1第二章微生物学研究方法
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观 察 外 部 形 态
扫描电子显微镜
葡萄球菌
双歧杆菌
扫描电子显微镜下的微生物
肺炎双球菌 产鞭毛细菌的鞭毛
Group A streptococcus (S. pyogenes),A型化脓性链球菌
Streptococcus pyogenes – coccoid prokaryote (dividing)
肉毒梭菌
C. botulinum
Rod shaped prokaryote. Vegetative and spore stages: note the flagella on the vegetative cells. Causes botulism. SEM left x15,400, right x12,800
螺旋体
超高倍相差显微镜
倒置相差显微镜
倒置相差显微镜
相差状态 非相差状态
婴儿皮肤干细胞?
细胞培养(牛腱)中酵母菌污染 061222,20x
细胞培养(牛腱)中酵母菌污染
061222,20x,相差
倒置相差显微镜
相差状态 非相差状态
婴儿皮肤干细胞?
倒置相差荧光显微镜
荧光显微镜
链球菌
S. pneumoniae
3、显微镜的主要类型
• • • • • • • • 普通光学显微镜 (单筒、双筒目镜) 暗视野显微镜 倒置相差显微镜 荧光显微镜 扫描电子显微镜 透视电子显微镜 扫描隧道显微镜 激光扫描共聚焦显微镜
普通光学显微镜 (单筒、双筒目镜
光学显微镜下的大肠杆菌
光学显微镜下的葡萄球菌 G+
白喉棒状杆菌革兰氏染色, 白喉棒状杆菌革兰氏染色,×1000
• 随着放大倍数的增加,物镜的镜筒逐渐增长,但 物镜镜口的直径越小; • 物镜外壳的标记: 4×/0.1、10 ×/0.25、40 ×/0.65、100 ×/ 1.25 表示:放大倍数/NA(数 值孔径值)
3)显微镜的总放大率
• 显微镜总放大率 目镜放大倍数×物镜放大倍数 显微镜总放大率=目镜放大倍数× 目镜放大倍数 • 由于通常目镜放大倍数为10 ×,故作图时常只 标示物镜放大倍数即可。
2、显微镜的结构 、
• 机械装置: 机械装置: 镜筒、物镜转换器、载物台、 镜筒、物镜转换器、载物台、 持片器、 持片器、调焦螺旋 • 光学部分: 光学部分: 目镜、物镜、聚光器、 目镜、物镜、聚光器、光栅
3、 分辨率 、
• 分辨率: 辨别两点之间最小距离的能力 分辨率: 辨别两点之间最小距离的能力。 最小可分辨距离=0.5λ/nsinθ, 其中:λ为光源波长,θ为物镜镜口角的半数, 取决于物镜的直径与工作距离,n为载玻片与物 镜间介质的折光率. 空气(n=1); 香柏油(n=1.52); 液体石蜡( n=1.515) nsinθ也被表示为数值孔径值(numerical aperture,NA),它是决定物镜性能的最重要指标。
无菌操作技术
能够保证无菌状态的操作称为无菌操作 无菌操作 接种环,酒精灯 试管、棉塞(硅胶塞)
无菌操作技术
无菌操作技术
三、无菌操作要求
1、操作环境无菌(接触面、空气的无菌) 2、操作过程无菌 (不与有菌物品接触) 3、操作介质无菌(所接触物品均应无菌) 4、操作人员的无菌(工作服,手的消毒,口罩)
1、显微镜技术发展简史 、
• 1886年,德国科学家恩斯特.阿贝和卡尔 蔡斯制作了一 年 德国科学家恩斯特 阿贝和卡尔.蔡斯制作了一 阿贝和卡尔 台相似的显微镜。马蹄形的底座增加了显微镜的稳固性。 台相似的显微镜。马蹄形的底座增加了显微镜的稳固性。 底部的镜子能汇聚并反射光线使光线透过上放的标本。 底部的镜子能汇聚并反射光线使光线透过上放的标本。 • 以后光学显微镜中相继出现了相差、暗视野和荧光等新 以后光学显微镜中相继出现了相差 暗视野和荧光等新 相差、 附件,加上良好的制片和染色技术 制片和染色技术等发明又大大推动了 附件,加上良好的制片和染色技术等发明又大大推动了 对微生物形态、解剖和分类等方面的研究。 对微生物形态、解剖和分类等方面的研究。 • 1933年,德国物理学家恩斯特 卢斯卡创造了第一台电 年 德国物理学家恩斯特.卢斯卡创造了第一台电 子显微镜( )。这种显微镜是通过发射电子穿过极 子显微镜(TEM)。这种显微镜是通过发射电子穿过极 )。 薄的标本切片来成像的。 薄的标本切片来成像的。对于观察细胞的内部结构非常 有用, 能把标本放大50万倍 有用,TEM能把标本放大 万倍。 能把标本放大 万倍。 • 此后的与之配套的各种新技术和新方法的应用,使微生 此后的与之配套的各种新技术和新方法的应用, 物学的研究从细胞水平逐渐向亚细胞和分子水平迈进。 物学的研究从细胞水平逐渐向亚细胞和分子水平迈进。
Streptococcus pneumoniae in spinal fluid.
FA stain (digitally colorized). CDC/Dr. M.S. Mitchell
激光共聚焦扫描显微镜
E. coli with fimbriae
激光扫描共聚焦显微镜
产单鞭毛细菌的形态
扫描电子显微镜
Rod-Shaped Bacterium, E. coli (division) (SEM x22,245) E. coli (0157:H7) a rod prokaryote. Hemorrhagic type © Dr Dennis Kunkel, University of Hawaii. Used with permission
四链球菌
链球菌
乳酸菌
细菌的特殊结构______单鞭毛 单鞭毛 细菌的特殊结构
细菌的特殊结构____鞭毛(周身) 鞭毛(周身) 细菌的特殊结构 鞭毛
竹节状
G+ 杆菌
肉毒梭菌芽孢
G-梭杆菌
鼓锤状
细菌的特殊结构__芽孢 破伤风梭菌芽孢) 细菌的特殊结构 芽孢 (破伤风梭菌芽孢)
产气荚膜梭菌芽孢 气荚膜梭菌芽孢
一、纯种分离技术概述
• 微生物混群杂居,纯种分离技术是 人类揭开微生物世界奥秘的重要手 段。 • 要揭示处于杂居混生状态的某一微 生物的特点,以及它们对人类是有 益还是有害,就必须采用在无菌技 术基础上的纯种分离方法。 • 早期对微生物群体进行单个纯化分 离者是李斯特。 • 取得突破的是柯赫发明的培养皿琼 脂平板技术。 • 至今仍被广泛地应用于微生物菌种 的筛选、鉴定、育种、计数及各种 生物测定等工作中。
第二章 微生物学研究方法
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 显微镜技术 无菌技术 纯种分离纯化技术 纯种培养技术 微生物保藏技术
*复习思考题: P 36-37
第一节 显微镜技术
1、显微镜的发展简史 2、显微镜的结构、分辨率、总放大倍率 3、显微镜的主要类型及显微镜下的微生物
1、显微镜技术发展简史 、 • 1590年, 第一台显微镜是由荷兰的詹森父子发明 年 的。两片凸玻璃片装到一个金属管子里 。 • 1665年,英国物理学家罗伯特 虎克(Robert 虎克( 年 英国物理学家罗伯特.虎克 Hooks)把软木切成极薄的薄片放在自己制造的 ) 一架复式显微镜下观察, 一架复式显微镜下观察,在显微镜的视野里发现 竟有许多蜂窝状的小室, 竟有许多蜂窝状的小室,他给这些小室取名为细 )。加油灯为标本照明 胞(cell)。加油灯为标本照明。 )。加油灯为标本照明。 • 1683年,列文虎克在显微镜中加了一块透镜, 年 列文虎克在显微镜中加了一块透镜, 使标本放大266倍。列文虎克是第一个用显微镜 使标本放大 倍 来观察和描述微生物的。 来观察和描述微生物的。
二、微生物实验室常用器具及其灭菌
• 试管、三角烧瓶、棉塞、培养皿、玻璃涂棒: 高压蒸汽灭菌或干热灭菌。 • 接种环、接种针 烧灼灭菌
固体培养基
• 培养基 培养基:培养微生物的营养基质。将各种营养物 质按照一定比例溶解于水,配制而成的适合微生 物生长繁殖的营养基质。 在液体培养基中加入适当的凝固剂(琼脂、 明胶),就可制成固体(1-2%)或半固体(0.70.9%)培养基。 • 微生物培养基通常进行高压灭菌,对于不耐热的 成份用过滤除菌的方法。
透视电子显微镜
制作切片,观察细胞内部结构
光学显微镜下的四联球菌, 光学显微镜下的四联球菌,100x 四联球菌
透视电镜下的四联球菌
产芽孢细菌在光镜和透射电镜下的形态
成熟芽胞的电镜照片
第二节 无菌技术
一、无菌技术 无菌技术 二、无菌操作 三、无菌操作的要求
一、无菌技术的概念
无菌技术是在分离、转接及培养纯培养物时防止 其污染环境及被其他微生物污染的技术。 能够保证无菌状态的操作称为无菌操作,能够实 无菌操作, 无菌操作 现无菌操作的技术,称为无菌技术。 现无菌操作的技术,称为无菌技术 无菌概念:实际上是指“有菌概念”,即微生物 无处不在,操作时应时刻谨防被其它微生物污染。 现代无菌技术是由法国人阿贝特( Appert )在 食品保藏中偶然发现的。 而对灭菌技术的原理等作出科学解释的是巴斯德, 他的曲颈瓶实验,不仅彻底否定了当时十分流行的“生 命自然发生的学说”,而且为微生物学中的无菌技术的 创立和发展奠定了理论和实践基础。
无菌操作箱
超净工作台
无菌实验室或工作室
人、空气、台面、屋顶、墙壁、地面净化
第三节 微生物纯种分离技术
一、纯种分离技术概述 纯种分离技术概述 二、微生物实验室常用器具及其灭菌 微生物实验室常用器具及其灭菌 三、纯种分离的技术方法 纯种分离的技术方法 1)固体培养基纯种分离技术 )固体培养基纯种分离技术 (1) 稀释倒平板法; (2) 涂布平板法 稀释倒平板法; (3) 平板划线分离法 平板划线分离法; (4) 稀释摇管法 稀释摇管法——厌氧微生物的分离 厌氧微生物的分离 液体培养基纯种分离技术——稀释法(不可靠) 稀释法( 2)液体培养基纯种分离技术 稀释法 不可靠) 单细胞(孢子)分离——显微分离 3)单细胞(孢子)分离 显微分离 4)选择培养 ① 选择平板培养 ② 富集培养
© Dr Dennis Kunkel, University of Hawaii. Used with permission
假单胞菌
பைடு நூலகம்
PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Scanning Electron Micrographs of Pseudomonas aeruginosa CDC
ENTEROBACTERIACEAE 肠细菌
真空负压式过滤产品
(1) 稀释倒平板法 )
将欲分离菌液稀释成不同稀释度,取各稀释度菌液少量,加入 无菌培养皿,然后加入灭菌温热(大约45~50 ℃ )的培养基,混匀 培养。
• 肉眼:正常分辨能力一般为0.25mm;
• 光学显微镜:以λ=450nm的可见光为光源时, 4×、 10 ×、 40~45 ×、90~100 ×(油镜) 物镜 工作距离17~20mm、4~8mm、0.5~0.7mm、0.1mm; 工作距离 2.3µm、 0.9µm、 0.35µm、 0.18µm; 分辨率 光学显微镜有效的最高放大倍数只能达到1000~1500倍。
Group A strep. SEM x56,000 © Dr Dennis Kunkel, University of Hawaii. Used with permission
Scanning Electron Micrograph of Streptococcus pneumoniae. CDC/Dr. Richard Facklam rrf2@cdc.gov 肺炎链球菌
G+
肺 炎 双 球 菌
细菌的特殊结构_____荚膜 荚膜 细菌的特殊结构
肺炎球菌荚膜
暗视野显微镜
• 暗视野显微镜 的聚光镜中央 有挡光片,使 照明光线不直 接进人物镜, 只允许被标本 反射和衍射的 光线进入物镜, 因而视野的背 景是黑的,物 体的边缘是亮 的。 • 常用于观察活 细胞的结构和 形态。
VIBRIOS弧菌
霍乱弧菌
Vibrio cholerae - vibrio-shaped prokaryote that causes cholera (x 15,575) © Dr Dennis Kunkel, University of Hawaii. Used with permission
扫描电子显微镜
葡萄球菌
双歧杆菌
扫描电子显微镜下的微生物
肺炎双球菌 产鞭毛细菌的鞭毛
Group A streptococcus (S. pyogenes),A型化脓性链球菌
Streptococcus pyogenes – coccoid prokaryote (dividing)
肉毒梭菌
C. botulinum
Rod shaped prokaryote. Vegetative and spore stages: note the flagella on the vegetative cells. Causes botulism. SEM left x15,400, right x12,800
螺旋体
超高倍相差显微镜
倒置相差显微镜
倒置相差显微镜
相差状态 非相差状态
婴儿皮肤干细胞?
细胞培养(牛腱)中酵母菌污染 061222,20x
细胞培养(牛腱)中酵母菌污染
061222,20x,相差
倒置相差显微镜
相差状态 非相差状态
婴儿皮肤干细胞?
倒置相差荧光显微镜
荧光显微镜
链球菌
S. pneumoniae
3、显微镜的主要类型
• • • • • • • • 普通光学显微镜 (单筒、双筒目镜) 暗视野显微镜 倒置相差显微镜 荧光显微镜 扫描电子显微镜 透视电子显微镜 扫描隧道显微镜 激光扫描共聚焦显微镜
普通光学显微镜 (单筒、双筒目镜
光学显微镜下的大肠杆菌
光学显微镜下的葡萄球菌 G+
白喉棒状杆菌革兰氏染色, 白喉棒状杆菌革兰氏染色,×1000
• 随着放大倍数的增加,物镜的镜筒逐渐增长,但 物镜镜口的直径越小; • 物镜外壳的标记: 4×/0.1、10 ×/0.25、40 ×/0.65、100 ×/ 1.25 表示:放大倍数/NA(数 值孔径值)
3)显微镜的总放大率
• 显微镜总放大率 目镜放大倍数×物镜放大倍数 显微镜总放大率=目镜放大倍数× 目镜放大倍数 • 由于通常目镜放大倍数为10 ×,故作图时常只 标示物镜放大倍数即可。
2、显微镜的结构 、
• 机械装置: 机械装置: 镜筒、物镜转换器、载物台、 镜筒、物镜转换器、载物台、 持片器、 持片器、调焦螺旋 • 光学部分: 光学部分: 目镜、物镜、聚光器、 目镜、物镜、聚光器、光栅
3、 分辨率 、
• 分辨率: 辨别两点之间最小距离的能力 分辨率: 辨别两点之间最小距离的能力。 最小可分辨距离=0.5λ/nsinθ, 其中:λ为光源波长,θ为物镜镜口角的半数, 取决于物镜的直径与工作距离,n为载玻片与物 镜间介质的折光率. 空气(n=1); 香柏油(n=1.52); 液体石蜡( n=1.515) nsinθ也被表示为数值孔径值(numerical aperture,NA),它是决定物镜性能的最重要指标。
无菌操作技术
能够保证无菌状态的操作称为无菌操作 无菌操作 接种环,酒精灯 试管、棉塞(硅胶塞)
无菌操作技术
无菌操作技术
三、无菌操作要求
1、操作环境无菌(接触面、空气的无菌) 2、操作过程无菌 (不与有菌物品接触) 3、操作介质无菌(所接触物品均应无菌) 4、操作人员的无菌(工作服,手的消毒,口罩)
1、显微镜技术发展简史 、
• 1886年,德国科学家恩斯特.阿贝和卡尔 蔡斯制作了一 年 德国科学家恩斯特 阿贝和卡尔.蔡斯制作了一 阿贝和卡尔 台相似的显微镜。马蹄形的底座增加了显微镜的稳固性。 台相似的显微镜。马蹄形的底座增加了显微镜的稳固性。 底部的镜子能汇聚并反射光线使光线透过上放的标本。 底部的镜子能汇聚并反射光线使光线透过上放的标本。 • 以后光学显微镜中相继出现了相差、暗视野和荧光等新 以后光学显微镜中相继出现了相差 暗视野和荧光等新 相差、 附件,加上良好的制片和染色技术 制片和染色技术等发明又大大推动了 附件,加上良好的制片和染色技术等发明又大大推动了 对微生物形态、解剖和分类等方面的研究。 对微生物形态、解剖和分类等方面的研究。 • 1933年,德国物理学家恩斯特 卢斯卡创造了第一台电 年 德国物理学家恩斯特.卢斯卡创造了第一台电 子显微镜( )。这种显微镜是通过发射电子穿过极 子显微镜(TEM)。这种显微镜是通过发射电子穿过极 )。 薄的标本切片来成像的。 薄的标本切片来成像的。对于观察细胞的内部结构非常 有用, 能把标本放大50万倍 有用,TEM能把标本放大 万倍。 能把标本放大 万倍。 • 此后的与之配套的各种新技术和新方法的应用,使微生 此后的与之配套的各种新技术和新方法的应用, 物学的研究从细胞水平逐渐向亚细胞和分子水平迈进。 物学的研究从细胞水平逐渐向亚细胞和分子水平迈进。
Streptococcus pneumoniae in spinal fluid.
FA stain (digitally colorized). CDC/Dr. M.S. Mitchell
激光共聚焦扫描显微镜
E. coli with fimbriae
激光扫描共聚焦显微镜
产单鞭毛细菌的形态
扫描电子显微镜
Rod-Shaped Bacterium, E. coli (division) (SEM x22,245) E. coli (0157:H7) a rod prokaryote. Hemorrhagic type © Dr Dennis Kunkel, University of Hawaii. Used with permission
四链球菌
链球菌
乳酸菌
细菌的特殊结构______单鞭毛 单鞭毛 细菌的特殊结构
细菌的特殊结构____鞭毛(周身) 鞭毛(周身) 细菌的特殊结构 鞭毛
竹节状
G+ 杆菌
肉毒梭菌芽孢
G-梭杆菌
鼓锤状
细菌的特殊结构__芽孢 破伤风梭菌芽孢) 细菌的特殊结构 芽孢 (破伤风梭菌芽孢)
产气荚膜梭菌芽孢 气荚膜梭菌芽孢
一、纯种分离技术概述
• 微生物混群杂居,纯种分离技术是 人类揭开微生物世界奥秘的重要手 段。 • 要揭示处于杂居混生状态的某一微 生物的特点,以及它们对人类是有 益还是有害,就必须采用在无菌技 术基础上的纯种分离方法。 • 早期对微生物群体进行单个纯化分 离者是李斯特。 • 取得突破的是柯赫发明的培养皿琼 脂平板技术。 • 至今仍被广泛地应用于微生物菌种 的筛选、鉴定、育种、计数及各种 生物测定等工作中。
第二章 微生物学研究方法
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 显微镜技术 无菌技术 纯种分离纯化技术 纯种培养技术 微生物保藏技术
*复习思考题: P 36-37
第一节 显微镜技术
1、显微镜的发展简史 2、显微镜的结构、分辨率、总放大倍率 3、显微镜的主要类型及显微镜下的微生物
1、显微镜技术发展简史 、 • 1590年, 第一台显微镜是由荷兰的詹森父子发明 年 的。两片凸玻璃片装到一个金属管子里 。 • 1665年,英国物理学家罗伯特 虎克(Robert 虎克( 年 英国物理学家罗伯特.虎克 Hooks)把软木切成极薄的薄片放在自己制造的 ) 一架复式显微镜下观察, 一架复式显微镜下观察,在显微镜的视野里发现 竟有许多蜂窝状的小室, 竟有许多蜂窝状的小室,他给这些小室取名为细 )。加油灯为标本照明 胞(cell)。加油灯为标本照明。 )。加油灯为标本照明。 • 1683年,列文虎克在显微镜中加了一块透镜, 年 列文虎克在显微镜中加了一块透镜, 使标本放大266倍。列文虎克是第一个用显微镜 使标本放大 倍 来观察和描述微生物的。 来观察和描述微生物的。
二、微生物实验室常用器具及其灭菌
• 试管、三角烧瓶、棉塞、培养皿、玻璃涂棒: 高压蒸汽灭菌或干热灭菌。 • 接种环、接种针 烧灼灭菌
固体培养基
• 培养基 培养基:培养微生物的营养基质。将各种营养物 质按照一定比例溶解于水,配制而成的适合微生 物生长繁殖的营养基质。 在液体培养基中加入适当的凝固剂(琼脂、 明胶),就可制成固体(1-2%)或半固体(0.70.9%)培养基。 • 微生物培养基通常进行高压灭菌,对于不耐热的 成份用过滤除菌的方法。
透视电子显微镜
制作切片,观察细胞内部结构
光学显微镜下的四联球菌, 光学显微镜下的四联球菌,100x 四联球菌
透视电镜下的四联球菌
产芽孢细菌在光镜和透射电镜下的形态
成熟芽胞的电镜照片
第二节 无菌技术
一、无菌技术 无菌技术 二、无菌操作 三、无菌操作的要求
一、无菌技术的概念
无菌技术是在分离、转接及培养纯培养物时防止 其污染环境及被其他微生物污染的技术。 能够保证无菌状态的操作称为无菌操作,能够实 无菌操作, 无菌操作 现无菌操作的技术,称为无菌技术。 现无菌操作的技术,称为无菌技术 无菌概念:实际上是指“有菌概念”,即微生物 无处不在,操作时应时刻谨防被其它微生物污染。 现代无菌技术是由法国人阿贝特( Appert )在 食品保藏中偶然发现的。 而对灭菌技术的原理等作出科学解释的是巴斯德, 他的曲颈瓶实验,不仅彻底否定了当时十分流行的“生 命自然发生的学说”,而且为微生物学中的无菌技术的 创立和发展奠定了理论和实践基础。
无菌操作箱
超净工作台
无菌实验室或工作室
人、空气、台面、屋顶、墙壁、地面净化
第三节 微生物纯种分离技术
一、纯种分离技术概述 纯种分离技术概述 二、微生物实验室常用器具及其灭菌 微生物实验室常用器具及其灭菌 三、纯种分离的技术方法 纯种分离的技术方法 1)固体培养基纯种分离技术 )固体培养基纯种分离技术 (1) 稀释倒平板法; (2) 涂布平板法 稀释倒平板法; (3) 平板划线分离法 平板划线分离法; (4) 稀释摇管法 稀释摇管法——厌氧微生物的分离 厌氧微生物的分离 液体培养基纯种分离技术——稀释法(不可靠) 稀释法( 2)液体培养基纯种分离技术 稀释法 不可靠) 单细胞(孢子)分离——显微分离 3)单细胞(孢子)分离 显微分离 4)选择培养 ① 选择平板培养 ② 富集培养
© Dr Dennis Kunkel, University of Hawaii. Used with permission
假单胞菌
பைடு நூலகம்
PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Scanning Electron Micrographs of Pseudomonas aeruginosa CDC
ENTEROBACTERIACEAE 肠细菌
真空负压式过滤产品
(1) 稀释倒平板法 )
将欲分离菌液稀释成不同稀释度,取各稀释度菌液少量,加入 无菌培养皿,然后加入灭菌温热(大约45~50 ℃ )的培养基,混匀 培养。
• 肉眼:正常分辨能力一般为0.25mm;
• 光学显微镜:以λ=450nm的可见光为光源时, 4×、 10 ×、 40~45 ×、90~100 ×(油镜) 物镜 工作距离17~20mm、4~8mm、0.5~0.7mm、0.1mm; 工作距离 2.3µm、 0.9µm、 0.35µm、 0.18µm; 分辨率 光学显微镜有效的最高放大倍数只能达到1000~1500倍。
Group A strep. SEM x56,000 © Dr Dennis Kunkel, University of Hawaii. Used with permission
Scanning Electron Micrograph of Streptococcus pneumoniae. CDC/Dr. Richard Facklam rrf2@cdc.gov 肺炎链球菌
G+
肺 炎 双 球 菌
细菌的特殊结构_____荚膜 荚膜 细菌的特殊结构
肺炎球菌荚膜
暗视野显微镜
• 暗视野显微镜 的聚光镜中央 有挡光片,使 照明光线不直 接进人物镜, 只允许被标本 反射和衍射的 光线进入物镜, 因而视野的背 景是黑的,物 体的边缘是亮 的。 • 常用于观察活 细胞的结构和 形态。
VIBRIOS弧菌
霍乱弧菌
Vibrio cholerae - vibrio-shaped prokaryote that causes cholera (x 15,575) © Dr Dennis Kunkel, University of Hawaii. Used with permission