青霉素发酵综合性实验

发酵工艺学综合性实验：青霉素的发酵

一、目的与要求

通过实验，以具体的青霉素发酵生产工艺流程为例，掌握发酵原理，掌握种子制备、发酵过程控制、与发酵相关参数的检测，掌握效价测定方法，为学生提供理论联系实际的机会。

二、材料和用品

菌种：产黄青霉、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌

仪器：灭菌锅、培养箱、超净工作台、大三角瓶、烘箱、水浴锅

三、实验内容

（一）、发酵过程控制

1.培养基配制

培养基的组成（％）：PDA培养基。

2．培养基的分装及其灭菌

将配好的培养基分装到250mL摇瓶中，每瓶100mL，最后将培养基置于121℃灭菌20min。

3．接种

将已经活化的斜面种子（产黄青霉）接种到摇瓶中30℃摇床中培养。

4．观察和取样

观察发酵过程中是否存在异常情况，如发酵液颜色、气味等是否异常等情况。每12h取样一次，每次10mL左右。

4．培养时间及镜检

一般培养需要3-4d左右，然后利用镜检来检测发酵过程是否染菌。

（二）、发酵过程中生理生化指标的检测

1.利用称重法测定生长曲线

将每批次的样品（5-10mL）离心后称重，测得不同时间菌体的质量，以时间为横坐标，质量为纵坐标，得到曲线。

2.测糖

利用DNS法，测定每批次的样品（5-10mL）离心后的发酵液的还原糖的含量，以时间为横坐标，含量为纵坐标，得到曲线。

（三）、青霉素效价测定（利用抑菌圈的实验方法测定青霉素效价）

1.培养基配制LB培养基

2.指示菌的培养

选取指示菌金黄色葡萄球菌、枯草杆菌接种到灭过菌的液体培养基中，在300C左右培养24-36h。

3.抑菌试验步骤

a.取0.2mL培养好的指示菌于平皿中，每种菌做2-3个平行样。

b.用涂棒将指示菌在平皿中涂布均匀。

c.用打孔器在涂布均匀的平皿中央打孔。

d.取0.1mL不同时间取样的发酵液于孔中。

e.最后将平皿放置于300C左右培养箱中培养并观察。

四、实验结果分析

1.绘制生长曲线（即干重-t曲线）。；

2.绘制残糖变化曲线；

3.绘制青霉素效价（透明圈直径表示）变化曲线

测定菌体干重（3学时）

一、实验目的

学会测定菌体干重的方法。

二、实验原理

在不含固体的培养液中培养微生物，发酵液中的固体全市菌体，因此可以首先离心得到湿菌体后，用适当的方法干燥，得到干菌体的量可直接反映菌体生长的多少。

三、器材与试剂

培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母膏10，NaCl 5,pH7.2

摇瓶装量20%。37℃摇床恒温培养10～12h。

分析测定仪器：恒温干燥箱，分析天平

四、测定菌体干重实验操作

（1）将2个干燥的10ml离心试管放入95℃烘箱烘2h取出，放入干燥器，

待试管冷却后称重得到m空1，m空2

（2）在两试管中分别准确加入10ml发酵液，注意发酵液需摇匀。

（3）放入离心机离心，3000r/min，离心15min，注意：离心之前要将预离心的试管平衡并对称放入离心机，以免损坏离心机。

（4）同时测定该发酵液的A600值。

离心毕，拿出试管，弃去上清液，将试管和其中的菌体放入95℃烘箱烘干12h。取出试管，放入干燥器，待冷却后称重，得到m菌1，m菌2。

（5）数据记录

记录：m空1，m空2, m菌1，m菌2, A600

计算：m空均=（m空1+ m空2）/2

m菌均=（m菌1+ m菌2）/2

菌体干重= m菌均- m空均

单位菌体干重=菌体干重×1000/10（g/L）

菌体干重除以A600即得到二者的对应关系。在测定发酵过程的菌浓变化时，只要测得A600就可以计算出菌体干重。

残糖（还原糖）检测

一、实验原理

DNS为3.5二硝基水杨酸,还原糖(以葡萄糖计)与3.5二硝基水杨酸(DNS)反应,产生颜色变化,这种颜色变化与释放还原糖(以葡萄糖计)的量成正比关系，通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖生产的量

二、试剂

DNS试剂的配置方法:

溶液A:称分析纯NaoH104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。

溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。

将A、B溶液混合，加入1200ml水，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。

四、实验操作

1 葡萄糖测定

（1）1mg/mL 葡萄糖标准液

小烧杯取分析纯葡萄糖置于烘干箱中烘干至，于分析天平中准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖10mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到10mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至10mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。

（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂

将 6.3g DNS （分析天平中称取于小烧杯）和262mL 2M NaOH 溶液（大量筒称取250ml+小量筒称取12ml），加到500mL（量杯量取）含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中（在微波炉中加热1min溶解），再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。

2．制作葡萄糖标准曲线

取7 支10mL 具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。1mg/ml葡萄糖标准溶液蒸馏水 DNS 葡萄糖含量光密度值

管号（ml）（ml）（ml）（mg/ml）（OD540）

0 0 1 0.75 0

1 0.1 0.9 0.75 0.01

2 0.2 0.8 0.75 0.02

3 0.3 0.7 0.75 0.03

4 0.4 0.6 0.7

5 0.04

5 0.5 0.5 0.75 0.05

6 0.6 0.4 0.75 0.06

将各管摇匀，取试管架置于水浴锅中，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至10mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色（分光光度计预热20分钟）。调波长540nm，用0 号管调零点，测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。

3.测定样品还原糖

通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖的量。