蛋白质的定量分析：BCA法

较快 肽键和碱性Cu2＋形成
紫色络合物
BCA法广泛用于科研工作，其特点： 1、操作简便，快速 2、准确灵敏，试剂稳定性好 3、经济适用 4、抗试剂干扰能力较强，不受绝大部分样 品中的去污剂、尿素等化学物质的影响
思考
1、该实验设计及实验操作过程中，有没 有可改进的方法，如果有请说出你的想法？ 2、比较各种蛋白质定量分析方法的优缺 点，并思考各种方法的适用条件。
表1 BCA法测定蛋白质含量
管号 试剂（ mL ） 空白管 1 2 3
空白管？ 1-5 号管？ 4 5 测定管
0.4 0.1
—
标准蛋白溶液
（ ） 0.3mg/ml
—
0.1
0.2 0.3
—
0.3 0.2
—
0.5
— —
—
蒸馏水 待测样品
0.5 0.4
— —
—
0.5
BCA 工作液 蛋白质含量
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
ug
将上述各管混匀后于37°C保温30分钟，用562nm 波长比色测定吸 光度值。
？ 水浴锅
30
60
90
120
150
数据有改动
1、以牛血清蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐 标，绘制标准曲线。（有兴趣的同学可以学习excel中绘制
标准曲线）
2、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相应的蛋白 质含量M,再计算出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。
共轭双键
2、蛋白质的紫外吸收
蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸的特征性吸收峰
280nm 紫外线吸收法
3、蛋白质的呈色反应
茚三酮反应
双缩脲反应
氨基酸与茚三酮共热，氨基酸被氧化脱氨、脱羧，茚三酮被还 原，其还原物可与氨结合，再与另一分子的茚三酮缩合成蓝色的化合物，在570nm 处有最大吸收。
肽键 +CuSO4→紫、红色（540nm）
二.实验原理
蛋白质 + Cu2+
OH-
Cu+
+2BCA
螯合物（紫蓝色）
562nm
M待测 标准曲线法 A值 C待测
二.实验原理
562nm 紫蓝色
仪器型号:722型分光光度计
作图人:徐先林
时间:2012年9月11日
A
A待测
M待测
含量（ug）
BCA法测定蛋白质含量的标准曲线
三.实验操作
实验材料
1、器材 722型分光光度计、恒温水浴箱、移液管、试管 2、试剂 （1）试剂A:含1%BCA二钠盐、2%无水碳酸钠、0.16%酒 石酸钠、0.4%氢氧化钠、0.95%碳酸氢钠，将上述液体 混合后调pH至11.25。 （2）试剂B：4%硫酸铜。 （3）BCA工作液：试剂A100mL+试剂B2mL，混合。 （4）蛋白质标准液：0.3mg/mL的蛋白质标准液。 （5）待测样品。
• • • • • • •
每个小组(2个人)写一份结果和讨论 格式如下: 组员 名称 原始记录 实验结果 讨论
五.蛋白质定量分析方法
一
紫外吸收特性
二
凯氏定氮法
蛋白质元素组成特点
紫外线（UV）吸收法 双缩脲法 Folin-酚试剂法 考马斯亮蓝结合法 BCA法
三 四
呈色反应
五 六
方法
紫外线 吸收法 改良凯 氏定氮 双缩脲 法 Lowry 法
灵敏度 较低
低 低 高
时间 快速
原理
酪氨酸和色氨酸在 280nm的光吸收 用酸吸收后滴定
实验二
蛋白质定量分析：BCA法
主要内容
一.实验目的 二.实验原理
三.实验操作 四.注意事项 五.蛋白质定量分析方法
一.实验目的
1、学习BCA法测定蛋白质浓度的原理及操 作； 2、掌握722型分光光度计、移液管的正确 使用、试剂盘的正确摆放以及用标准曲线法 计算蛋白质的浓度；
3、了解蛋白质含量测定的多种方法。
C=
——
M
V
×250
实验结果记录
管号
空白管
1
2
3
4
5
测定管
M(ug)
吸光 值(A)
0
30 60
90
120
150
？
测定三次求平均值
四.注意事项
1、实验分组，两人一组 2、试剂盘的摆放：专管专用，防止污染 3、准确量取试剂，正确使用吸量管 4、正确操作722型分光光度计，此次由于溶 液体积较少，比色皿不需要待测溶液润洗 5、正确绘制标准曲线，标明名称、仪器、 作图人、时间等 6、实验原始记录书写规范，三线表
下次实验：血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 预习要点：
1、复习蛋白质两性解离。 2、预习电泳的基本原理。 3、预习实验操作流程及注意事项。
一、蛋白质的相关理论知识
1、元素组成（主要有C、H来自百度文库O、N、S ）
蛋白质的平均含氮量
16%
样品中蛋白质的含量=样品中氮含量 ÷16%（或×6.25）
凯氏定氮法
将蛋白质转化为氨，用酸吸收后滴定
OH-
双缩脲法 Lowry法 考马斯亮蓝结合反应（595nm） 考马斯亮蓝结合法 BCA法
Folin-酚试剂反应（650nm）
BCA(bicinchoninic acid,二辛可酸）
BCA分子式
BCA试剂盒
紫蓝 色
实验报告
每个大组一份完整的实验报告 名称 组员
【实验目的】 【实验试剂及仪器】 【实验原理】 【实验步骤】 原始记录 【实验结果】 【实验讨论】
干扰物 核苷酸
非蛋白 氮
硫酸铵； Tris缓冲液 某些氨基酸 甘氨酸 硫醇
费时 将蛋白氮转化为氨， 中速 肽键和碱性Cu2＋形成
紫色络合物
费时 双缩脲反应；酚试剂
被还原
考马斯 亮蓝法 BCA法
高
最高
快速 G-250与蛋白质结合物
在595nm的光吸值
强碱性缓冲 液 TritonX100;SDS
不受去污剂、 尿素等的影 响