重组体的筛选和鉴定

GFP 老鼠
GFP- Kac的狗
GFP Alba 發青綠光 芒的 兔子



①新霉素磷酸转移酶基因（NPTⅡ）抗新霉素、卡 那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选动 植物转化子的选择标记基因。 ②潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）赋予转化子能抗 潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物 转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。 ③氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）也被用于筛选动 植物转化子的标记基因。
缺点：需要电镜！
2. Northern blotting
用DNA（或RNA） 探针检测RNA样 品。 主要检测插入片 断是否被转录。 从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。
Northern Blotting
Western Blotting
Southern和Western印迹法
32P-labled
8 重组体的筛选和鉴定
筛选（Screening）
遗传表型（phenotype）：是生物体遗传组成同环境 相互作用所产生的外观或其他特征。

本章教学目的和要求：
掌握常用的抗生素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶 联免疫吸附测定（ELISA）和免疫印迹（Western blotting）法的原理；了解转译筛选法和真核生物的报道 基因筛选法。
DNA Electrophoresis frangment
Transfer of DNA by blotting
DNA probe
Autoradiography
Agarrose gel
Nitrocellulose sheet
Add radiolabled spesfic antibody , Wash to remove unboud antibody
8.1
遗传学检测法
一、利用载体提供的表型特征筛选重组体 1 抗药性标记及其插入失活选择法 原理： pBR322质粒上有两个抗生素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I;
Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
因插入外源DNA而导致基因失活的现象称之为插入失活效应。
复印至硝酸 纤维素膜上
细菌菌落
用NaOH菌体裂解 DNA变性
单链DNA结 合到膜上
32P-cDNA
杂交
放射自显影
原位杂交筛选 DNA重组体图解
与放射性cDNA杂 交的菌落的斑点
（2）R-环检测法 1）原理： DNA-RNA杂交
2）选择过程 用外源基因的mRNA与重组载体杂交。 在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复 性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNADNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环 形结构。
无环丝氨酸培养基
氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
2.蓝白斑筛选法
乳糖
-半乳糖苷酶
半乳糖
Xgal
半乳糖
+ +
葡萄糖
5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
原理：
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺 失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因 组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
筛选植物转化细胞常用的报告基因 报告基因（reporter gene）：系指其编码产物能 够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经 成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表 达活性的一类特殊用途的基因。

报道基因（reporter gene) （1）大肠杆菌的β-D-葡萄糖苷酸酶 （β-D-glucuronidase，GUS）； （2）细菌和萤火虫的荧光素酶 （luciferase）； （3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因 （Green Fluorescent Protein）。 （4）其它
（3）环丝氨酸：
杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
选择过程：
（1）四环素抗性插入失活 如果在Tetr上插入外源DNA，导致四 环素抗性基因失活，可用四环素加环 丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
重 组 分子量 克 Marker 隆
载体
二、酶切电泳筛选法-物理检测法 1. 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电 泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
A
B
A或B

⑥抗除草剂bar基因

bar基因编码磷化乙酰转移酶（PAT），使转化子 对含有磷化麦黄酮（PPT）成分的除草剂具有抗性。
⑦冠瘿碱合成酶基因



主要包括胭脂碱合成酶基因和章鱼碱合成基因两 类，存在于土壤农杆菌Ti质粒的T-DNA区段。 冠瘿碱合成酶基因在植物细胞中的表达产物可以 催化一些特殊反应，通过电泳分离及菲醌荧光染 料染色，方便地观察，据此作为报告基因用于转 植物基因细胞的筛选。 冠瘿碱合成酶基因在植物基因工程早期应用较多， 现已逐渐被其他更为理想的报告基因所取代。
筛选哺乳动物转基因细胞常用的报告基因


在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移酶 (Cat) 基因和新霉素磷酸转移酶(NptⅡ)基因也可用于哺乳 动物转基因细胞的筛选。 常用的标记基因还有： -- 胸腺核苷激酶基因（TK） -- 二氢叶酸还原酶基因（DHFR） -- 黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（XGPRT）


二、利用插入序列提供的表型特征筛选
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。 一、原理： 1.弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。 受体菌： his外源基因： his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。
Autoradiogram
Transfer prຫໍສະໝຸດ teinAutoradiography
Protein band detected by specific antibody
SDS-Polyacrylamide gel
Polymer sheet
Autoradiogram
8.4 免疫化学类检测法
对表达产物的检测。蛋白—蛋白“杂交” 利用抗体作为“探针”来检测转入受体 菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。
限制片段
琼脂糖电泳
DNA分子
Southern Blotting
带有DNA片 段的凝胶
用缓冲液 转移DNA
转移至硝酸纤维素膜上
凝胶 滤膜 与放射性标记 DNA探针杂交
吸附有DNA 片段的膜
放射自显影
Southern blot
-
+
探针
（1）原位杂交筛选 特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。

重点：
常用的抗菌素抗性筛选、蓝白斑筛选、酶切筛选、酶联免 疫吸附测定（ELISA）

难点：
免疫印迹（Western Blotting）法的原理


转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。 非转化子：未接纳载体或重组分子的转化细胞。 重组子：含有重组DNA分子的转化子。 非重组子：仅含有空载载体分子的转化子。 期望重组子：含有目的基因的重组子。 非期望重组子：不含有目的基因的重组子。
例： 小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶有抗性。
DHFR 转化受 体菌
连接
载体
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
8.2 DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。 一、直接电泳检测法 从转化后的菌体克隆 中分离质粒，电泳、 比较其分子量。
几种报道基因的作用原理
紫外光照 GFP 发绿色荧光 GUS 荧光产物
4-甲-β-D-葡萄糖苷酸
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸 GUS
蓝色水解产物
Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP
转入萤火虫 的luciferase 的烟草


⑤萤火虫荧光素酶基因（LUC）

LUC表达产物萤火虫荧光素酶（LUC）在Mg2+的作
用下，可以与荧光素和ATP底物发生反应，形成与 酶结合的腺苷酸荧光素酰化复合物，经过氧化脱 羧作用后，该复合物转变成为处于激活状态的氧 化荧光素，可以用荧光测定仪快速灵敏地检测出 产生的荧光，是目前研究动植物转基因很好用的 一种报告基因。 Luc基因检测十分迅速，灵敏度高，成本低，不存 在放射性同位素检测对人体健康和环境生态所造 成的危害，也没有内源荧光产生的背景干扰，因 此，Luc是一种理想的报告基因。
32P
重组克隆与探针杂交
或 125I 。
荧光素、生物素 地高辛
二、核酸杂交检测方法 1. Southern blotting
用DNA （或RNA）探针检测DNA样品。 从宿主细胞中提取DNA（或质粒 载体），再用探针杂交。
只有带有插入片断的重组载体才能 与探针杂交，在底片上曝光显示。
限制性酶切割
PstI酶切
外源DNA 黏性末端 连接酶 PstI酶切
pBR322 4363
重组子(ampstetr) 空载体(amprtetr) 插入子(ampstets)
导 入