设计碱性磷酸酶的提取、分离纯化方案
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每一制剂AKP比活性（U/mg）
溶液A制剂AKP比活性（U/mg）
碱性磷酸酶提取、分离纯化时采用的各种技 术的原因
• 通过低温预冷处理有机溶剂分级提取兔肝碱性磷 酸酶，结合SDS PAGE法检测纯化结果。对酶的比 活力测定中蛋白定量经过对Bradford法和Folin Lowry法进行比较发现Folin Lowry法在本样品体系 中灵敏度高、抗干扰能力强，适合采用此法进行 蛋白含量测定。 • 盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫 酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克）， 并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用 的盐。福林-酚试剂显色法用来测定蛋白质浓度。
设计碱性磷酸酶的提百度文库、分离纯化 方案及采用每种技术的原因， 在分 离纯化过程中怎样检测纯度？
PPT制作：颜佩妮
PPT演讲：朱泉剑
资料收集：吴倩艳、宋琴琴
目录
碱性磷酸酶的概念
碱性磷酸酶的提取、分离、纯化 碱性磷酸酶的纯化程度鉴定
碱性磷酸酶提取、分离纯化时采用的各种技术 的原因
碱性磷酸酶的概念
碱性磷酸酶是动物和微生物界普遍 存在的一种含锌酶，它在物质代谢中 起着重要的作用。碱性磷酸酶能催化 几乎所有的磷酸单酯进行水解，产生 无机磷和相应的醇、酚或精，但却不 能水解磷酸H酿类 碱性磷酸酶广泛分布于人体各内 脏器官中，其中以肝脏为最多其次为 肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织。在 碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合 物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。
离子交换层析法的原理
• 阳离子交换膜可以看作是一种高分子电解质,他的 高分子母体是不溶解的,而连接在母体上的磺酸集 团带有负电荷和可解离离子相互吸引着,他们具有 亲水性。 • 由于阳膜带负电荷,虽然原来的解离正离子受水分 子作用解离到水中,但在膜外我们通电通过电场作 用,带有正电荷的阳离子就可以通过阳膜,而阴离子 因为同性排斥而不能通过,所以具有选择透过性。
常用的有机溶剂
• 乙醇:沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白 质、核酸、多糖等生物大分子的沉析. • 丙酮:沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范 围不广. • 正丁醇:能去除与pro结合的脂类物质，使pro溶解 在溶液中.
分离纯化 AKP步骤
称取新鲜兔肝（可使用猪肝）2g。
将1g新鲜兔肝置于70℃冰箱进行预先冷冻处理后取 出，置于玻璃匀浆器内。加入0.01mol/L醋酸镁、 0.01mol/L醋酸钠混合溶液3mL，充分研磨至糊状。
将匀浆液倒入刻度离心 管中，使用4ml上述混 合缓冲液冲洗研磨器具， 将冲洗液一并转入离心 管。离心管一定要置于 冰块保护下，以后各个 步骤也要注意保持低温。
加1mL正丁醇于匀浆原液中，用玻棒充分搅匀， 然后放置冰浴中20min。用滤纸过滤，滤液置于另 一支刻度离心管中。
过滤，滤液也要冰块保护
AKP的蛋白含量测定BCA法则
碱性 BCA试剂 • 蛋白质+Cu 2＋ Cu＋ 紫色化合物 • 利用分光光度计测吸光度 • 设计标准曲线计算蛋白质含量
• 1、AKP比活性：
每ml制剂中AKP活性单位数（U）
• AKP比活性（U/mg）=
每ml制剂中蛋白质含量（mg）
• 2、纯化倍数
• 纯化倍数 =
实验原理
1. 动物肝脏中含有丰富的碱性磷酸酶（AKP）。 2. 在正丁醇中脂类不溶而蛋白质溶解，可以借此除 去与酶结合的脂类（酶也是蛋白质）。 3. 有机溶剂分步沉淀法纯化
有机沉淀法
• 实验采用有机溶剂分步沉淀法,从兔肝中提取碱性 磷酸酶. AKP溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇 或50%丙酮中则形成沉淀。通过离心可以使AKP和 其他蛋白分离，从而得到纯化。 反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度的AKP。
滤液中加入等体积的冷丙酮，立即混匀后离心 2000r/min5min，弃去上清液。在沉淀中加入0.5mol/L 醋酸镁2mL用玻棒充分搅拌使其溶解，记录溶液体积。
立即混匀后使用台式低速离心机离心 5min(2000 r/min)，弃上清液。
向沉淀中加入4.0mL0．5mol/L 醋酸镁溶液， 充分搅拌使其溶解，同时记录悬液体积向上清 液中加入95％冷乙醇，使乙醇终浓度达60％， 混匀后立即离心5min(2500r/min)，弃上清。 向沉淀中加入4．0m1 0.0lmol/L 醋酸镁一 0.01mol/L 酸酸钠溶液，充分搅拌，使其溶解。 向上余悬液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮终浓度 达33％，混匀后离心5min(2000r/min)，弃去 沉淀
AKP纯化程度鉴定
• 纯化程度用酶的比活性反应。
• 酶比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。
碱性磷酸酶的活性测定 磷酸笨二钠法
• 在pH10环境中，AKP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸 氢二钠，苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素 原经铁氰化钾氧化生成红色醌亚衍生物。
• 测定红色衍生物的吸光度就可以计算酶活性的大小。
溶液A制剂AKP比活性（U/mg）
碱性磷酸酶提取、分离纯化时采用的各种技 术的原因
• 通过低温预冷处理有机溶剂分级提取兔肝碱性磷 酸酶，结合SDS PAGE法检测纯化结果。对酶的比 活力测定中蛋白定量经过对Bradford法和Folin Lowry法进行比较发现Folin Lowry法在本样品体系 中灵敏度高、抗干扰能力强，适合采用此法进行 蛋白含量测定。 • 盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫 酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克）， 并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用 的盐。福林-酚试剂显色法用来测定蛋白质浓度。
设计碱性磷酸酶的提百度文库、分离纯化 方案及采用每种技术的原因， 在分 离纯化过程中怎样检测纯度？
PPT制作：颜佩妮
PPT演讲：朱泉剑
资料收集：吴倩艳、宋琴琴
目录
碱性磷酸酶的概念
碱性磷酸酶的提取、分离、纯化 碱性磷酸酶的纯化程度鉴定
碱性磷酸酶提取、分离纯化时采用的各种技术 的原因
碱性磷酸酶的概念
碱性磷酸酶是动物和微生物界普遍 存在的一种含锌酶，它在物质代谢中 起着重要的作用。碱性磷酸酶能催化 几乎所有的磷酸单酯进行水解，产生 无机磷和相应的醇、酚或精，但却不 能水解磷酸H酿类 碱性磷酸酶广泛分布于人体各内 脏器官中，其中以肝脏为最多其次为 肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织。在 碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合 物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。
离子交换层析法的原理
• 阳离子交换膜可以看作是一种高分子电解质,他的 高分子母体是不溶解的,而连接在母体上的磺酸集 团带有负电荷和可解离离子相互吸引着,他们具有 亲水性。 • 由于阳膜带负电荷,虽然原来的解离正离子受水分 子作用解离到水中,但在膜外我们通电通过电场作 用,带有正电荷的阳离子就可以通过阳膜,而阴离子 因为同性排斥而不能通过,所以具有选择透过性。
常用的有机溶剂
• 乙醇:沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白 质、核酸、多糖等生物大分子的沉析. • 丙酮:沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范 围不广. • 正丁醇:能去除与pro结合的脂类物质，使pro溶解 在溶液中.
分离纯化 AKP步骤
称取新鲜兔肝（可使用猪肝）2g。
将1g新鲜兔肝置于70℃冰箱进行预先冷冻处理后取 出，置于玻璃匀浆器内。加入0.01mol/L醋酸镁、 0.01mol/L醋酸钠混合溶液3mL，充分研磨至糊状。
将匀浆液倒入刻度离心 管中，使用4ml上述混 合缓冲液冲洗研磨器具， 将冲洗液一并转入离心 管。离心管一定要置于 冰块保护下，以后各个 步骤也要注意保持低温。
加1mL正丁醇于匀浆原液中，用玻棒充分搅匀， 然后放置冰浴中20min。用滤纸过滤，滤液置于另 一支刻度离心管中。
过滤，滤液也要冰块保护
AKP的蛋白含量测定BCA法则
碱性 BCA试剂 • 蛋白质+Cu 2＋ Cu＋ 紫色化合物 • 利用分光光度计测吸光度 • 设计标准曲线计算蛋白质含量
• 1、AKP比活性：
每ml制剂中AKP活性单位数（U）
• AKP比活性（U/mg）=
每ml制剂中蛋白质含量（mg）
• 2、纯化倍数
• 纯化倍数 =
实验原理
1. 动物肝脏中含有丰富的碱性磷酸酶（AKP）。 2. 在正丁醇中脂类不溶而蛋白质溶解，可以借此除 去与酶结合的脂类（酶也是蛋白质）。 3. 有机溶剂分步沉淀法纯化
有机沉淀法
• 实验采用有机溶剂分步沉淀法,从兔肝中提取碱性 磷酸酶. AKP溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇 或50%丙酮中则形成沉淀。通过离心可以使AKP和 其他蛋白分离，从而得到纯化。 反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度的AKP。
滤液中加入等体积的冷丙酮，立即混匀后离心 2000r/min5min，弃去上清液。在沉淀中加入0.5mol/L 醋酸镁2mL用玻棒充分搅拌使其溶解，记录溶液体积。
立即混匀后使用台式低速离心机离心 5min(2000 r/min)，弃上清液。
向沉淀中加入4.0mL0．5mol/L 醋酸镁溶液， 充分搅拌使其溶解，同时记录悬液体积向上清 液中加入95％冷乙醇，使乙醇终浓度达60％， 混匀后立即离心5min(2500r/min)，弃上清。 向沉淀中加入4．0m1 0.0lmol/L 醋酸镁一 0.01mol/L 酸酸钠溶液，充分搅拌，使其溶解。 向上余悬液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮终浓度 达33％，混匀后离心5min(2000r/min)，弃去 沉淀
AKP纯化程度鉴定
• 纯化程度用酶的比活性反应。
• 酶比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。
碱性磷酸酶的活性测定 磷酸笨二钠法
• 在pH10环境中，AKP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸 氢二钠，苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素 原经铁氰化钾氧化生成红色醌亚衍生物。
• 测定红色衍生物的吸光度就可以计算酶活性的大小。