周建平-药品热原检查跟细菌内毒素检查方法介绍资料文档
热原检查法
热原检查法第一篇：热原检查法【关键词】热原检查法细菌内毒素检查法热原热原是微生物的代谢产物，系能引起恒温动物和人体体温异常升高的至热性物质。
当注入人体含有热原的量达0.01微克/千克以上的输液时，即可产生热原反应。
《中华人民共和国药典》同时收载了热原检查法（家兔法）和细菌内毒素检查法(鲎试剂法）对输液进行热原检查。
我们对我院临床使用的哈尔滨三精艾富西药业有限公司生产的10个批次0.9%氯化钠注射液液，进行了两种方法联合应用的尝试，收到了良好效果。
1资料与方法1.1研究对象哈尔滨三精艾富西药业有限公司生产的规格为500 ml0.9%氯化钠注射液，批号为:50307A、50411C、50513A、50716A、50910A、50910C、51008A、51116A、51128C、51215C。
1.2试验材料细菌内毒素国家标准品：批号为20056（100EU/支）,厂家为中国药品生物制品鉴定所。
鲎试剂：批号为0507250（0.25EU/ml），厂家为湛江安度斯生物公司。
健康合格家兔（雌兔无孕），1 ml刻度吸管，5 ml试管，20 ml玻璃注射器，肛温计，250 ℃电热恒温烤箱，漩涡混合器、电热恒温水浴箱。
(见表1) 表10.9%氯化钠注射液检查结果（略）1.3方法与结果将上述10批次哈尔滨三精艾富西药业有限公司的0.9%氯化钠注射液，分别按照《中华人民共和国药典》（2000版）附录规定的热原检查法（家兔法）和细菌内毒素检查法（鲎试剂法）的标准进行检查，结果见表1。
2讨论从以上检查结果不难看出，两种方法对同批次的产品进行检查，结果出现了偏差，通过临床跟踪调查，上述批次产品用于临床均未发生热原反应。
内毒素检查法（鲎试剂法）检查热原可靠性强，且操作简便，成本低，省时，省力，是热原检查的发展方向。
相比之下相对古老的热原检查法（家兔法）就显得操作繁琐，成本高，即费时又费力，家兔容易受周围环境、温度、噪声等干扰而影响检查结果。
卫生学检查技术—热原和细菌内毒素检查法
若均为（+），判定供试品不符合规定；
若2支供试品管中1支为(+)，1支为(−)，则另取4支复试，4 支中有1支为(+)即认为不合格。
四、注意事项
1．防止鲎试验用水被污染； 2．开启内毒素标准品和鲎试剂时，要将粘附在安瓿瓶上 的粉末尽可能弹落下去。用砂轮划过安瓿后，要用酒精 棉（最好能用沾异丙醇的无纺布，以避免产生假阳性结 果）擦拭，防止开启时玻璃屑落入安瓿内。开启内毒素 标准品时，要在安瓿曲颈上部，并尽可能保留较长的安 瓿颈，准确加入1.0ml鲎试验用水复溶。
（二）检查方法 即凝胶法和光度测定法。凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集
反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。是中国药典的“仲裁” 方法。
二、仪器和试剂
37±1℃恒温水浴或适宜的恒温器具、超净工作台、漩涡混合器 、内毒素工作标准品、加样器、鲎试剂、鲎试验用水、pH调节剂等 。
鲎试剂
漩涡混合器
加样器
三、测定方法
实验流程
供试品
限值确定
最大有效稀释倍数（MVD）确定
供试品干扰实验
正式实验
结果判断
供试品内毒素检查：凝胶限度试验
编号
A B C D
内毒素浓度／被加入内毒 平行管
素的溶液
数
无／供试品溶液22λ／供试Fra bibliotek溶液2
2λ／检查用水
2
无／检查用水
2
A为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为 阴性对照。λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml)。
将试管轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37±1℃的恒温 器中，保温60±2分钟后，将试管取出，缓缓倒转180°，若 管内凝胶不变形，不从管壁脱落为阳性(+)，凝胶不能保持 完整并从管壁脱落为阴性(-)。
细菌内毒素检查法与家兔法同步检测丹参川芎嗪注射液热原的比较
细菌内毒素检查法与家兔法同步检测丹参川芎嗪注射液热原的比较目的考察細菌内毒素检查法和家兔法对丹参川芎嗪注射液检查的可行性。
方法采用《中国药典》2010年版一部附录细菌内毒素检查法，对家兔试验进行比较试验。
结果丹参川芎嗪注射液稀释至160倍时，用灵敏度为0.06 EU/ml的鲎试剂进行实验，干扰消失。
家兔热原检查法与细菌内毒素检查法相吻合。
结论采用细菌内毒素检查法和家兔检查法检测丹参川芎嗪注射液热原均可行。
标签：丹参川芎嗪注射液；细菌内毒素；干扰试验；热原丹参川芎嗪注射液为复方制剂，其组分为盐酸川芎嗪和丹参素。
临床用于闭塞性脑血管疾病，如脑供血不足、脑血栓形成、脑栓塞及其他缺血性心血管疾病[1]。
目前《中国药典》2010年版并未收录该品种，本品的现行标准是国家药品监督管理局国家药品标准（试行）WS-10001-（HD-1138）-2002，该标准规定了热原检查法，参照《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅧB中药注射剂安全性检查法应用指导原则，该标准的热原检查剂量设计不符合《中国药典》规定，而且无细菌内毒素检查的规定。
为此，本文对本品进行了细菌内毒素检查和热原检查的方法进行研究，报道如下。
1 材料与方法1.1 仪器MS-1型旋涡振荡器（德国IKA）；SUB14型四孔水浴锅（英国GRANT）。
1.2 试剂鲎试剂（TAL）：规格均为0.1 ml/支，湛江安度斯生物有限公司，批号为1109011和1305131，标示灵敏度分别为0.25 EU/ml和0.06 EU/ml；福州新北生物工业有限公司，批号为12020912和12070312，标示灵敏度（λ）分别为0.25 EU/ml和0.06 EU/ml。
细菌内毒素工作标准品（CSE）：中国药品生物制品检定所，批号为150601-201174，规格160 EU/支。
细菌内毒素检查用水（BET水）：湛江安度斯生物有限公司，批号为1109020，规格50 ml/支。
细菌内毒素检查方法研讨(doc 9页)
细菌内毒素检查方法研讨(doc 9页)细菌内毒素检查法1 目的该SOP用来判断供试品中细菌内毒素是否符合规定。
2适用范围该SOP适用于《中国兽药典》要求检查该项的药品和适合《中国兽药典》要求的其它品种的药品的细菌内毒素检查。
3职责进行该项检验的检验员应该按该SOP进行检验，检测室主任负责监督该SOP的正确执行。
4检验4.1 技术依据及原理本法系用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应即内毒素在二价阳离子的参与下，作用于鲎血凝集酶系统而发生的一系列酶联反应，最后形成凝胶，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合行。
4.2.4用移液管或刻度吸管等吸取样品时，须使用洗耳球，勿用嘴吸、吹，防止唾液溅入。
也可使用加样器等其它方法。
4.2.5 注意所用鲎试剂的批号、有效期、规格、灵敏度等。
4.2.6进行干扰实验时，标准对照和供试品阳性对照（含供试品的内毒素溶液）应同时进行。
4.2.7在进行灵敏度复核、干扰试验和供试品内毒素检查时，各个实验所要求的对照应同时进行，并在有效的条件下才能进行计算和判断。
4.3材料、仪器、试剂的准备及基本要求4.3.1天平供试品称量用，感量为0.1mg 以下。
4.3.2电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持250℃以上至少一小时。
4.3.3恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在37℃±1℃保持一小时。
4.3.4 水银温度计或酒精温度计，精度在1℃以下。
4.3.5 旋涡混合器4.3.6 鲎试剂，应具有国家主管部门的批准文号。
4.3.7细菌内毒素国家标准品（NSE），细菌内毒素工作标准品（WSE）。
4.3.8 细菌内毒素检查用水（BET水）系指与灵敏度为0.03Eu/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37℃±1℃条件下不产生凝集反应的灭菌注射用水。
4.3.9实验用具移液管（或刻度吸管，定量移液器）、凝集管（10×75mm）、三角瓶、小试管（16×100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮。
细菌内毒素和热原检查法
热原通常是指能够致热的微生物的尸 体及代谢产物，主要是细菌的内毒素。
细菌内毒素：主要存在于革兰氏阴性 细菌的细胞壁内，菌体裂解时释放出来。 是磷脂，脂多糖和蛋白质组成的复合物， 复合物中的脂多糖是内毒素的主要成分， 具有特别强的热原活性。
热原的致热机理：细菌内毒素， 病毒，细菌及其他微生物，类固醇或 某些材料释放热原质，作用于动物体 单核细胞，巨噬细胞等靶细胞后，促 使其产生内生性热原，作用于下丘脑 体温调节中枢，结果使动物体温升高。
细菌内毒素病毒细菌及其他微生物类固醇或某些材料释放热原质作用于动物体单核细胞巨噬细胞等靶细胞后促使其产生内生性热原作用于下丘脑体温调节中枢结果使动物体温升高热原反应给临床治疗带来极大的危害一般热原进入人体后数分钟至1小时内即会出现高热症状反应严重者会造成死亡故必须严格控制
细菌内毒素和热 原检查法
郝树彬
实验原理
细菌内毒素在钙离子，镁离子参 与下，激活鲎试剂中c因子，活化的c因 子激活b因子，活化的b因子激活凝固 酶原生成凝固酶，促使凝固蛋白原生成 凝固蛋白，在支联酶作用下形成凝胶。
内毒素
C因子
活化c因子
某些非热原物 质
G因子
B因子 凝固酶元
活化b因子 活化g因子
凝固酶
凝固蛋白原
凝固蛋白
凝胶
实验试剂：
基础知识
热原：注入人体后可引 起发热反应的物质。
1 材料的致热性。 2 因微生物污染造成的热原反应。
热原的检查方法
体内热原检查法——兔温法（PT) ——是一种体内的、全热原的检查方法。1942
年USP12版第一次收载。各国药典至今仍在使 用。 体外热原检查法（ITP) ——是一种体外的利用人血细胞反应的全热原 检查法。尚未有药典收载，欧洲药典将会收载。 细菌内毒素检查法（BET) ——医药工业普遍接受控制内毒素等于控制热 原。
细菌内毒素检查法讲义
鲎试剂灵敏度复核试验
内毒素浓度 2λ
● ● 鲎试剂 平行管 ●
λ
0.5λ 0.25λ
阴性对 照
终点
●○ ○
○
λ
●○ ○
○
λ
●● ○
0.5λ
●●● ○
0.5λ
λc=lg-1[(lgλ+lgλ+lg0.5λ+lg0.5λ)/4]=0.707λ
如果供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD 取1，计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L ；
适用于供试品为固体的情况。计算得到的最小有 效稀释浓度即为MVD下的该供试品的浓度。
例：注射用阿莫西林钠 计算限值为0.15EU/mg，使用灵敏度为0.125EU/ml
的鲎试剂进行检验。 最小有效稀释浓度 c ＝0.125 EU/ml÷0.15EU/mg＝0.833mg/ml
菌、抗体-抗原复合物、细胞分裂素）
热原和内毒素的关系：
热原是否就是内毒素？ 在学术上仍有争议，热原不仅是细菌内
毒素。但在药检的范畴，细菌内毒素是 主要的热原物质，可以说无内毒素就无 热原，控制内毒素就是控制热原。
三、鲎
鲎(horseshoe crab)是一类与三叶虫 (现在 只有化石)一样古老的动物。鲎的祖先出 现在地质历史时期古生代的泥盆纪，当 时恐龙尚未崛起，原始鱼类刚刚问世， 随着时间的推移，与它同时代的动物或 者进化、或者灭绝，而惟独只有鲎从4 亿 多年前问世至今仍保留其原始而古老的 相貌，所以鲎有“活化石”之称。又具 有很高的药用价值。
进行检验。 需先称取一定重量的注射用阿莫西林钠，在已除去外源性
细菌内毒素检查方法
细菌内毒素检查方法综述【关键词】细菌内毒素检查法；,,,机理；,,,预实验；,,,特殊值细菌内毒素检查是静脉、鞘内给药药物以及放射性药物等质量检查的一个重要方面。
以前，细菌内毒素检查用家兔热原法进行，自从1980年《美国药典》第20版收载了细菌内毒素实验以来，《英国药典》《欧洲药典》《日本药局方》《中国药典》等相继收载了该方法。
1995年《美国药典》第23版已收载了471种药品进行细菌内毒素检查，而《中国药典》1995年版也收载了12种药品进行细菌内毒素检查［1］，2000版更收载有47种药品利用此方法进行热原检查。
细菌内毒素检查法已逐渐代替家兔热原检查法，显示出其在检查热原方面的重要性。
本文对细菌内毒素检查法作一综述。
1 方法、机理及影响因素1.1 应用的方法目前，美国药品食品管理局（FDA）承认3种鲎试剂检测细菌内毒素含量的方法，即凝胶（gelclot）法、生色（chromogenic）法和动态浊度（keniticturbidimetry）法［2］。
近年来较新的方法有水箭电泳免疫法（测残余蛋白）、酶联免疫吸附法（测残余酶）。
后者所需鲎试剂仅相当于凝胶法的1/100，且灵敏度更高，抗干扰能力更好。
《中国药典》1995年版只采用凝胶法。
凝胶法是将等体积的供试品溶液和新配制的鲎试剂（TAL）溶液在试管中混匀，一般各0.1 ml，（37±1）℃反应（60±2）min。
如果被检测的溶液不含干扰凝集反应的因素，且其含有内素素浓度等于或大于所用鲎试剂的灵敏度（λ）时，就会在试管中显示阳性反应，即形成凝胶；否则呈阴性反应，即呈澄明溶液或轻度混浊，视内毒素的浓度而定［1］。
该反应极其灵敏，凝胶形成速率与内毒素浓度成正比，并受温度、反应物中Ca2 /Mg2 离子浓度和pH等因素的影响［3］。
同样，《中国药典》2000年版也只采用凝胶法。
淘金者1.2 凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理见图1。
图1 凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理（略）2 影响细菌内毒素检查的因素2.1 检品的干扰pH值、离子浓度以及某些干扰成分，都会影响到检查结果的准确性，得到所谓“假阳性”或“假阴性”结果。
细菌内毒素检测
1
概述
前言
细菌内毒素
一、前言
热源检查易受试验动物个体差异、方法灵敏度、 药物本身性质的影响，受到一定限制，与家兔 热原法相比，细菌内毒素检查法具有劳动强度 低，实验成本小等特点，还可以通过对原料、 活性成分、灭菌水、容器、赋形剂和终产品的 细菌内毒素检测，对生产过程进行质控，更明 显的特点是可以定量检测药品生产过程中可能 污染的痕量内毒素，为区分干扰作用与内毒素 污染提供了极为重要的技术手段。
干扰无法去除 选择其他方法
2006年6月 山东省药品检验所 26
1 内毒素限值的确定
一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素 限值要求？样品的内毒素含量是多少？与前 一批的结果比较相差多少？与内毒素限值含 量相差多少？ 这些问题不但关注用药安全，同时也考虑了 生产环境的内毒素含量变化。 因此，一个完善的细菌内毒素检查法的建立， 除了要满足法规相关的强制性要求，保证临 床用药人群的安全外，还应该最大限度的提 供有关内毒素含量的信息，为药品生产过程 的质量控制提供警戒信息。
2006年6月
山东省药品检验所
22
三、方法学验证注意事项 一个全面可靠的细菌内毒素检查法的方法 验证实验一般应注意：首先要了解产品的 溶解度，按照适当的临床用量确定合适的 内毒素限值，并确证产品对方法是否存在 干扰，如果在样品处理过程中运用了激烈 的处理条件或溶剂，还应证明所采用方法 不会破坏或减少样品中细菌内毒素含量。
2006年6月
山东省药品检验所
9
3 鲎试剂凝胶反应的特征
⑴随着鲎试剂反应的进行，凝固蛋白不 断增加，伴随凝聚的形成，光密度也会 增加。 ⑵内毒素的浓度决定了光密度增加的速 率。 ⑶凝胶形成反应呈S型曲线（分为初期的 平台期、快速增长期和后期的平台期）。 这些特性构成了各种检测方法的理论基 础。
(2021年整理)细菌内毒素检查法与实验分析
细菌内毒素检查法与实验分析编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（细菌内毒素检查法与实验分析）的内容能够给您的工作和学习带来便利。
同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。
本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为细菌内毒素检查法与实验分析的全部内容。
学习交流题目：细菌内毒素检查法与实验分析莫水晶（高级工程师）一、热原与细菌内毒素的研究进展（一）热原与热原反应一百多年前，在西方医药学的发展史上，一个重要的发展就是注射给药(特别是静脉注射）方式的创立，它在人类与疾病作斗争的过程中起了重大作用。
但是无论过去还是现在,在临床上使用注射剂，常易发生不良反应(冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、肤色灰白、昏迷、休克)而加重病情,严重时导致病人重要器官功能衰竭或死亡。
1875年(Brrdon-Sanderson)从腐肉中分离出不带活菌的物质，能引起上述一系列症状，并称之为热原（Pyrogen）。
将上述一系列不良反应定为热原反应。
为了克服热原反应的发生,保障输、注药品的给药安全，对热原进行了广泛的研究。
1923年Seibert肯定热原来源于细菌，它能从滤器滤过,对热稳定，注射剂虽经严格灭菌，仍不能排除热原反应的发生，而提出采用家兔检测热原的方法.1、热原检查法的建立及优、缺点1942年美国首先将家兔热原检查方法收入药典，作为检查药品注射液中发热物质的法定方法。
因此，相继在世界各国药典均规定了这一检查方法.中国药典自1953年版开始收载了热原检查法（各国药典方法基本相同）。
近半个世纪以来，这项保障药品安全的检查，发挥了重要作用。
家兔热原检查法的优点：它能反映出“热原”引起哺乳动物复杂的升温反应过程，除此之外很难列出这一检查方法的更多优点。
细菌内毒素检查法测定利巴韦林注射液的热原
细菌内毒素检查法测定利巴韦林注射液摘要目的:建立利巴韦林注射液的细菌内毒素检查方法。
方法:参照中国药典1995年版二部收载的细菌内毒素检查方法进行实验。
结果:通过干扰实验证明，利巴韦林注射液对鲎试剂的凝集反应无干扰作用，用灵敏度为0.5 EU.ml-1的鲎试剂检查细菌内毒素的方法可行、有效。
结论:可以用细菌内毒素检查法替代家兔热原法来控制三磷酸腺苷二钠注射液的质量。
利巴韦林注射液(ribavirin injection)为抗病毒药。
现有标准采用家兔法进行热原检查［1］。
本文采用细菌内毒素检查法，通过干扰实验，建立了其细菌内毒素限量检查的方法，现报道如下。
1材料鲎试剂(TAL，湛江安度斯生物有限公司，批号：981113，规格：λ=0.5 EU.ml-1，并经复核符合规定)；细菌内毒素工作标准品(中国药品生物制品检定所，批号：9808，效价：40 EU.支)；细菌内毒检查用水(BET水，湛江安度斯生物有限公司，批号：981211，内毒素含量≤0.015 EU.ml-1)；利巴韦林注射液(苏州第六制药厂，批号：990223，990224，990225，规格1 ml∶100 mg，经热原测定均符合规定)。
2方法与结果2.1细菌内毒素限值(L)的计算标准［1］的热原检查(RT)方法是：将本品用氯化钠注射液稀释成含20 mg.ml-1的溶液，剂量按家兔体重注射2 ml.kg-1。
即剂量(M)：40 mg.kg-1，人体致热阈值(K)：5.0 EU.kg-1，则L=K/M=0.125 EU.mg-1［2］。
2.2最大有效稀释倍数的确定将本品用BET水稀释成20 mg.ml-1的溶液，其中细菌内毒素限度应不得超过0.125×20=2.5 EU.ml-1，则对应于灵敏度(λ)：0.5，0.25，0.125，0.06，0.03 EU.ml-1的鲎试剂，选择的稀释倍数分别为5，10，20，40，80倍。
2.3干扰试验预试验取1批RT检查合格的供试品，用BET水将其配制成20 mg.ml-1的溶液，再作5，10，20，40，80倍稀释。
热原和细菌内毒素资料讲解
热原和细菌内毒素一、热原(progon)医院临床在使用药品注射剂时，常有发生冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、肤色灰白、休克、严重时导致死亡，这种症状称为热原反应。
为提高药品质量和用药安全，人们对热原进行了广泛的研究，直到1923年Seibert提出了用家兔检测热原的方法。
在1942年美国药典首先将家兔热原检查项收入药典成为法定方法，中国药典1953年版开始收载该方法，随后的世界各国药典都以动物热原检查法作为药品质量监测的方法之一。
家兔热原检查法的优点，可在规定时间里观察到家兔的体温变化，相应反应了热原质引起哺乳类动物复杂的体温反应过程。
所以，在半个多世纪以来热原检查法，为保障药品质量和用药安全发挥了重要作用。
但随着制药工业的发展和临床用药的要求，该方法的局限性越来越明显。
这种热原检查法，只局限于某种药物进入体内（血循环）是否能引起体温变化或热原反应作为判断药品是否污染热原的方法，已不能满足医药工业发展的需要。
其缺点：①标准化程度低，无法判断检查样品中存在的热原质到底是什么或是哪一种物质。
②由于试验动物家兔是处在被细菌污染的环境中，通过吸入或皮肤感染细菌内毒素而被免疫，导致动物的个体差异较大。
③试验动物受到药品的药理活性干扰，而影响体温变化（如放射性药品、抗生素、生物制品等），实验结果难以判断。
④设备及实验费用昂贵（如建设动物房、水电、动物饲料等耗费），做一种药品需要280元/次，而鲎试剂仅28元/次。
综上情况分析，鲎试验法可避免以上动物热原检查法的不足，该技术的成功和应用真可谓是药品质量监控一场大革命。
什么是热原？目前国内外仍未有统一的认识，但从国内外文献报道中，一个共同的意见，都普遍认为：它是指细菌内毒素的脂多糖。
欧洲药典委员会副主席J.Van Noordwijk提出：“严格地讲，不是每一种热原都具有脂多糖的结构，但所有已知的细菌内毒素脂多糖都有热原活性”。
在药品生产质量管理规范（GMP）条件下，药品生产的质量控制一般可以接受的观点是：不存在细菌内毒素意味着不存在热原。
去内毒素的方法及检查方法
去内毒素的方法及检查方法注：这部分内容为内毒素的检测方法及去除方法。
热原(pyrogen)是微生物产生的内毒素，是由磷脂、脂多糖和蛋白质组成的复合物，微量即可引起恒温动物体温异常升高。
其中脂多糖具有很强的热原活性。
由革兰氏阴性杆菌产生的热原致热能力最强，真菌、病毒也可以产生热原。
【相关链接】热原的危害一、热原的性质及除去热原的方法1．高温法热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使热原彻底破坏。
因此耐热物品如玻璃制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，均可采用此法破坏热原。
但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。
2．吸附法热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。
由于活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用，故广泛用于注射剂生产，但应注意吸附药液所造成的主药的损失。
3．超滤法热原分子量为1×106左右，体积较小，约1～5nm，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用 3.0～15nm超滤膜可将其除去。
4．蒸馏法热原能溶于水但不挥发，但可随水蒸气的雾滴进入注射用水中，因此制备注射用水时，原水中的热原可经蒸馏除去，但需多次蒸馏，，并加有隔沫装置，单次蒸馏往往效果不理想。
5．酸碱法热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。
玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，破坏热原。
6．其它包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。
二、热原的检查方法《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采用鲎试剂法。
1．热原检查法由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。
《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。
细菌内毒素检测技术与应用讲课文档
• 4)BET应用的领域越来越广
– 药品检验 – 药品生产过程质控 – 临床应用:辅助诊断 – 其它领域:食品卫生,环境保护
现在十一页，总共六十八页。
二、细菌内毒素的理论基础
• 1、细菌内毒素
• 2、鲎试剂 • 3、BET检查用水 • 4、BET检查程序 • 5、5,2005年版细菌内毒素检查法 • 6、相关参数的计算
–标准内毒素 –环境内毒素(主要检测对象)
现在十六页，总共六十八页。
• 4) 标准内毒素溶液的制备 – 中国药典2005年版BET法要求,将细菌内毒素国家标 准品用BET检查用水溶解后,需在旋涡混合器上混匀15 分钟,以后每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟.其 他国家的BET法也有类似的要求.
• 7、试验相关知识
现在十二页，总共六十八页。
• 1、细菌内毒素
1)化学成分及特性
– 革兰氏阴性细菌细胞壁的产物 – 是高分子量脂多糖复合物(LPS)
单体分子量介于10,000至20,000道尔顿 典型地以 100,000至500,000道尔顿的聚合体形式存在
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(1)特性
后都伴随有发热反应,当时的医生都深信发热对人体有益 – 1912年,Hort和Penfold阐明注射发热的真正本质,将细菌分
为热原和非热原两种: A、革兰氏阴性细菌为热原细菌
B、革兰氏阳性细菌为非热原细菌 – 他们推断出所有的注射发热都是由革兰氏阴性细菌产生的 可滤过的,热稳定的物质导致的
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• 5)鲎试剂与内毒素的反应机理
醋酸戈舍瑞林缓释植入剂细菌内毒素检查方法学研究
醋酸戈舍瑞林缓释植入剂细菌内毒素检查方法学研究胡宇驰;杨赟昀;朱春玥;周建平【摘要】目的对醋酸戈舍瑞林缓释植入剂细菌内毒素检查的方法学进行验证.方法:用乙腈溶解醋酸戈舍瑞林缓释植入剂后形成混悬液,用水稀释乙腈混悬液后制成溶液,对此溶液进行凝胶法检查干扰试验;同时对乙腈溶解缓释植入剂的步骤进行内毒素回收率试验.结果缓释植入剂乙腈混悬液稀释200倍后,对凝胶法内毒素检查无干扰.乙睛溶解液回收率在25%～35%之间,需要对乙腈溶解液的内毒素限值进行折算降低.结论醋酸戈舍瑞林缓释植入剂进行凝胶法内毒素检查是可行的.【期刊名称】《药学实践杂志》【年(卷),期】2010(028)001【总页数】4页(P36-39)【关键词】醋酸戈舍瑞林;缓释植入剂;细菌内毒素;回收率【作者】胡宇驰;杨赟昀;朱春玥;周建平【作者单位】北京市药品检验所,北京,100035;北京市药品检验所,北京,100035;北京市药品检验所,北京,100035;北京市药品检验所,北京,100035【正文语种】中文【中图分类】R927.12醋酸戈舍瑞林用于前列腺癌的治疗[1]，其缓释植入剂临床每12周使用一次，每次采用腹部皮下注射一剂。
醋酸戈舍瑞林缓释植入剂为我国进口药品，目前仅阿斯特拉公司生产。
为更好控制产品质量，保证用药安全，有必要对缓释植入剂中的内毒素进行检测。
但醋酸戈舍瑞林缓释植入剂为短棒状固体制剂，在水溶液中不溶，吸水后仅缓慢膨胀，因此必须采用100%的乙腈进行溶解，然后将乙腈溶解液稀释进行凝胶法细菌内毒素检查。
本研究目的是确定醋酸戈舍瑞林缓释植入剂的内毒素限值，进行乙腈溶液的鲎试剂干扰试验和内毒素回收率试验，为该产品采用凝胶法进行内毒素检查提供依据。
醋酸戈舍瑞林缓释植入剂(AstraZeneca UK Limited，规格10.8 mg，批号为EJ276、EK499、EK502)；鲎试剂(湛江博康海洋生物有限公司，规格0.1 ml，批号为0810230，灵敏度0.25 EU/ml；规格0.1 ml，批号为0801220，灵敏度0.06 EU/ml)；鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司，规格0.1 ml，批号为0806181，灵敏度0.25 EU/ml；规格0.1 ml，批号为0710171，灵敏度0.03 EU/ml)；细菌内毒素工作标准品(中国药品生物制品检定所，规格10 000 EU/支，批号为150600-200707)；细菌内毒素检查用水(大同市惠达药业有限责任公司，规格10 ml/支，批号为0709021)；乙腈(Honeywell international Inc. Burdick amp; Jachson，优级纯，批号为CU979)。
《细菌内毒素检查法》课件
结论
根据实验结果得出结论，对样品中是 否存在内毒素进行评估，并提出建议 和改进措施。
报告实例分析
实例一
某药品细菌内毒素检查报告，通过采用鲎试剂法进行实验，得出阴性结果，证明 该药品中不存在内毒素。
实例二
某注射用水细菌内毒素检查报告，通过采用鲎试剂法进行实验，得出阳性结果， 证明该注射用水中存在内毒素，可能对使用者产生毒性作用。
内毒素可刺激机体产生炎症反 应，导致发热、白细胞反应和 组织损伤等。
内毒素还可诱导机体产生细胞 因子、补体成分和急性期蛋白 等生物活性物质。
内毒素的检测原理
细菌内毒素检测基于鲎试剂与内 毒素的凝集反应，通过检测凝集 反应的产物来反映内毒素的浓度
。
鲎试剂是一种天然的生物试剂， 具有灵敏度高、特异性强、操作
简便等优点。
检测原理基于鲎试剂与内毒素反 应后产生的凝固酶，通过比浊法 或显色法测定其浓度，从而推算
出内毒素的浓度。
03
细菌内毒素检查法实验操作流 程
样品采集与处理
样品采集
采集具有代表性的样品，确保样品无菌，避免外界污染。
样品处理
将采集的样品进行稀释、离心、过滤等处理，以去除杂质和 干扰物质。
试剂与器材准备
特点
具有灵敏度高、特异性好、操作 简便、快速等特点，是国际上普 遍采用的检测方法。
历史与发展
历史
细菌内毒素检查法自20世纪初开始 研究，经过近百年的发展，已经成为 一种成熟的检测技术。
发展
随着科学技术的发展，细菌内毒素检 查法不断改进和完善，检测灵敏度和 特异性不断提高。
应用领域
01
02
03
04
在生物制品领域，细菌内毒素检查可以用于检测疫苗 、抗体、细胞培养物等生物制品中是否存在细菌内毒 素，确保产品的安全性和有效性。
细菌内毒素检查法
十、干扰试验结果分析
反应结果1(SD表示供试品溶液) E0.5 E0. 25 E0.125 E0.06 NC
++++ ++++ --------
Es
0.25Eu／ml
SDE0.5
SDE0. 25
SDE0.125
----
SDE0.06 NPC
----
Et
++++ ++++
- - 0.25Eu／ml
七、供试品溶液的制备
某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中 浸提制成供试品溶液。 一般要求供试品溶液的PH值在6.0～ 8.0的范 围内。(USP、EP一般要求供试品溶液与鲎试 剂的混合液的PH值在6.0～ 8.0的范围内。） 对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品， 需要调节被测溶溶液
1 2 4 8
-----
2λ 1λ 0.5λ 0.25λ
-----
4 4 4 4
2①
D
无/供试品溶液
-----
注：A为阴性对照；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为供试品溶液 ① USP、EP规定为4支平行管
九、供试品的干扰试验
加样反应
NC B溶液(PC系列) 2λ ○ ○ ○ ○ λ ○ ○ ○ ○ 0.5λ 0.25λ 2λ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ C溶液(PPC系列) λ ○ ○ ○ ○ 0.5λ 0.25λ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 供试 品管 ----
NC
Es
- - 0.25Eu／ml NPC Et
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8次测温变化≤ 0.4 ℃（可供3周使用）
2019/11/5
14
实验兔重复使用
1、结果符合规定的实验兔，休息48hr 2、复试用兔升温＜0.6℃且供试品合格，休息48hr 3、使用次数未达10次的实验兔 4、复试用兔升温≥0.6℃且供试品合格，按新兔测温合
热原测温仪或肛温计（测温探头或肛温计）
其它用品（7#针头、 12#针头、注射器、 直镊、配制容器、灭菌注射用水、氯化钠 注射液、酒精棉球等）
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9
实验准备
热原测温仪或肛温计定期校验，符合计 量认证的要求。 实验用具的除热原处理：试验用注射器、 针头及一切与供试品溶液接触的器皿， 洗涤，干燥， 250℃,30分钟以上。
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注射体积和注射速度
通常给药剂量 ≤10 ml/kg体重，并应在10 分钟内完成注射。一般情况下，注射的速 度和体积并不影响发热反应，大部分受试 溶液可以在1-2 min内注射完成，但部分受 试产品具有明显和迅速的药理作用，可影 响或干扰发热反应，需要缓慢进行注射
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格
（以上实验兔可重复使用）
5、结果不符合规定的实验兔 6、使用次数达10次的实验兔
（以上实验兔不可再使用）
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家兔重复使用
美国药典27版仅仅规定了家兔使用频率， 并没有规定年龄限制和重复使用长度，使 用的频率规定不得超过每2天1次，若在热 原实验中最大升温0.6度或更高，以及热原 实验结果为阳性时，间隔时间不得小于2周。 动物重复使用的长度在很大程度上取决于 所检测的样品的性质，当家兔成熟时开始 进入热原实验，至少可使用2年
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实验动物
动物品系：均为远交系动物，普通级饲养。日本大 耳白（Japanese White），新西兰白（New Zealand White），青紫蓝，比利时白（Belgian White），Chinchillas 和 Dutch Belts
要求：健康合格、1.7～3.0kg、同一来源和品系。 性别:雌雄均可。雌性动物，比较温顺，易于捉持，
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2
热原检查（Pyrogen Test)
热原的含义 热原检查法基本原理 热原检查法基本操作 试验操作注意事项
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3
热原的含义
热原系指某些药品中含有的能引起体温升高 的杂质。
热原经静脉注入人体后15分钟即能产生强烈 的发热反应，重者昏迷甚至危及生命。
药品热原检查与细菌内毒 素检查方法介绍
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北京市药品检验所药理室 周建平
2005年11月
1
药品安全性检验内容
热原检查（Pyrogen Test) 细菌内毒素检查（Bacterial Endotoxin Test） 异常毒性检查 降压物质检查 过敏法反应检查法 降钙素生物测定法 生长激素生物测定法 溶血与凝聚检查法
1969年Greisman 和Hornick研究比较了三 种纯化内毒素对家兔和健康男性志愿者的 反应，结果表明：人和家兔产生热原反应 需要大约相同重量的细菌内毒素，但当热 原的剂量增加时，人体反应较家兔更为强 烈。
2019/11/5
6
热原剂量确定
实验的设计是基于在不超过10分钟的时间内，给 予家兔静脉注射使动物能够耐受的，不多于 10ml/kg体重剂量的受试药物。
《中国药品检验标准操作规程》2005版提出 “ 供试品的剂量应按各该药项下的规定注射， 未规定剂量的药品，可根据该药的药理性质，在 不影响家兔正常生理的前提下，按体重计算（人 按50kg计），用临床一次剂量的3-10倍”
家兔热原实验中的热原阈值剂量应当认为是最低 标准，对于人体而言应尽可能的提高几倍实验的 安全范围。
18
结果判断
1、复试：初试3只兔中仅1只升温≥0.6℃或 3 只兔升温均小于0.6℃、但升温总和≥1.4℃，
应另取5只复试。
2、合格：初试3只兔升温均小于0.6℃且升温 总和＜ 1.4℃； 5只复试中仅1只升温 ≥0.6℃且初试、复试共8只兔升温总和≤ 3.5℃。
1、固体样品注意称量、稀释时的操作，避免 热 原和其它污染。
2、样品稀释时应注意准确性并尽量减少误差。 3、配制时应注意含量或效价(抗生素）的折算
问题以及总量是否够试验之用。 4、稀释用的灭菌注射用水及氯化钠注射液宜
经鲎试剂检查合格再用于稀释。
2019/11/5Fra bibliotek13新兔预选
1、新兔→饲养7日以上 2、预测体温（条件同热原检查）：测温
热原主要来源于革兰阴性菌的细菌内毒素。
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4
热原检查法基本原理
被测物
试验 给药 动物 方法
测定设 备
判断标准
供试品溶液 （输液、小 家
针、粉针、 兔 注射用原料）
耳静脉 注射
肛温计 给药后体
或
温变化
测温仪
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5
试验基本原理
家兔热原实验与人体的热原反应有什么样 联系？
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7
热原检查法基本操作
实验材料及设备 新兔预选
实验准备
家兔重复使用
实验动物
检查法
实验环境 供试液配制
结果判断（合格、复试、 重做、不合格）
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实验材料及设备
计量设备（天平、公斤称等）
电热干燥箱（可达250℃以上） 恒温水浴（37～38 ℃） 家兔固定盒
体重增长较缓慢 动物的检疫、标记：一周的检疫期，动物编号和笼
具编号
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实验环境
实验室温度： 17-25℃ 实验室与饲养室温差：≤ 5 ℃ 实验温度变化： ≤ 3 ℃ 实验室：保持安静，避免强光、噪音等刺
激，注意实验兔之间相互影响。
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12
供试液配制
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检查法
1、取合格兔，停食、停水，称重并固定约1小时
2、每隔30分钟测温一次，致连续2次温差≤ 0.2℃，并算得2次均值为正常体温。
3、及时配制供试液并预热至37～38 ℃
4、选兔并分组（初试3只/组、组内温差＜1.0℃ ； 复试5只/组）
5、注射供试液（分组后15分钟内）
6、计时开始并记录6次体温，间隔0.5小时，以6 次中最高温度减去该兔正常体温为升温值