rerio)胚胎免疫反应：补体基因在早期胚胎以及LPS刺激胚胎中的表达李宗耀;杨雨佳;张士璀;汲广东【摘要】以模式生物斑马鱼(Danio rerio)为研究对象,使用原位杂交及实时荧光定量PCR方法,对斑马鱼补体基因(C3,C4,C9,Bf1,Bf2,Bf3)及其调节因子(RCA2.1,RCA2.2)在早期胚胎中的时空表达模式及LPS刺激后表达量的变化进行了研究.结果表明,上述基因在胚胎早期(卵裂期至体节期)均为泛表达,从受精后24h至幼鱼阶段特异性表达于肝脏及消化道等器官.对胚胎显微注射LPS后,C3、C9、Bf1、Bf2、Bf3基因在早期胚胎中表达上调,RCA2.1基因表达下调,这与斑马鱼成鱼受到革兰氏阴性菌感染后补体分子(C3,C9,B因子等)的反应类似,表明其参与补体激活途径、溶膜途径及补体调节,提示斑马鱼可在胚胎发育早期构建补体系统,参与急性期反应等免疫反应.【期刊名称】《海洋与湖沼》【年(卷),期】2015(046)006【总页数】7页(P1444-1450)【关键词】补体;斑马鱼;胚胎;LPS;表达模式【作者】李宗耀;杨雨佳;张士璀;汲广东【作者单位】中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所青岛 266003;中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所青岛 266003;中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所青岛 266003;中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所青岛266003【正文语种】中文【中图分类】Q786斑马鱼(Danio rerio)是脊椎动物的模式生物,与大多数鱼类相似,均为体外受精并发育。

在胚胎发育过程中,鱼卵暴露于水中,同水中大量的病原微生物直接接触。

这就引出一个问题,鱼类胚胎在发育过程中是如何保护自身免受外源微生物入侵的？鱼类的特异性免疫于脊椎动物中发育程度较低,免疫球蛋白种类和数量均有限,已有的研究表明,与鱼类特异性免疫相关的基因(Rag2,AID,TCRAC,IgLC-1,mIg,sIg,IgZ和DAB)直到胚胎受精后8天才对LPS诱导有强烈反应(Li et al,2011),说明在胚胎发育早期,特异性免疫尚未成熟,非特异性免疫尤其是补体系统在胚胎发育中的构建对其抵御外界病原体的入侵具有重要的意义。

斑马鱼整体原位杂交详细步骤

收集斑马鱼的胚胎，在Holfretor水中培养，到达所需要的发育时期时，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小时后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后换成甲醇，在-20C 保存，待用(两天和两天以上的胚胎需要用双氧水处理，去除色素。

或者使用苯锍脲稀溶液培养，可阻断色素的形成)一. 原位杂交第一天1. 重新水化和固定1）吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分钟。

2）置换成30%甲醇的PBST溶液，放置5分钟3）置换成PBST溶液，放置5分钟，重复一次4）置换成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟5）用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。

蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步）1）用10ul/ml的蛋白酶K在室温下处理胚胎。

5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。

发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。

2）用PBST溶液轻洗，在PBST中放置5分钟。

3）用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟，室温。

4）用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。

2. 预杂交1）每个管中置换成大约300ulHYB－溶液，60℃水浴5分钟，避免振荡。

2）用等体积的HYB+取代HYB－。

3）60℃水浴，预杂交4小时以上。

3. 杂交1）吸去预杂交的HYB+，加上100ul已加入探针的HYB+溶液（探针浓度约为1ng/ul）..2）60℃ 温浴过夜。

注：杂交与预杂交的温度可以是55到60度不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。

二. 原位杂交第二天1.1）将探针回收，放于－20C保存(通常探针可重复使用十次左右)。

2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分钟，重复一次。

3）置换2XSSCT1ml，60℃，放置15分钟。

4）置换0.2XSSCT1ml，60℃，放置30分钟，重复一次。

整胚原位杂交

组织学与病理学技术实验报告实验名称：使用整胚原位杂交方法定位观察斑马鱼胚her4 基因的表达使用整胚原位杂交方法定位观察斑马鱼胚胎her4 基因的表达一、实验目的：1）通过本实验掌握原位杂交的基本原理及方法。

2）观察her4基因在斑马鱼胚胎的表达位置。

二、实验原理：原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。

字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。

原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。

这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。

整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。

整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。

我们这儿所介绍的一种原位杂交的方法是通过后者，以地高辛标记探针，然后用酶联抗体的方法进行检测。

三、实验试剂及仪器1、实验试剂：系统水、4%聚甲醛、PBS溶液、甲醇（70%、50％、30％）、蛋白酶K的PBST溶液（在管中原有的约1mlPBST中加入1 μl 10mg|ml的蛋白酶K，终浓度10 μg|ml）、H2O2（3%H2O2；0.5M NaOH）、PBST溶液、HYB 溶液、RNA探针、50%甲酰胺、2×SSCT溶液、0.2×SSCT溶液、MABT、阻断溶液、羔羊清:MABT=1:9的溶液、AP底物染色缓冲液。

基因工程综合实验---转基因斑马鱼的构建

基因工程综合实验---转基因斑马鱼的构建一、实验目的本实验的教学目的是通过构建转基因斑马鱼的表达载体、利用显微注射法制备转基因斑马鱼及转基因个体的鉴定等实验让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，熟悉转基因动物的制备过程，培养学生利用基因工程的原理和技术进行生命科学基础理论和应用研究的基本思路和实验设计能力。

二、实验原理转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力。

转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学的基本问题提供了一个更有效的工具，成为探讨基因功能及其调控机理、致癌等疾病基因的作用机理与调控机制不可或缺的研究手段，转基因技术也是生物学领域最具应用价值的实用技术，已经渗透到医学、畜牧学、农业生产及工业生产等各个方面，同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。

转基因动物的制备涉及外源目的基因的获取、重组表达载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、外源目的基因导入、转基因个体的检测等方面的内容。

本次实验动物选取斑马鱼作为实验材料。

斑马鱼(Danio rerio)是属于辐鳍亚纲(Actinopterygii)鲤科(Cyprinidae) 短担尼鱼属(Danio)的一种硬骨鱼，产于印度东部、巴基斯坦、缅甸以及孟加拉国的小溪、稻田及恒河中游地区，是一种常见的热带观赏鱼，因其斑马鱼饲养所需空小、成本体侧具有像斑马一样纵向的暗蓝与银色相间的条纹而得名。

間低，且斑马鱼生活史短，2-3 个月即性成熟，生活周期容易控制，每次可产卵100-200颗，胚胎透明且大，容易操作和观察，所以用斑马鱼制备转基因动物具有明显的优势。

三、实验内容与学时分配序号实验内容与名称实验类型与性质学时分配每组人数1 转基因质粒的转化专业技术实验 3 42 转基因质粒的大量提取专业技术实验3 43 重组表达质粒的酶切检测专业技术实验 3 4专业技术应用 3 44 受体系统鱼受精卵的获得及培养专业技术应用 6 45 用显微注射法制备转基因斑马鱼6 转基因斑马鱼的表型鉴定专业技术应用 3 4四、材料、试剂与设备4.1 菌株及斑马鱼DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃。

原位杂交技术步骤

1.For each probe (control and experimental), set up a separate 100-ml PCR in a 0.5-ml sterile tube, as tabulated below. Either.cDNA inserted in plasmids or genomic DNA can be used as templates for the PCR (see REAGENT SETUP for details on primer design).每个探针(实验组和对照组),在0.5 -ml无菌管设立一个独立的100毫升PCR,正如下面的表。

另外。

互补脱氧核糖核酸插入到基因组DNA质体或可用作模板PCR(见试剂设置有关底漆设计)。

**注意关键：1.很多版本的实验反义核酸探针可以作为一种控制背景染色(见试剂设置)。

然而,我们相信最好的方法来演示特异性是获取相同的空间限制表达模式使用不同的非重叠探测器相同的基因。

2.小心不要污染pcr.使用无菌试管和过滤器的技巧和戴手套3.另外,PCR扩增,cDNAs质粒中可以使用约束线性化酶,独特的站点位于5¢(反义核酸探针)或3¢(对感官探测)来插入。

净化的线性DNA可以通过苯酚/氯仿萃取乙醇沉淀紧随其后。

2| Run the PCR using the conditions tabulated below.使用下面列出的条件运行PCR**暂停点：把扩增好的pcr产品放4℃降温和在-20℃贮藏几个星期。

3| Add the 100-ml PCR to a Microcon YM-50 column and add 400 ml of sterile water. Centrifuge for 15–20 min at 1,000 g at room temperature.加入100毫升PCR到Microcon YM-50列并加入400毫升的无菌水。

斑马鱼的酶D由17号染色体上的D基因编码

基因与质粒重组，需要的两类限制性核酸内切酶是和 DNA连接酶。将重组质粒显微注射到斑马鱼受精卵中，整合到染色体上的G基因表达后，使胚胎发出绿色荧光。
（2）根据上述杂交实验推测： ①亲代M的基因型是 b （选填选项前的符号） a. DDgg b. Ddgg ②子代中只发出绿色荧光的胚胎基因型包括 b、d （选填选项前的符号） a. DDGG b. DDGg c. DdGG d. DdGg 红色：dd 绿色：G
不显红色：D 不显绿色：gg
Ddgg
D gg
D G
DdGg
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
D G DdGg DDGg
ddgg
D gg DDgg Ddgg
ddG ddGg
（3）杂交后，出现红· 绿荧光（既有红色又有绿色荧光）胚胎的原因是亲代 N （填“M”或“N”）的初级精（卵）母细胞在减数分裂过程中，同源染色体的非姐妹染色单体发生了交换，导致染色体上的基因重组。通过记录子代中红· 绿荧光胚胎数量与胚胎总数，可计算得到该亲本产生的重组配子绿荧光胚胎数/胚胎总数）。占其全部配子的比例，算式为 x =4*（红·
高考生物真题讲解
题目
斑马鱼的酶D由17号染色体上的D基因编码。具有纯合突变基因（dd）的斑马鱼胚胎会发出红色荧光。利用转基因技术将绿色荧光蛋白（G）基因整合到斑马鱼17号染色体上，带有G基因的
胚胎能够发出绿色荧光。未整合G基因的染色体的对应位点表示
为g。用个体M和N进行如下杂交实验。
（1）在上述转基因实验中，将G
1.基因工程的基本操作
2.基因型的推断（基因分离定律和自由组合定律）
3.重组配子的比例计算等
谢谢！
M：Ddgg N：DdGg