常用核酸探针标记方法

常用核酸探针标记方法

1、切口平移法（nick translation）

原理：先用适量的DNase I 在Mg2+存在下，在双链DNA 上打开若干个单链缺口。利用E. coli DNA 聚合酶I 的5'- 3' 核酸外切酶活性在切处将旧链从5’-末端逐步切除。同时DNA 聚合酶I的5'- 3'聚合酶活性的作用下，顺序将dNTP连接到切口的3’-末端-OH上，以互补的DNA 单链为模板合成新的DNA单链。

图1 切口平移法原理示意图

特点：1）各种螺旋状态（超螺旋、闭环及开环）及线性的双链DNA均可作为缺口平移法的标记底物。但单链DNA和RNA不能采用此方法进标记。双链DNA小片段（>100-200bp）也不是此法标记的理想底物。

2）DNA多聚酶必须是E·Coli DNA多聚酶的全酶。

3）DNA模板要用纯化过DNA

2、随机引物法（random priming）

原理：将待标记的DNA探针片段变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡核苷酸为引物，大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（E·Coli DNA polymerase I Klenow Fragment）的催化下，合成与探针DNA互补的DNA链。当反应液中含有标记的dNTP时，即形成标记的探针。

图2 随机引物标记法原理示意图

特点：1）除了能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA和RNA探针的标记。

2）所得到的标记产物是新合成的DNA单链，而所加入的DNA片段本身并不能被标记。

3）新形成的标记DNA单链的长度与加入寡核苷酸引物的量成反比，因为加入的寡核苷酸数量越多，合成起点也越多，得到的片段的长度也越短。按标准方法得到

的标记产物长度一般为200-400bp。

3、末端标记

与切口平移法和随机引物法不同，DNA末端标记法并不将DNA片段的全长进行标记，而是只将其一端（5’或3’端）进行部分标记。其特点是可得到全长DNA片段，DNA片段并非均匀标记，标记活性不高。

多种酶促反应可用于DNA的末端标记，如T4 DNA聚全酶、T4 多核苷酸激酶、末端脱氧核苷酰转移酶和Klenow DNA聚合酶等。以下是Klenow DNA 聚合酶进行3’-末端标记的示意图。

图3 用Klenow DNA 聚合酶进行3’-末端填充标记

——以上内容主要摘自《现代分子生物实验技术（第二版）》

佰而林生物科技有限公司技术服务部