绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达分子实验设计
绿色荧光蛋白（GFP）原核表达分析
绿色荧光蛋白（GFP）原核表达分析石河子大学分子生物学实验结课论文绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析学生姓名学号专业年级、班级指导教师所在学院中国·新疆·石河子2016年1月绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析摘要：本实验主要探讨目的蛋白（GFP）在大肠杆菌中的表达的情况以及鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白。
本实验先对菌液进行培养、活化、然后采用IPTG 分别对其不同时间点的诱导，用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握GFP 诱导不同时间的表达情况的检测方法。
关键词：绿色荧光蛋白；SDS-PAGE；原核表达1 前言1.1实验目的掌握聚合酶链式反应(PCR)的原理和操作方法；了解重组载体的构建方法；锻炼学生查阅文献资料、设计与优化实验的能力；加强学生对化学生物学中常用研究方法的认知。
1.2实验背景绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。
与以往lacZ、CAT 等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高；不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；另外GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害,安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。
正是由于GFP 检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域。
绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。
采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段。
绿色荧光蛋白
绿⾊荧光蛋⽩绿⾊荧光蛋⽩（GFP）的转化表达及免疫印迹检测王媛0811142南开⼤学⽣命科学学院⽣物技术08级⼀、摘要：本实验利⽤酶切⽅法检测载体中所含GFP⽚段后，通过转化的⽅法把绿⾊荧光蛋⽩（GFP）外源基因转⼊⼤肠杆菌进⾏表达，通过免疫印记杂交⽅法（western blotting）分析GFP在⼤肠杆菌中的表达，在分离检测的全过程中（转化平板，细胞裂解，电泳，电转移），均可通过紫外灯清晰地检测到颜⾊亮丽的绿⾊荧光蛋⽩。
关键词：绿⾊荧光蛋⽩免疫印记杂交⼆、引⾔：绿⾊荧光蛋⽩是⼀种源于⽔母(Aequorea Victoria)等海洋⽆脊椎动物的蛋⽩，分⼦量为26.9KD。
GFP的开放阅读框架长度约为740bp，编码238个氨基酸残基。
GFP表达后折叠环化，在氧存在下，由65～67位的氨基酸残基环化，形成发⾊基团，⽆需添加任何酶和底物，在长紫外或蓝光激发下就能发荧光，荧光性质稳定，可保持10分钟。
GFP能在不同的细胞内稳定表达，⽆种属、组织和位置特异性，对细胞⽆毒性且检测⽅法简单，将其作为报告基因已⼴泛应⽤于细胞⽣物学和分⼦⽣物学领域。
免疫印记⼜称蛋⽩质印记，是在凝胶电泳技术和固相免疫测定技术基础上发展起来的⼀种免疫检测技术。
其原理是将膜与胶放在中间，上下加滤纸数层，做成“Sandwich”样的转移单位，并且保证带负电的蛋⽩质向阳极转移，即膜侧连接阳极或⾯向阳极，从⽽将电泳分离的蛋⽩从凝胶转移⾄固相载体上。
三、实验材料、仪器及⽅法：3.1 实验材料3.1.1 菌种E.coli DH5α(pETH)菌株 E.coli DH5α(pETH-GFP)菌株 E.coli BL21菌株 E.coli BL21(pETH)菌株E.coli BL21 (pETH-GFP）)菌株3.1.2 试剂与材料LB培养基（⾃⼰配置灭菌）Amp（100mg/ml）IPTG(10mg/ml) CaCl2(1M) 50*TAE Acry/Bis 贮存液分离胶缓冲液浓缩胶缓冲液泳动缓冲液（5*）上扬缓冲液（5*）转移缓冲液PBS 1.5%A.P.S 质粒⼩量提取试剂盒Eco RI限制性内切酶DNA Maker Protein Maker pH试纸3.1.3 仪器紫外检测仪、超声波细胞粉碎机、垂直板式电泳系统、半⼲式蛋⽩质印迹电转移系统等。
绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆表达
实验用品
PEGFP -N3模板、菌株E. coli DH5 α、E. coli BL21 、质粒 pET28a 、 限制性内切酶 EcoRⅠ、 Hind Ⅲ、T4 DNA连接酶、1 kb DNA ladder
DNA 凝胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒、DNA 纯化试剂盒及 IPTG、 PCR用试剂、卡那霉素、琼脂糖及 PCR 合成引物等、蛋白胨、酵母浸出 粉、琼脂粉等。
转化 筛选及复筛及酶切验证
PCR检测 IPTG诱导表达
SDS-PAGE检测目的蛋白
包涵体检测 分离纯化
电泳检测 酶切
pET28a质粒酶切位点选择
实验用品及方法介绍
方法介绍
研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重 组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌 体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导 表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆
目
1 实验背景
2 实验用品及方法介绍
录
3 实验流程
4 实验原理
5 具体实验步骤
6 实验结果预测
7 参考文献
实验背景
200810月8日，瑞典皇家科学院宣布，2008年诺贝尔化学奖由 日本科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学 家钱永健获得，他们三人在发现和研究绿色荧光蛋白(GFP)方 面取得了突出成就。
目前应用较多的是GFP的突变体—增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP）。 EGFP将GFP的第64位氨基酸苯丙氨酸突变成为亮氨酸，从而发射出的荧光 强度比GFP大6倍以上。
所以，EGFP比GFP更适合作为报告基因来研究基因表达、调控、细胞 分化及蛋白质在生物体内的定位和转运等
EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达与检测
contents
一 二 三 四 五
背景介绍 实验流程 实验步骤 预期结果 参考文献
第几章
一、背景介绍
1、绿色荧光蛋白（GFP） 2、质粒 3、大肠杆菌表达载体及表达系统 4、SDS-PAGE原理及蛋白分离与检测
一 1 - 绿色荧光蛋白
生物学研究
生态学研究
医学研究
一 2 - 质粒
2.1 pEGFP-N3质粒
一 2 - 质粒
2.1.1 pEGFP-N3质粒描述
pEGFP-N3 encodes a red-shifted variant of wild-type GFP (1–3) which has been optimized for brighter fluorescence and higher expression in mammalian cells. (Excitation maximum = 488 nm; emission maximum = 507 nm.) pEGFP-N3 encodes the GFPmut1 variant (4) which contains the double-amino-acid substitution of Phe-64 to Leu and Ser-65 to Thr. The coding sequence of the EGFP gene contains more than 190 silent base changes which correspond to human codon-usage preferences (5). Sequences flanking EGFP have been converted to a Kozak consensus translation initiation site (6) to further increase the translation efficiency in eukaryotic cells. The MCS in pEGFP-N3 is between the immediate early promoter of CMV (PCMV IE) and the EGFP coding sequences. Genes cloned into the MCS will be expressed as fusions to the N terminus of EGFP if they are in the same reading frame as EGFP and there are no intervening stop codons. SV40 polyadenylation signals downstream of the EGFP gene direct proper processing of the 3' end of the EGFP mRNA. The vector backbone also contains an SV40 origin for replication in mammalian cells expressing the SV40 T-antigen. A neomycin resistance cassette (Neor), consisting of the SV40 early promoter, the neomycin/kanamycin resistance gene of Tn5, and polyadenylation signals from the Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV TK) gene, allows stably transfected eukaryotic cells to be selected using G418. A bacterial promoter upstream of this cassette expresses kanamycin resistance in E. coli. The pEGFP-N3 backbone also provides a pUC origin of replication for propagation in E. coli and an f1 origin for single-stranded DNA production.
化学生物学综合创新设计实验——大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白
３ 试 剂与 仪 器
３１ 试剂 ． 高保真 Ｔｑ酶 ，Ｎ Ｐ ， Ｔ 卡那霉 素， ａ ｄ Ｔ ｓＩ Ｇ， Ｐ 氯 化钙 ，４Ｄ Ａ连接酶 ， Ｔ Ｎ 限制性内切酶 Ｂｍ 和 Ｈｎ Ｉ ａ ＨＩ ｉｄＩ Ｉ
（ ａ ａ ａ ， 脂糖 ， 乙啶 ，Ｃ 纯化试剂 盒 （ ｍ ｇ ｉ ＴＫ Ｒ ）琼 溴 ＰＲ Ｏ ｅａＢｏ
１８ ６
江
西
农
业
学
报
２ ３卷
显微镜检测表达情况。
ｔ ，Ｎ Ｐ ｔ （ ． ｍ １ ，０ ｕｅ ｘ ｄ Ｔ ｓ Ｌ ２ ０ｍ ｏ） １ Ｂ ｆｒ ， Ｌ ２ｘ Ｘ ｆ２ 普通 Ｔｑ ａ 酶 ０２ （ ． Ｕ ， ． ２５ ）去离子水 １． 。反应条件 同４ １ ３３ ． 中条件。将反应后产物进行琼脂糖凝胶 电泳检测 ， 如果
验步骤。
收稿 日期 ： １ —０ ２ １ ６—２ ０ ５ ‘
笔者在任课教师 以往从事科研 的基础上 一 设计 ，
了该综 合 创 新 实 验 ， 绿 色 荧 光 蛋 白基 因 将 插 入 ｐ Ｔ ８ 表达系统 ， Ｅ ２ａ 进行绿色荧光蛋 白表达 ， 并使用荧光
基金项 目： 国家水体污染控制与治理科技重大专项 （０９ Ｘ ７２ — ０ ） 河南农业大学博士启动项 目（００ １ １ 。 ２０ Ｚ ０ ４３ ０３ ； ３ ３０７ ） 作者简介 ： 赵仲麟（９ Ｏ ）男 ， １ 一 ， 辽宁鞍山人 ， ８ 讲师 ， ， 博士 主要从事化学生物学及分子生物学的科研与教学工作。 通讯作者： 袁超。
江西农 业学报 ２ １ ，３ ８ ：６ ０ １ ２ （ ） １７～１８ ６
ＡｅａＡｇｉｕ ｕａ ｉｎ ｘ ｔ ｒｃ ｈ ｒｅＪａ ｇ ｉ
化 学生 物 学综 合创 新 设计 实验
绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆表达
具体实验步骤
Part01
Part02
Part03
P01 质粒DNA的提取
感受态细胞经 转化培养后， 平皿内有但菌 落长出。
P02 质粒DNA的提取
用灭菌吸头挑
取单菌落，浸
没于2 mL含有
P03
抗生素的LB液
体培养基中，
37 ℃, 180
r/min振荡培养
过夜。
质粒DNA的提取
取1.5 ml 培养 物倒入微量离心 管中，用微量离 心机于4 ℃、 11000 r/min 离 心1分钟，吸弃 上清。
绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962 年从多管水母中发 现并分离得到的一种发光蛋白。
它是由238 个氨基酸构成的“β-桶” 型三维立体结构, 其中 第 65 ~ 67 位氨基酸( 丝氨酸 -酪氨酸 -甘氨酸) 形成发光团, 为主要发光的位置。
GFP的演化
通过生物化学的方法将基因做小小的改变, 就可以改变GFP中的氨基 酸, 得到变异GFP。
2）从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不 同的需要采用不同的方法。碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是 根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。十 二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌 细胞裂解，又能使一些蛋白质变性碱变性法因其抽提效果好，收得 率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广 泛采用。抽提过程中在加入溶液II后，碱性条件使DNA的氢键断裂， 宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两 条链不会完全分离，当加入溶液III中和后，宿主DNA相对分子质量 大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分 子量的RNA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速 配对恢复原来的构型而溶解在TE溶液中。
绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的克隆与表达
/view/992207.ht m /view/2261117.h tm 郝福英 周先碗 朱玉贤 主编《基础分子生物 学实验》 北京大学出版社 2010年11月第 一版
实验仪器 实验材料 实验试剂
将pET-28a-GFP重组质粒转化入表达菌株 · 制备BL21（DE3）菌株的感受态细胞
10uL BL21（DE3）菌液接入3mL LB液体培养基，摇床培养过夜
二次活化：1:50比例接入新的试管摇床培养2h
1.5mL冰上10min
4 度，4000r/min离心2min收集细胞
涂平板： a）分别取50、100、150uL加入重组质粒的感 受态细胞悬液涂布于含抗生素的平板 b）抗生素板+IPTG+100uL重组质粒的感受态 细胞悬液 c）对照组感受态细胞100uL+抗生素平板 d）正面向上放置片刻，后37度倒置培养20h
重组阳性克隆菌接至3mL LB（Kan）液体培养基中，37度 培养16h 过夜菌1:50比例接种至4支试管中（每支试管含3mL LB(Kan)），扩大培养2h，测量A600值为0.5，停止 分别使用IPTG（最后总浓度为1mmol/L）诱导 0,2,4h 离心并照相
丝氨酸－酪氨酸－甘氨酸 生色基团 蛋白质折叠，生色基团得以“亲密接触”, 经环化形成咪唑酮,并发生脱水反应。但此 时还不能发射荧光,只有当有分子氧存在的 条件下,发生氧化脱氢,方能导致绿色荧光蛋 白发色团的“成熟”,形成可发射荧光的形 式。
蓝光、绿光与黄光 基因克隆 变体
分子标记 药物筛选 融合抗体 生物传感器 信号传导
标记！
真核细胞表达载体，pEGFP-N3载体上携带 有EGFP蛋白表达基因 很强的复制能力 高效的功能强大的启动子SV40和PCMV 多克隆位点 具有neo基因，可以采用G418来筛选已成 功转染了该载体的靶细胞
gfp表达质粒的构建实验报告
gfp表达质粒的构建实验报告1.实验目的本实验旨在构建含有绿色荧光蛋白（GFP）表达质粒，以便在细胞中实现GFP的高效表达，为后续的生物荧光成像等应用提供支持。
2.实验原理质粒是一种小型、自主复制的DNA分子，可与细菌染色体DNA分离。
质粒上有多个限制性酶切位点，可用于插入外源基因。
通过将目的基因插入质粒，并导入受体细胞，可以实现目的基因的表达。
本实验将使用含有GFP基因的质粒，将其导入大肠杆菌细胞中，使其表达出绿色荧光蛋白。
3.实验材料3.1仪器设备：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、恒温培养箱、恒温水浴锅。
3.2试剂：质粒提取试剂盒、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶Ⅰ、dNTPs、电泳缓冲液、琼脂糖凝胶。
3.3细胞系：大肠杆菌细胞。
4.实验步骤4.1获取含有GFP基因的质粒：从公共数据库中获取含有GFP基因的质粒序列，并通过PCR扩增获得大量质粒。
4.2酶切质粒：使用限制性核酸内切酶对质粒进行酶切，获得含有GFP基因的片段。
4.3连接质粒：将酶切后的质粒片段与连接酶的作用下，将其连接至具有相同黏性末端的大肠杆菌质粒上。
4.4转化大肠杆菌：将连接后的质粒转化至大肠杆菌细胞中，通过抗生素筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。
4.5验证重组质粒：通过PCR和DNA测序等方法验证重组质粒是否正确插入目的基因。
5.实验结果通过本实验，我们成功构建了含有GFP基因的重组质粒，并成功导入大肠杆菌细胞中。
通过荧光显微镜观察，发现大肠杆菌细胞发出绿色荧光，表明目的基因已正确表达。
6.结果分析通过本实验结果，我们可以得出以下结论：首先，本实验成功构建了含有GFP基因的重组质粒；其次，通过荧光显微镜观察到目的基因已在大肠杆菌细胞中表达出绿色荧光蛋白；最后，本实验为后续的生物荧光成像等应用提供了支持。
7.结论本实验成功构建了含有GFP基因的重组质粒，并在大肠杆菌细胞中实现了目的基因的高效表达。
该实验结果为后续的生物荧光成像等应用提供了有力支持，具有重要价值。
实验五 用IPTG诱导大肠杆菌表达重组绿色荧光蛋白
实验五用IPTG诱导大肠杆菌表达重组绿色荧光蛋白一、目的要求1.学习和掌握重组蛋白在大肠杆菌中表达的原理和实验技术；2.观察大肠杆菌在诱导过程中的形态。
二、原理pET 系统是有史以来在E.coli 中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。
目的基因被克隆到pET 质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA 聚合酶诱导。
T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。
尽管该系统极为强大，却仍能很容易地通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达。
降低表达水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。
该系统的另一个重要优点是在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。
用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的蛋白对宿主细胞的可能毒性造成的质粒不稳定 (详见I. F.部分)。
如果用非表达型宿主细胞克隆，可以通过两种方法启动目的蛋白的表达：用带有受λpL 和 pI 启动子控制的T7 RNA 聚合酶的λCE6噬菌体侵染宿主细胞，或者将质粒转入带有受lacUV5 控制的T7 RNA聚合酶基因的表达型细胞。
在第二种情形下，可以通过在细菌培养基中加入IPTG 来启动表达。
尽管有时(例如非毒性目的蛋白) 可以直接将目的基因克隆到表达型宿主细胞中，但这种策略并不是通用做法。
两种T7 启动子以及多种拥有不同抑制本底表达水平的宿主细胞共同构成了一个极为灵活而有效的系统，使各种目的蛋白得以最优化表达。
三、试剂与器材试剂：LB培养基、IPTG、氨苄青霉素、草酸铵结晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%沙黄染色液。
器材：摇床、显微镜等。
四、操作步骤A、诱导许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。
得到发光大肠杆菌的实验设计
得到发光大肠杆菌的实验设计20 艾珉吉pEGFP-N3载体为真核细胞表达载体。
主要有以下几个部分载体质粒PET-28a 目的基因质粒(绿色荧光蛋白)将重组质粒导入大肠杆菌体内一、实验所用质粒pEGFP-N3质粒编码野生型GFP的红移(荧光波长较大)变异体蛋白，具有更强的荧光(在485nm激发下比野生型强35倍)和在哺乳动物细胞中有较好的表达。
激发峰在488nm，发射峰在507nmpET-28a质粒载体上面携带一个N-terminal His Tag／Thrombin／T7 tag结构以及一个可以选择的C-terminal HisTag。
克隆表达区域的编码框由T7RNA 聚合酶转录。
二、具体步骤(一)重组质粒PET-28a-GFP的构建先获取大量的目的基因，然后构建重组质粒，进而导入大肠杆菌通过对大肠杆菌的培养繁殖来让质粒扩增，以获取更多的质粒具体操作; PCR、酶切等方法获取目的基因，酶切连接重组质粒——PCR实验用品：1.材料：pEGFP-N3质粒，0.2mlEP管，取液器吸头，一次性手套。
2.试剂：ddH2O、10×Buffer、MgCl2、4×dNTP、引物、Taq酶、质粒DNA模板、琼脂糖、Gold view。
3.设备：移液器，台式高速离心机，凝胶电泳系统，凝胶成像系统。
注：绿色荧光蛋白引物：p1 Ndel/p2 Xhol正向引物-p1：5'-ggg cat atg gtg agc aag ggc gag gag-3'反向引物-p2：5'-ggg ctc gag tta ctt gta cag ctc gtc catg-3'PCR实验步骤：1.在0.2mL EP管内配制50μL PCR反应体系1个：ddH2O 34μL、10×Buffer 5μL、MgCl2 3μL、4×dNTP 2μL、正向引物1μL、反向引物1μL、Taq酶1μL、质粒DNA模板3μL。
分子生物学实验设计实验
分子生物学实验设计实验分子生物学实验设计实验题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因（EGFP）学院：生命科学学院专业：生态学教师：吴传芳姓名/学号：余光辉/20方成/20一、实验目的在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白二、实验流程三、实验试剂、材料及步骤(一)质粒DNA的提取1.原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求2.试剂LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl5g，琼脂（固体培养基）15g，用1NNaOH调pH7.5。
溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)溶液Ⅱ：0.4mol/LNaOH，2%SDS临用前1：1配制。
溶液Ⅲ：5mol/L醋酸钾60ml冰醋酸11.5ml双蒸水28.5ml卡那霉素(20mg/mL)抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1）无水乙醇70%乙醇TE缓冲液或ddH2O培养含有pET28a质粒和pEGFP-N3质粒的大肠杆菌收集裂解细菌、分离纯化质粒DNApET-28a-EGFP的表达及观察重组DNA的转化及重组子的鉴定质粒DNA的限制性内切酶酶切及重组DNA琼脂糖凝胶电泳检测3.材料含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液1.5ml塑料离心管EP管架微量取液器和取液器吸头常用玻璃器皿4.实验步骤（1）将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50g/mL），37℃培养过夜（2）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm2min，弃上清液（3）加入100L溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10min（4）加入200L新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5min（5）加入150L冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15min （6）10000rpm5min，取上清液于另一干净的离心管中（7）向上清液中加入等体积（约400L）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm10min，将上清液转移至新的离心管中（8）加入等体积（约370L）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min,取上清液于新离心管中（9）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h （10）12000rpm5min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体（11）加0.8mL70%乙醇，离心1min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min（12）加30LddH2O，-200C保存备用5.注意（1）饱和酚（取下层）单独吸200L，氯仿：异戊醇（24：1）吸200L（2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II和III），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用(二)DNA琼脂糖凝胶电泳检测1.原理在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA、闭环超螺旋DNA。
分子生物学实验设计
分子生物学实验设计彭杰2012141241104 摘要：绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是源于海洋生物多管水母属（aequoia victoria）的一种发光蛋白,能够自身催化形成生色团并在蓝光激发下发出绿色荧光,能在活细胞内稳定表达,本试验首先从含有GFP的大肠杆菌中提取质粒,并利用胶回收试剂盒纯化质粒,采用氯化钙法将工程菌DH5a制成感受态细胞,然后将纯化后的质粒转入已制备好的感受态细胞中,使得工程菌DH5a转化成具有抗氨苄青霉素的大肠杆菌,并表达绿色荧光蛋白,接种于加氨苄青霉素的LB培养基上,筛选阳性克隆。
实验目的：获取发绿色荧光的大肠杆菌BL21实验材料：（一）仪器1、恒温摇床2、低温离心机3、恒温水浴4、超净工作台5、隔水式培养箱6、琼脂糖凝胶电泳仪系统7、台式高速离心机8、凝胶成像系统（Dark Reader）9、高压灭菌锅 10、10、100、1000μL微量移液器各一支11、制冰机 12、恒温培养箱13、PCR热循环仪 14、漩涡混合器（二）材料1、少量含pEGFP-N3和pET-28a质粒的菌液2、限制酶Bam HⅠ5'⋯G↓GATCC ⋯3' →5'⋯G GATCC⋯3'3'⋯CCTAG↑G ⋯5' →3'⋯CCTAG G⋯5'3、限制酶Not I 5'⋯GC↓GGCCGC⋯3'→5'⋯GC GGCCGC⋯3'3'⋯CGCCGG↑CG⋯5'→3'⋯CGCCGG CG⋯5'4、0.2mL EP管架5、1.5ml塑料离心管6、一次性手套7、大肠杆菌DH2a和BL218、氯化钙氢氧化钠乙醇氯仿蔗糖硼酸9、乙二胺四乙酸（EDTA）10、三羟甲基氨基甲烷(Tris)11、氨苄青霉素12、溴酚蓝13、PCR产物快速胶回收试剂盒14、dNTP混合物15、引物对（正反向引物）16、Ex-Taq酶 T4DNA连接酶17、酵母提取物胰蛋白胨氯化钠18、小指管、吸头、培养皿、三角瓶、试管等（三）试剂·1、LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g，琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。
绿色荧光蛋白(EGFP)克隆并在大肠杆菌表达
绿色荧光蛋白（EGFP）克隆并在大肠杆菌表达详细项目实施计划书生物技术1001班①EGFP基因完整的序列: ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTA AACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAG TTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTG CAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGC TACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTC GAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTG GGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGC ATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAG CAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCC CTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATC ACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTA②PCR引物引物序列（5’-3’）酶切位点描述Pl GAC GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGABamHI5’GFP geneP2GCC GAATTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATG EcoR I 3’GFP gene实验使用的EGFP蛋白取自原核-真核穿梭质粒pEGFP-NB3B的蛋白质编码序列。
绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达分子实验设计
绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达张历涵2013141241098彭千2013141241068一、质粒转化入感受态细胞并培养1、原理实验室提供的质粒首先要转入大肠杆菌进行培养与增殖，制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。
所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
2、实验步骤2.1 DH-5α和BL-21感受态细胞的制备（1）将0~4 ℃保存的DH-5α和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37 ℃下250 r/min过夜培养16 h 。
（2）将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37 ℃活化培养2～3 h至OD=0.3～0.5 。
（3）取1.5 mL菌液转入EP管中，置于冰上10 min, 然后于4 ℃下5000 r/min 离心5 min。
弃上清液，沉淀加入0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2缓和悬菌。
冰上放置15-30 min后，4 ℃下5000 r/min离心10 min。
（4）弃上清液，沉淀用0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在－20 ℃冰箱内保存。
2.2 感受态细胞的转化（1）取制备好的感受态细胞100 μl，冰上解冻，均匀悬浮。
（2）加入2 μl酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。
（3）42 ℃水浴中热击70 sec后，冰上放置2 min。
（4）加入200 μl LB液体培养基，37 ℃，50-100 rpm振荡培养1 h。
绿色荧光蛋白的基因克隆与表达论文
湖北师范学院分子生物学综合试验论文论文题目绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达作者姓名樊恒达专业名称生物技术准考证号2008114020308指导教师王友如中国·黄石绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达樊恒达（湖北师范学院生命科学学院0803班学号：2008114020308，湖北黄石）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达。
方法：从E.coli DH5ɑ中用碱法提取质粒的方法提取质粒pET-28a-GFP。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对酶切后的质粒进行电泳，用以确定已经提取的质粒中含有GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
最后用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
结论：本实验对学生掌握最基本的分子生物学试验技术奠定了基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化Green Fluorescent Protein (GFP) Gene Cloning and ExpressionFan Hengda(class 3 grade 8, college of biology science ,Hubei Normal university, Huang Shi) : AbstractObjective:searching for the phenomenon of green fluorescent protein gene’s cloning and restructuring expression in the E.coli .Method:drawing plasmid pET-28a-GFP from E.coli DH5ɑ by using the method of Alkali Distillation .Then the selected production can be electrophored by using the AGE ,in order to make sure drawing successfully plasmid from E.coli. The selected plasmid is cutting by the extinction enzymes BamHI and NotI and the sliced plasmid can be electrophored by using the AGE in order to ensure the selected plasmid containing GFP gene .Converting the plasmid having gene of GFP into the feeling states E.c oli BL - 21 cells and cultivating it largely through the LB medium .Finally the IPTG can guide the expression of GFP gene and we can see light green clonies .Conclusion:This experiment sets up foundation for students to master the basical experimental technology of molecular biology .目录引言 (3)材料与方法 (3)1材料 (3)1.1材料 (3)1.2仪器 (3)1.3试剂 (3)2方法 (3)2.1重组质粒（pET-28a-GFP）的构建 (3)2.2碱法提取质粒 (4)2.3质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳 (4)2.5.E.coliDH5α感受态细胞的制备及转化 (4)2.6 扩大培养 (4)2.7 GFP蛋白的诱导表达 (5)结果 (5)1实验现象 (5)1.1 碱法提取质粒 (5)1.2碱法提取质粒电泳 (5)1.3酶切质粒电泳 (5)1.4重组质粒的转化及阴阳性对照 (6)1.5 GFP蛋白的诱导表达结果 (6)1.6 紫外灯下看到的绿色荧光蛋白 (7) (7)讨论 (7)参考文献 (8)引言：2008年10 月 8日，瑞典皇家科学院把今年的诺贝尔化学奖授予绿色荧光蛋白（GFP）的发现者和推广者。
基因克隆和表达的实验设计
基因克隆和表达的实验设计实验目的研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。
实验方法；通过分别将0M-5a（pEGFP-N3）和0M-5a（pET-28a）提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入0M-5a感受态细胞中进行转化，通过限制性核酸内切酶Not l与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后，通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体Bl-2/内进行表达，再用IPTG诱导GFP 基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。
材料与方法：实验材料克隆菌0W-5a、表达菌6l-21为本实验室收藏菌种，质粒pET-28a 和pEGFP-N3，引物，限制性内切酶Bam H1、Not I仪器设备Eppendof 离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管。
实验原理生物的大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或类核中。
DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DWA制品的污染常影响到以后的DWA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。
苯酚、氟仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。
经苯酚、氟仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。
DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase 去除RNA污染。
实验步骤1、100ml细菌过夜培养液，5000rpm离心10分钟，去上清液。
2、加TE悬浮沉淀，并加10%S0S，50ul20mg/ml（或1mg干粉）蛋白酶K，混匀，37℃保温1小时。
绿色荧光蛋白的诱导表达与观察(1)
实验试剂与仪器
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. LB液体培养基（卡那抗性） pET28-GFP菌液（BL21菌株） IPTG 低温摇床 分光光度计 离心机 荧光显微镜
实验步骤
1. 将2 ml pET28-GFP菌液转接至50 ml LB液体培养基中，37℃振荡摇菌2-3小时； 2. 分光光度计测菌液OD值，当OD值达到0.4-1之间时可进行诱导； 3. 向菌液中加入25 ul IPTG母液（1 M/L）至终浓度为0.5mM； 4. 28 ℃ 诱导过夜。 5. 第二天离心收集菌体于-20 ℃保存。
3. 表达载体pET-28a
4. 荧光显微镜是以紫外线为光源， 用以照射被检物体， 使之发出 荧光， 然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微 镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。 5.最早出现的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是由下 村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现，之 后又在海洋珊瑚虫中分离得到了第二种GFP。其中水母GFP是由238 氨基酸组成的单体蛋白质，分子量约27KD，GFP荧光的产生主要是 在氧气存在下，分子内第67位的甘氨酸的酰胺对第65位丝氨酸的羧 基的亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基，第66位酪氨酸的α-2β键脱 氢反应之后，导致芳香团与咪唑基结合，这样GFP分子中就形成对 羧基苯甲酸唑环酮生色团发出荧光。
绿色荧光蛋白的诱导表达与观察
实验目的
1. 掌握在大肠杆菌中诱导蛋白表达的实验方 法和实验方法
2. 了解原核表达的原理和荧光显微镜的工作 原理
实验பைடு நூலகம்理
1. E . coli 表达系统 E . coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化 入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主 菌内表达目的蛋白质（绿色荧光蛋白），并通过荧光 显微镜进行观察。 2. 外源基因的诱导表达 提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将 宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减 轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本 实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源 基因表达。不同的表达质粒表达方法并不完全相同， 因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达与检测
绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达与检测一、背景介绍1．绿色荧光蛋白1955年，Davenport和Nicol 在太平洋海里的一种发光生物—维多利亚水母(Aequorea victoria)中发现并发表了荧光蛋白的生物发光现象，但是对生物发光现象的机理并不了解。
1962年，日本科学家下村修在水母中纯化鉴定出了一种能催化化学发光的蛋白质分子并将其命名为aequorin，aequorin能将化学能转化为光能，从而产生出波长为470nm的蓝色光(lmax=470nm)，但是水母发出的光是独有的绿色，因此水母发光的蛋白质并非aequorin。
与此同时，发现和分离了一个受紫外线激发能发出绿色荧光的蛋白质—绿色荧光蛋白(GFP)。
1971年，Morin和Hastings提出了GFP这个名称。
1985到1992年间，科学家Douglas Prasher 测定完成了aequorin 和GFP的基因和蛋白质序列，并通过蛋白质序列分析和核磁共振分光术(NMR spectroscopy)确定了GFP发光位点。
1994年，美国科学家钱永健开始改造GFP，目前所用的大多数是钱永健实验室改造后的变种，有的荧光更强，有的可激活、变色。
1996年，解析得到了GFP的晶体结构，它的发光过程是也在日后的应用中得到了解答。
纵观整个过程，从1961年到1974年，下村修的研究遥遥领先，却很少有人注意。
在1974年以后，特别是八十年代后，绿色荧光蛋白的研究得到了广泛的重视和发展。
绿色荧光蛋白，分子质量约为28kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，经共价键连接而成对羟苯甲基咪唑烷酮，它可以被光激发产生荧光，是主要发光的位置。
绿色荧光蛋白分子的形状呈圆柱形，就像一个桶，发光的基团位于桶中央，因此，它可形象地比喻成一个装有色素的“油漆桶”。
其发光团的形成不具有物种专一性，发出的荧光稳定，且不需要依赖其他基质而发光。
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绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达张历涵2013141241098彭千2013141241068一、质粒转化入感受态细胞并培养1、原理实验室提供的质粒首先要转入大肠杆菌进行培养与增殖，制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。
所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA(重组质粒)引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
2、实验步骤2.1 DH-5a和BL・21感受态细胞的制备(1) 将0~4 C保存的DH-5a和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37 C下250 r/min过夜培养16 h °(2) 将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37 C活化培养2〜3 h至OD=0.3〜0.5。
(3) 取1.5mL菌液转入EP管中，置于冰上10 min,然后于4 °C下5000 r/min离心5 min。
弃上清液，沉淀加入0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCI2缓和悬菌。
冰上放置15-30 min 后，4 C 下5000 r/min 离心10 min。
(4) 弃上清液，沉淀用0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCI2(含15%甘油)缓和悬菌，放在一20 C冰箱内保存。
2.2感受态细胞的转化(1) 取制备好的感受态细胞100卩I,冰上解冻，均匀悬浮。
(2) 加入2卩丨酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。
(3) 42 C水浴中热击70 sec后，冰上放置2 min。
(4) 加入200卩丨LB液体培养基，37C, 50-100 rpm振荡培养1h。
(5) 取200卩I悬浮细胞涂布在含合适抗生素的LB固体培养基上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置1-2 h后，封口膜封好平皿，37 C培养倒置12-16 ho二、质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测1、原理：首先选择好将绿色荧光蛋白导入大肠杆菌的载体，一般选用pET-28a质粒，因为该质粒具有多酶切割位点，并且导入外源基因后可以充分表达。
已知PEGFP-N3 质粒上携带表达绿色荧光蛋白的基因，此基因作为目的基因pET-28a质粒作为载体进行重组前需要先提取并检测。
使用碱裂解法提取质粒，用到3种溶液，溶液I ： 50 mM葡萄糖、25 mM Tris・CI、10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II : 0.2 N NaOH、1% SDS;溶液III : 3M 醋酸钾、2 M醋酸。
选用适当浓度和适当pH值的Tris-CI溶液来调节溶液pho加入的是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制 长。
此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。
溶液 II中NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂，会使细胞膜从双层膜向微囊结构的相变化， SDS 为下一步做铺垫。
溶液L1I 的作用SDS 在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS 能与 蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个 SDS 分子，所以沉淀也将溶液中 的大部分蛋白质沉淀下来。
溶液中的K+置换了 SDS 中的Na+而形成了不溶性的 PDS ，高浓度的盐使沉淀更完全。
同时，由于基因组DNA 很长，容易被PDS 共沉 淀。
2 M 的醋酸可以中和NaOH,因为长时间的碱性条件会打断DNA 。
基因 组DNA 一旦发生断裂，小于100 kb 的片断，就不容易与PDS 共沉淀。
所以碱处理的时间 要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNA 污染。
这 一步操作混合均匀后在冰上放置，可以使 PDS 沉淀更充分。
衽pH 为8.0-8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负 电，在电泳时向正极移动。
采用适当浓度的琼脂糖凝胶介质作为电泳支持物，在分子 筛作用下，事分子大小和构象不同的核酸分子涌动率出现较大的差异， 从 而达到分离核酸片段检测其大小的目的。
核酸分子中嵌入荧光染料(如漠化乙锭)后， 在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
在质粒提取的过程中，由于操作原因，提 取的质粒可能有三种：线性DNA 、开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。
当 提取的质粒 DNA 电泳时，同一质粒DNA 泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开环。
2、实验步骤 2.1将目的基因质粒的大菌种接种衽液体培养基中(相应浓度抗生素) ，37C 培 养过夜。
2.2收集菌体将扩增的菌体收集1.5mlEP 管中。
每次4C, 12000r/min 离心2min ，弃上清液后 重 复一次，弃上清液。
2.3裂解菌体(1) 将菌体沉淀重悬于100卩丨用冰预冷的溶液I 中，剧烈振荡10min.(2)加200卩I 新配制 的溶液U,盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内溶 物5不可强烈振荡，放置冰上5min 左右。
(3) 加150 卩I 用冰预冷的溶液川，盖紧管口，将管倒置后温和地振荡 10s ，使 溶液川在粘稠的细菌裂解物分散均匀，置冰上 15mino(4) 4C 、10000r/min 离心5min ，将上清液转移到另一离心管中，并定量上清液的 体积。
24提取质粒DNA(1) 加等体积酚：氯仿(1： 1)，于上清夜中'振荡混合'4C 、10000r/min ，离心 10min ，将上清液转移到另一离心管中，冰定量上清液的体积。
(2) 加2倍体积的无水乙醇和0.1体积的3mol/L NaAc ，室温下沉淀质粒DNA ，振 葡萄糖可以使悬浮后的菌不会快速沉积到管子底部。
EDTA DNase 的活性和微生物生荡混合，放置30min °(3) 4C、12000r/min离心30min。
小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除尽。
(4) 用冰冷的1 ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀2次(每次用500I )，不要搅起沉淀，弃上清、倒置于滤纸上，使沉淀干燥。
(5) 保存质粒取适量TE缓冲液溶解质粒DNA，混匀后・20C保存备用。
2.5 DNA琼脂糖凝胶电泳的检测(1) 装好制胶装置［用胶带将洗净、干燥的制胶板两端封好(一定封严，不能留缝隙),］使用水平仪，将胶板调至水平，插入适当梳子。
(2) 将1g琼脂糖加入30ml 1X TAE电泳缓冲液中，摇匀。
在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解(冷却到60C,加入1卩丨的Goldview，并摇匀)，则为1 %琼脂糖凝胶液。
(3) 将溶解的琼脂糖(约50C)倒入，室温冷却凝固。
(4) 充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中(注意：DNA样品孔应朝向负电极一端)，加1 XTAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1mm。
(5) 用移液器吸取质粒样品5卩I于封口膜上，再加入1卩丨的6X加样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。
(6) 打幵电源幵尖，调节电压至100V，可见蓝条带由负极向正极移动。
(7) 当蓝条带移动到距凝胶前沿1〜2cm处，停止电泳(8) 将凝胶置于紫外线透射仪上，打开紫外灯，DNA存在处显出荧光条带。
三、PCR、酶切等方法获取目的基因，酶切连接重组质粒1、原理PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核昔酸引物，经酶促合成特异的DNA片段的体外方法。
反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA得以迅速扩增。
置待扩增DNA于高温下解链成为单链DNA模板，人工合成的两个寡核苜酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72C将单核昔酸从引物3,端开始掺入，沿模板5—3方向延伸，合成DNA新链。
目的基因与载体扩增后要进行重组，利用共有的酶切位点即Bam HI和Not I 两个位点进行双酶切，产生相同的粘性末端便于在DNA连接酶的作用下重新连接。
2、实验步骤2.1 PCR实验(1) 在0.2ml EP管内配置PCR反应体系一个。
(2) 混匀后瞬时离心。
(3) 放入PCR仪中，设置反应程序。
2.2酶切实验(1) 分别取两支0.2ml EP管做好标记。
(2) 两个EP管中分别配置两个体系即各加入一种质粒和两种限制性内切酶。
(3) 将两支EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱37E酶切1h。
(4) 可取5卩I进行电泳检测。
2.3 DNA的连接重组(1) 在EP管中加入缓冲液，酶切后的载体质粒和荧光蛋白质粒以及DNA连接酶。
(2) EP管中液体混匀后瞬时离心，放入培养箱22T反应20min, -20C下保存用于转化。
四、重组质粒导入DH5a扩增1、原理重组质粒虽已构建完毕，但是为得到大量的重组质粒，需要将重组质粒导入到DH5a中进行扩增。
为了将重组质粒导入细菌中，我们首先得使得细菌处于易于吸收外源DNA得感受态。
其原理是细菌处于0C，在有CaCI2存在的低渗溶液中，菌细胞便会膨胀成球形，易于吸收外源DNA。
再加之转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的疑基■钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 C短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
在将重组质粒导入细菌之后，就需要将细菌置于非选择性培养基上培养一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型得到表达。
然后，再将培养的到的细胞转接到含有Kana的LB固体培养基上，便可以鉴定和筛选出重组子。
2、实验步骤(1) 取出感受态细胞DH5a让其在冰上自然解冻，每200J解冻的感受态细胞加入整管连接产物，混匀后冰浴30 min。
(2) 42E热冲击90秒，立即置于冰浴5min。
(3) 再在感受态细胞混合物中加入0.8ml的LB培养基，于37弋的摇床中培养1 h °(4) 1h后，6000r/min离心3min,去掉上清液(约留200 pl的培养液)，摇匀菌快。
(5) 用玻璃涂布器将溶液均匀地涂布在含Kana的LB固体培养基上，正置培养皿半小时后，37 C倒置培养皿过夜。
(6) 第二天早晨，观察实验结果。
五、菌落PCR鉴定阳性克隆1、原理菌落PCR可不必提取目的基因DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCRT增，省时少力。
在实验过程中，我们特意使用载体上的通用引物来筛选阳性克隆。
2、实验步骤(1 )在0.2ml的EP管内配制25 PPCR反应体系一个：18.5 plddH2O,2.5pl10*Buffer 1.5jMgCI2, 1 J4*dNTP, 0.5 p 的引物1 » 0.5 p 的引物2 0.5 p 的Taq 酶，挑菌落一个。