脂肽生物表面活性剂产生菌的筛选
脂肽类生物表面活性剂生产菌株的筛选及鉴定
２ Ｂ ｌ ｇＰ ｔ ｃｅ ｃｌＢａｃ ，ＩＯ Ｅ ｏｐｒｔ ｎ Ｙ ｅａ ｇＨｕ ａ ，１０ ３ ａｉ ｅｏｈ ｍｉ ｒｎ ｈ ＳＮ Ｐ ＣＣ ｒｏａｏ ， ｕ ｙｎ ， ｎｎ４ ４ ０ ） ｎ ｒ ａ ｉ
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2-生物表面活性剂产生菌的筛选及培养条件优化
菌株 BS- 4 主要的生理生化特征 鉴定项目 氧化酶 精氨酸双水解酶 水解淀粉 接触酶 过氧化氢酶 鉴定结果 + + + +
-
鉴定结果 G + +
第2期
张
卉 , 等 : 生物表面活性剂产生菌的筛选及培养条件优化
295
2. 2 生物表面活性剂成分分析 由图 1 可知 , F T - IR 谱图 3 403 61 cm - 1 , 波段吸 收峰表明分子中有大量轻基存在 : 3 100~ 2 900 cm 波 段吸收峰是糖类 C H 的伸缩振动; 1 400~ 1 200 cm - 1 是C H 变角振动 ; 1 736 cm - 1 是 C
生物表面活性剂 ( Biosurfact ants, 简称 BS) 是微生物通过一定条件培养 , 在代谢过程中产生的具有 一定表界面活性的产物[ 1] , 是集亲水基和疏水基结构于一身的两亲化合物。产生生物表面活性剂的微 生物在自然界中比较常见有假单胞菌[ 2] 、 地衣芽孢杆菌 [ 3] 和热带假丝酵母[ 4] 等。而微生物产生的生物 表面活性剂包括许多不同的种类[ 5] , 糖脂、 脂肽、 多糖 - 脂类复合物、 磷脂、 脂肪酸和中性脂等。它们主 要是由利用碳氢化合物作为碳源的微生物产生, 并可以乳化这些碳源 , 以利于菌体的吸收 [ 6] 。与化学 合成的表面活性剂相比, 生物表面活性剂除具有降低表面张力、 乳化液和发泡稳定等特性外, 还具有无 毒、 可自然降解、 生态安全及高表面活性和生理活性优点。生物表面活性剂的特性决定了其在医药、 石 油工业、 化妆品、 洗涤剂、 环境工程和食品工业等领域的4 2 g, 去离子水定容至 1 L , pH 值为 7 2~ 7 4, 115
18 g, NaNO 3 2 g, Na 2H PO4 1 5 g, KH 2 PO 4 1 5 g, M gSO 4 0 1 g, FeSO 4 0 01 g, 去离子水定容至 1 L, pH 值 为 7 2~ 7 4, 115 灭菌 20 m in 。
一种快速分离检测产脂肽类生物表面活性剂枯草芽孢杆菌的方法
一种快速分离检测产脂肽类生物表面活性剂枯草芽孢杆菌的方法王大威;张健;姜伟;张凤久【摘要】脂肽(Lipopeptide)是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等微生物产生的一类具有较强表面活性的生物表面活性剂.枯革杆菌磷酸泛酰巯基转移酶基因(afp)是枯草芽孢杆菌中参与脂肽代谢的功能性基因.采用sfp基因PCR对从环境中得到的一组产生表面活性剂的微生物进行筛选,结合Tricine-SDS-PAGE电泳对PCR结果呈阳性的菌蛛的代谢粗初提物进行检测,初步鉴定得到两株枯草芽孢杆菌.进一步利用16S rDNA序列的系统发育学分析确定这两种菌株为枯草芽孢杆菌,并利用TLC、HPLC鉴定其产物为脂肽类表面活性剂,从而建立了一套快速分离检测产生脂肽类生物表面活性剂的枯草芽孢杆菌方法.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)009【总页数】5页(P142-146)【关键词】脂肽;枯草芽孢杆菌;sfp基因;Tricine-SDS-PAGE;电泳【作者】王大威;张健;姜伟;张凤久【作者单位】中海油研究总院,北京100027;海洋石油高效开发国家重点实验室,北京100027;中海油研究总院,北京100027;海洋石油高效开发国家重点实验室,北京100027;中国海洋石油总公司,北京100027;中国海洋石油有限公司,北京100027【正文语种】中文脂肽(Lipopeptide)又名脂酰肽(Acylpeptide)，是由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分组成的小肽，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，脂肽类生物表面活性剂显示了十分优良的特性，在医药、食品、化妆品、环境治理和微生物采油等领域都有广泛的应用[1] 。
大多数脂肽来源于微生物，而其中以来源于细菌的脂肽居多。
目前发现的脂肽类生物表面活性剂有10余种，主要包括Surfactin、Lichenysin、Iturin和Fengysin等[2] 。
脂肽类生物表面活性剂产生及鉴定
山东 食 品发 酵
脂肽 类生物 表 面活性 剂产生及鉴定
刘 飞’ 田延 军 胡 孝 丛 赵 祥 颖 刘建 军 ・杨 丽 萍
（ 山东农业大学食品科学与工程学院 泰安 ２ １１ ） １ ７ ０ ８ （ ２山东轻工业学院食品与生物工程学院 济南 ２ ０ ５ ） ５３ ３ （ 山东省食品发酵工程重点实验室 济南 ２ ０ １ ） ３ ５０ ３
ｔ ｅｄ ｔ ｃｉ ｎ ｍ ｅｈ ｄ ｆ ｈ ｐ ｐ ｐ ｉ ｅ ｈ ｅｅ ｔ ｔ ｏ ｓｏ ｅｌ ｏ ｅ ｔ ． ｏ ｔ ｉ ｄ
Ｋｅ ｒ ｓ Ｍ ｉｒ ｏ ｇ ｎｓ ； Ｌ ｐ ｐ ｐｉｅ ｄ ｓｒｍｉ ａｉｎ； ｃ ａａ ｔｒｚ ｔ ｎ ｙｗｏ ｄ ： ｃｏ ｒ ａ ｉｍ ｉｏ ｅ ｔ ； ｉｃｉ ｎ ｔ ｄ ｏ ｈ ｒｃｅｉａｉ ｏ
Ａｂ ｔａｃ ： Ｔｈ ｉ ｏ ｅ ｔｄ ｓｔ ｐ ｃ ｌ ｙ ｔ ｅ ｉｅ ｙ ｍ ｉｒ ｏ ｇ ｎ ｓ ｓｗｈ ｃ ｓ ａ ｍｐ ｒａ ｔｋ ｎ ｆ ｓｒ ｔ ｅ ｌｐ ｐ ｐ ｉ ｅ ｉ ｙ ｉａ ｌ ｓ ｎ ｈ ｓｚ ｄ ｂ ｃ ｏ ｒ ａ ｉｍ ｉｈ ｉ ｎ ｉ ｏ ｔｎ ｉ ｄ ｏ ｙ ｂｏ ｕ ｆｃａ ｔ， Ｔｈｓａｔ ｌ ａｎｙ ｉｔｏ ｕ ｅ ｐ ｐ ｐ ｉｅｐ ｏ ｕ ｉｇ ｓ ａｎ ｎ ｃｅ ｎｎ ｔｏ ｓａ ｄｒｖ ｅ ｉｓ ｒａ ｔｎ ｓ ｉ ｒ ｃｅｍ ｉｌ ｒ ｄ ｃ ｓｌ ｏ ｅ ｔ ｒ ｄ ｃｎ ｔ ｉｓａ ｄ ｓｒ ｅ ｉｇｍｅｈ ｄ ｎ ｅ ｉｗｓ ｉ ｎ ｉ ｄ ｒ
面 活性 剂 之一 。
自然 界 中 多 种 微 生 物 能 产 生 表 面 活 性 物
质 ， 如 酵 母 菌 、真 菌 、 细 菌 都 可 产 生 。 其 中 最
实验2 产表活菌的筛选
实验2 产表面活性剂菌株的筛选1.实验原理：菌种筛选包括富集、分离、初筛和复筛等几个步骤，挑选具有某种能力的有用菌种，根据不同的筛选目的，采用不同的筛选路线。
一般情况下，产表面活性剂的铜绿假单胞菌由于其土壤中广泛存在，生长迅速，糖脂产量高，非常容易筛选出来。
但由于铜绿假单胞菌是条件致病菌，芽孢杆菌具有很多优良特性，因此有意识地筛选芽孢杆菌显得更有意义。
芽孢耐热性较好，在沸水中水浴10min仍然能够存活，因此可以利用这一特性对芽孢杆菌进行初筛。
表面活性剂可以使红细胞破裂。
产表面活性剂的菌株在血琼脂平板上培养时，会形成溶血圈，溶血圈的大小与表面活性剂的产量往往成正比。
因此，可以利用血琼脂平板对产表面活性剂菌株进行初筛。
摇瓶发酵的微生物生物表面活性剂产量评价方法一般有排油圈法、表面张力法、比色法、液滴崩塌法等。
排油圈法比较简便，但不准确，可以进行初步评价筛选，然后再用表面张力法重新评价、确认。
在对培养基成份进行鉴定后，可用比色法进行精确的测定。
本次实验需6-9个课时。
2.实验材料2.1仪器设备电子天平、磁力搅拌器、高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、表面张力仪、培养箱、显微镜、冰箱、纯水机、移液枪等。
2.2试剂革兰色染色液、三氯甲烷、0.5M H2SO4等。
培养皿(洗净烘干)，150 mL三角瓶，250mL三角瓶，配套封口膜(配棉绳或橡皮筋)或硅胶塞若干，报纸一叠，15mL试管及配套硅胶塞(或试管帽、棉塞等)，玻棒，标签纸，记号笔(蓝、黑)，500mL、100mL、50mL烧杯，药匙，卫生纸，称量纸，pH试纸(5.8-9.0)，滴瓶(加1M NaOH溶液)，5mL刻度吸管等。
2.3培养基芽孢富集培养基（g/L）：可溶性淀粉3，蛋白胨10，酵母膏3，KH2PO4 1.5，K2HPO4 2，MgSO4 0.1，pH 7.4。
营养肉汤培养基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏5，NaCl 5 ，PH7.4。
肉胨培养基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏5，NaCl 5，pH 7.4。
产表面活性剂菌的筛选
什么是表面活性剂？
• 生物表面活性剂 ：是微生 • 表面活性剂：是指加入少 物在一定条件下培养时， 量能使其溶液体系的界面 状态发生明显变化的物质 。 在其代谢过程中分泌出的 具有一定表面活性的代谢 • 一种生物表面活性剂： 产物，如糖脂､多糖脂､脂 肽或中性类脂衍生物等。 除具有降低表面张力、稳 定乳化液和增加泡沫等相 同作用外，还具有一般化 学合成表面活性剂所不具 备的无毒、能生物降解等 优点。
3 注意事项 (1) 相同微生物在不同pH、温度等条件下产表面活性剂性能有差异，但是在中性及35℃ 左右具有最佳性能。 (2) 稀释平板法培养时，稀释倍数要适当，过大及过小均不利于高效分离菌种。 (3) 产生物表面活性剂菌不仅仅以石油为原料，还可利用植物油脂等为原料。
谢谢观赏!
2015.03
产生物表面活性剂菌的筛选
• 产表面活性剂菌多以石油为原料。因此， 在含石油废水中寻找目的菌。在中性pH及 常温下进行产表面活性剂菌的初步筛选。 之后，通过进行驯化试验，得到性能较高、 较稳定的菌.
ห้องสมุดไป่ตู้
具体实验步骤及实验材料：
1.实验材料 以油田磕头机旁油污土壤作为菌种分离土壤，取样后密封备实验使用。 2.培养基 （1）分离筛选培养基 无机盐培养基（g/l): K2HPO4.-3H2O 1.0 , KH2PO4 1.0 , MGSO4-7H2O 0.5, NH4NO3 1.0, CACL2 0.2 ,FECL3 少量，pH 7.5. 富集培养基 （g/l): 无机盐培养基 ，原油 2 pH7~ 7.5. 油平板（g/l) :无机盐培养基，原油2 琼脂20. （2）种子培养基 （g/l):葡萄糖20，蛋白胨5，酵母提取物3，NaCl5 pH 7.5. （3）降解液体培养基（g/l）：无机盐培养基，原油1. 2.实验步骤 （1）对石油降解菌进行富集与分离。取10g污染土壤加入100ml选择培养基中，30℃， 150r/min摇床振荡培养5天，吸取5ml上述选择培养基加入新鲜的富集培养基，连续转 接5次。 （2）取选择培养液采用稀释平板法进行分离。将培养液稀释后，取0.1ml培养液涂布于油 平板上，分离得到能够以原油为唯一碳源生长的微生物单菌落，挑取到LB斜面进行保 存。
16-产脂肽生物表面活性剂细菌的筛选及培养基优化 - 副本
参照《伯 杰 氏 系 统 细 菌 学 手 册 》, 对 菌 株 LB345进行生理生化鉴定 。
2
2
3
3
FeSO4 , %
2. 0 ×10 - 5 2. 5 ×10 - 5 3. 0 ×10 - 5
CaCl2 , % 酵母粉 , %
0. 04
0. 01
0. 08
0. 02
0. 12
0. 03
2 结果与分析
2. 1 菌株的筛选及鉴定 2. 1. 1 菌株的筛选结果
利用蓝色凝胶平板法和油平板法从土样中分 离出一株能产生物表面活性剂的细菌 。经排油圈 法初筛出排油圈直径达 5 cm 的菌株 ,又经乳化值 测定 ,乳化值可达 0. 56。最后经 TLC 薄层层析 , 茚三酮 - 丙酮显色实验结果为红色 ,确定为产脂 肽类生物表面活性剂细菌 ,命名为 LB345。 2. 1. 2 菌株的鉴定结果
将菌株接入发酵培养基 , 37 ℃、180 r∕ m in 培养 7 d,取直径 90㎜培养皿 ,加水 40 mL ,滴加 8 mL 豆油 ,待形成稳定油膜后加入 1 mL 发酵液于 油膜中心 ,测定排油圈直径 。 1. 3. 3 产脂肽菌株的复筛
无机盐培养基倒平板后 ,用石油醚稀释 10倍 原油涂布 ,将初筛的菌株划线接种于油平板上 , 37 ℃培养 9 d,挑选有噬油斑的菌落接种保藏 。
图 5 pH值对菌株 LB345脂肽产量的影响
脂肽初稿
脂肽类生物表面活性剂研究进展沈玉江（大庆华理能源生物技术有限公司，大庆163000）摘要：脂肽是由微生物代谢产生的一类具有很强表面活性的生物表面活性剂，在医药、食品、化妆品和微生物采油等方面有良好的应用潜力。
本文对脂肽的筛选、评价、提取、应用及展望等方面进行了综述。
关键词：微生物代谢产物脂肽生物表面活性剂中图分类号：TQ016 文献标识码：A 文章编号：Progress of Lipopeptide BiosurfactantsAbstract: The lipopeptide typically synthesized by microorganisms which is an important kind of biosurfactants,and it has a great potential in pharmaceutics,foods,cosmetic,oil recovery and many other fields.This paper reviews lipopeptide-producing,isolation and identification of the lipopeptide and its applications.Key words:Miroorganism Metabolite Lipopeptde Biosurfactant生物表面活性剂可分为6大类：糖脂类、脂肽/脂蛋白类、磷脂类、脂多糖-蛋白复合物、脂肪酸和中性脂。
脂肽类生物表面活性剂是微生物代谢产生的一类重要化合物，具有化学合成品很难具有的独特的两亲性分子结构，由亲水的肽链和亲油的脂肪烃链两部分组成。
脂肽类生物表面活性剂不仅具有高效、低毒、无污染等优点，而且可以生物降解为无害产物，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，脂肽类生物表面活性剂在医药、食品、化妆品及微生物采油等领域有重要的应用前景，已成为研究开发的热点。
生物表面活性剂产生菌的筛选及表面活性剂稳定性研究_牛明芬
生物表面活性剂产生菌的筛选及表面活性剂稳定性研究*牛明芬1,2李凤梅2韩晓日1郭书海2**牛之欣2 冷延慧2 张春桂2(1沈阳农业大学土地与环境学院,沈阳110161;2中国科学院沈阳应用生态研究所,沈阳110016)摘 要 大庆油田油泥样品经富集培养,平板分离,获得52株菌。
排油性实验和表面张力测定表明,菌株B 22、B 24、B 25产生的表面活性剂表面活性稳定,表面张力较低。
温度、pH 和N aCl 浓度实验证实,细菌B 22产生的生物表面活性剂可耐受120 高温,另2种生物表面活性剂可耐受80 ;3种细菌生物表面活性剂对pH 有广泛适应性,B 22pH 适应范围为4 0~13 0,B 24、B 25的pH 适应范围为2 0~13 0;Na Cl 浓度对表面活性剂的生物活性影响不大。
将3株菌的生物表面活性剂用于室内油泥处理实验,72h 石油去除率达70%以上。
关键词 表面张力,生物表面活性剂,油泥处理中图分类号 Q935 文献标识码 A 文章编号 1000-4890(2005)06-0631-04Isolation of biosurfactant producing microorganisms and their stability.N IU M ingfen 1,2,L I Feng mei 2,HAN X iaori 1,G UO Shuhai 2,N IU Zhix in 2,L EN G Yanhui 2,ZHAN G Chungui 2((1College of L and and Env ir on ment,S heny ang A gricultural U niver sity ,Shenyang 110016,China;2I nstitute of A p plied Ecology ,Chinese A cademy of Sciences ,Shenyang 110016,China).Chinese Jour nal of Ecology ,2005,24(6):631~634.52biosurfactant producing microo rganisms were isolated with the methods of enrichment culture and plate cultivation fro m o il sludge of Daqing Oil Field.Experiments of oil displacement activity and surface tension show ed that the three strains (including B 22,B 24and B 25)had high surface activity and lo w surface tension.T he analysis of physico chemical properties indicated that the biosurfactant produced by B 22could bear high temperatur e up to 120 ,while the ot her two could bear 80 .T he three biosur factants had a wide adapt ability to pH.B 22had a w ide adaptable pH rang e of 4.0~13.0,while that o f B 24and B 25was 2.0~13.0.Na Cl co ncentration had no obv ious effect on the biological activ ity of the biosurfactants.Employing the 3strains biosurfactants to treat oil sludge,more than 70%of the oil was removed after 72h.Key words sur face tension,biosur factants,oil sludg e.*国家重点基础研究发展规划项目(2004CB418500)、国家高技术研究发展计划前沿探索课题(2004AA649060)和中国科学院沈阳应用生态研究所知识创新工程资助项目(SLYQY0401)。
产生生物表面活性剂相关菌的分离及鉴定
关 键 词 ：生 物 表 面 活 性 剂 ；铅 ；生 物 有 效 态 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ： １ ０ － １ ６ ２ ０ ） １０ ３ —４ ０ ２３ ８ （ ０ ８ ０ －０ ４０
中 图 分 类 号 ：Ｓ ５ ． １４ ３
Ｉ ｏ ａ ｉ ｎ ａ ａ ａ ｔ ｒ ｚ ｔｏ ｏ ｏ’ｕ ｆ ｃ ａ ｔ ｐ ｏ ｕ ｉ ｃ ｅ ｉ ｓ ｌ ｔｏ ｎｄ Ｃｈ ｒ ｃ ｅ ｉ ａ ｉ ｆＢｉ 。 ｒ ａ ｔ ｎ － ｒ ｄ ｃ ｎｇ Ｂａ ｔ ｒ ａ ｓ ’
摘
要 ：对 北 京 东 三 岔 矿 区农 田土 壤 基 本 理 化 性 质 、重 金 属 含 量 和 可 培 养 微 生 物 数 量 进 行 调 查 ，并 筛 选 出 ６株
生 物 表 面 活 性 剂 产 生 菌 。结 果 表 明 ：该 矿 区 农 田土 壤 主 要 重 金 属 污 染 物 为 镉 和 铅 ，微 生 物 种 群 受 到 明 显 抑 制 ，
Ｎｅ Ｔｅ ｈ ｏｏ ｙｉ ｒｃ ｌｕ ａ ｐｉａ ｉｎ，Ｂｅ ｉｇ Ｕｎｖ ｒｉ ｆ ｒｃ ｌｕ ｅ ｗ ｃ ｎ ｌｇ ｎ Ａｇ ｉｕｔ ｒｌＡｐ ｌ ｔｏ ｃ ｉｎ ｉｅｓｔ ｏ ｊ ｙ Ａｇ ｉｕｔｒ ，Ｂｅ ｉｇ １ ２ ０ ｉｎ ０ ２ ６，Ｃｈｎ ） ｊ ｉａ
脂肽类生物表面活性剂微生物合成菌的筛选
龙源期刊网
脂肽类生物表面活性剂微生物合成菌的筛选作者：胡申才周焱富张宝
来源：《湖北农业科学》2009年第11期
摘要：对采集的16个样品经富集培养和平板分离，共获得122株菌株。
采用排油活性法和表面张力测定法筛选出5株产表面活性剂的优良菌株，均能将发酵液表面张力降低到40，
0mN/m以下，其中一株假单胞茼H0591菌株将发酵液表面张力下降到了32.2mN/m。
该菌产生的表面活性剂具有良好的酸碱稳定性和耐温性，且显示出了很强的抗真菌活性。
薄层色谱(TLc)后通过茚三酮显色分析表明该表面活性剂为脂肽类化合物，
关键词：生物表面活性剂；微生物筛选；脂肽
中图分类号：093—331
文献标识码：A。
脂肽类生物表面活性剂生产的研究_李媛
2.MedicalCollege, QingdaoUniversity, Qingdao266071, China)
Abstract:Cycliclipopeptideisakindofbiosurfactantsynthesized bymicroorganisms, whichiscomposedwith hydrophilicpeptide chain and hydrophobic fatty acid moieties. In addition to the classicalapplication as surfactant, they also have antibacterial, antifungal, antiviraland antitumoractivitybecause theyhave unique chemicalform and bola-amphiphle structure, which show wide application perspective. Thispapermainly reviewedthestrain, fermentationandproduction, andapplicationofthecycliclipopeptide. Keywords:lipopeptide;strain;fermentation;applicationperspective 中图分类号 :TS202.23 文献标识码 :A 文 章 编 号 :1002-0306(2008)011-0296-04
产生生物表面活性剂细菌的筛选以及生物表面活性剂结构的解析
产生生物表面活性剂细菌的筛选以及生物表面活性剂结构的解析生物表面活性剂是由微生物代谢产生的结构多样的表面活性剂,其中脂肽和糖脂是两类最重要的生物表面活性剂。
本文根据生物表面活性剂的特性,建立了一种高效快速准确的筛选产生物表面活性剂细菌方法。
并从油藏产出液中分离细菌,应用本文中建立的方法筛选出代谢产生生物表面活性剂的细菌,按照分子生物学的方法鉴定了细菌种属,并分析了代谢产生生物表面活性剂的结构。
生物表面活性剂在酸性条件下溶解度会降低。
通过酶标仪检测发酵液与酸反应后浊度的变化,确立了生物表面活性剂与酸反应的条件：三氯乙酸作为反应酸,用量100μL；发酵液用量50gL；反应时间30min从油藏产出液中分离到307株单菌,按照生物表面活性剂与酸反应的条件进行检测,筛选出目标微生物。
通过薄层色谱(TLC)和电喷雾质谱(ESI-MS)的方法分析发现其中有8株菌代谢产生脂肽,11株菌代谢产生鼠李糖脂。
通过16SrDNA的方法鉴定菌种,代谢产脂肽的细菌分别为苍白杆菌(Ochrobactrum sp)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),代谢产鼠李糖脂的细菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
结合GC-MS和MS/MS的方法,解析苍白杆菌代谢产生的脂肽结构：脂肽的脂肪酸部分包含iso C13、anteiso C13、isoC14、nC14、isoC15、anteisoC15、isoC16、和nC16β-羟基脂肪酸,脂肽的氨基酸部分都是由缬氨酸、亮氨酸、天门氨酸和谷氨酸组成；且含iso C13、anteiso C13、isoC14、nC14、isoC15和anteiso C15的脂肽的氨基酸序列都是N-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu-C,其结构与surfactin结构一致。
枯草芽孢杆菌代谢产生的脂肽的组成与苍白杆菌代谢产生的脂肽组成类似。
铜绿假单胞菌产生的糖脂是单鼠李糖脂RhaC8C10、单鼠李糖脂RhaC10C10和双鼠李糖脂RhaRhaC10C10的混合物。
脂肽初稿
脂肽类生物表面活性剂研究进展沈玉江（大庆华理能源生物技术有限公司，大庆163000）摘要：脂肽是由微生物代谢产生的一类具有很强表面活性的生物表面活性剂，在医药、食品、化妆品和微生物采油等方面有良好的应用潜力。
本文对脂肽的筛选、评价、提取、应用及展望等方面进行了综述。
关键词：微生物代谢产物脂肽生物表面活性剂中图分类号：TQ016 文献标识码：A 文章编号：Progress of Lipopeptide BiosurfactantsAbstract: The lipopeptide typically synthesized by microorganisms which is an important kind of biosurfactants,and it has a great potential in pharmaceutics,foods,cosmetic,oil recovery and many other fields.This paper reviews lipopeptide-producing,isolation and identification of the lipopeptide and its applications.Key words:Miroorganism Metabolite Lipopeptde Biosurfactant生物表面活性剂可分为6大类：糖脂类、脂肽/脂蛋白类、磷脂类、脂多糖-蛋白复合物、脂肪酸和中性脂。
脂肽类生物表面活性剂是微生物代谢产生的一类重要化合物，具有化学合成品很难具有的独特的两亲性分子结构，由亲水的肽链和亲油的脂肪烃链两部分组成。
脂肽类生物表面活性剂不仅具有高效、低毒、无污染等优点，而且可以生物降解为无害产物，由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，脂肽类生物表面活性剂在医药、食品、化妆品及微生物采油等领域有重要的应用前景，已成为研究开发的热点。
产表面活性剂解烃菌的筛选及其发酵条件优化
产表面活性剂解烃菌的筛选及其发酵条件优化摘要：为了获得产表面活性剂解烃菌，经血平板筛选和发酵液排油活性测定，从新疆石油污染土壤中分离出1株能产生物表面活性剂的石油降解菌B-1。
通过形态和生理生化特征分析，初步鉴定该菌为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。
通过产量指标对菌株B-1 产生物表面活性剂的条件进行优化，确定其最适发酵条件为：pH值7.5、温度30 ℃、盐浓度5 g/L，在此条件下，生物表面活性剂产量可达1.76 g/L。
薄层色谱分析结果表明，B-1产脂肽、脂蛋白类生物表面活性剂，可将发酵液表面张力从68.20 mN/m降低到31.70 mN/m，乳化指数（E24）达到92.80%。
关键词：石油降解菌；生物表面活性剂；表面张力；发酵条件中图分类号：S182文献标志码：A文章编号：1002-1302（2015）11-0437-03收稿日期：2014-11-17基金项目：新疆石河子大学优秀青年项目（编号：2012ZRKXYQ10）。
作者简介：杨乐（1980―），女，河南南阳人，硕士，讲师，从事环境污染修复研究工作。
E-mail：yl_shzu@。
生物表面活性剂是微生物在一定条件下分泌的胞外或者膜结合型的具有表面活性的两性化合物，具有降低表面张力、稳定乳化液等特性。
由于微生物的差异性，其代谢产生的表面活性剂具有多样的化学结构，包括脂肽、糖脂、磷脂、脂肪酸、中性脂质和聚合类生物表面活性剂[1-2]。
与化学合成的表面活性剂相比，生物表面活性剂低毒，可生物降解，能适应极端环境，具有更好的选择性和专一性、环境友好性等优点，因而越来越受到人们的青睐，在社会生产和生活各领域具有广泛的应用前景[3-4]。
碳氢化合物是导致环境退化的主要污染物，具有一定的毒性和疏水性，在土壤环境中难以自然降解，给生态安全和生物健康带来了巨大风险。
大量研究表明，生物表面活性剂通过乳化作用和降低油水界面张力，对疏水性石油烃具有增溶作用，提高了石油烃的可生物利用性，进而加快油污土壤的修复过程[5-8]。
生物表面活性剂产生菌的筛选及其产表面活性剂的研究
生物表面活性剂产生菌的筛选及其产表面活性剂的研究生物与制药工程学院制药0901 许滋芸;生工0902 崔进;制药0901任莹莹;生工0901 何恒摘要：本研究从石油厂排污口、制药厂污水土地等受污染环境中采集大量受污土样，从中筛选出能产生生物表面活性剂的菌株，通过溶血圈直径大小评价表面活性剂产生菌产表面活性剂的能力，并通过排油活性法、表面张力法等方法测定所产的生物表面活性剂性能。
筛选到一株能产生较强生性能物表面活性剂的菌株，并对其所产表面活性剂种类进行了初步鉴定。
建立了一套较为完整可行的生物表面活性剂产生菌株的筛选及表面活性剂性能评价方案，为后续研究奠定了基础。
关键词：生物表面活性剂；受污土样；排油活性；表面张力；薄层层析。
ABSTRACT：In our research, we aimed to collect contaminated soil samples from oil—contaminated environment, then isolate the microorganisms that capable of producing SACs by steps including enrichment culture and hemolytic activity assay on blood agar plates, etc. Then evaluate their producing capability through the diameter of hemolytic zone, and performances of the SACs through oil displacement activity and surface tension method , and then assess the type of SACs by TLC. Eventually we found an effective strain of bio-surfactant producing bacteria and studied its chemical character. Moreover, a series of operative working system was established, which will found sound basis of our further research.Keywords:Surface active compounds；contaminated soil ；oil displacement activity；surface tension；TLC.前言：生物表面活性剂己有20多年的发展历史，人们对产生生物表面活性剂的微生物及其产生机理有了较多的认识。
表面活性剂降解菌的筛选
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表 面活性剂 降解茵 的筛选
刘绍 霆
（ 辽宁省葫芦岛市连 山区环境保护局 ， 辽宁 葫芦岛 １ ２ ５ ０ ０ １ ）
摘 要： 从 多种材料 中筛选到 高效 Ｉ Ｊ Ａ ｓ降解茵 ５株 ， 分别为 Ｌ Ｏ１ 、 Ｌ ０ ２ 、 Ｌ ０ ５ 、 Ｌ ０ ６和 Ｌ Ｎ ２ ， 这些菌株在 分离培养基 中都能生长 ， 在 液体 培养基 ｑ － 由于降解 了Ｌ Ａ Ｓ ， 会使培养液的浑浊度 降低 。在加入 了 Ｌ Ａ Ｓ高效降解菌后 ， 对废水的 Ｃ Ｏ Ｄ去除率提 高到 ７ ０ ％以上 。 关键词 ： 表 面活性剂降解茵； 培养基 ； 筛选 ； 驯化
Ａ Ｓ降解 菌 。 １ ． ２ ． ２分 离 培养 基 ：富 集 培 养 基 中 的 Ｌ Ａ Ｓ改 为 ０ ． ０ ３ ｇ ， 以 是 高 效 Ｌ 由表 １ 可知 Ｌ Ｎ ２在分离培养基上能很好生长能 ， 能以 Ｌ Ａ Ｓ为唯 Ｎ Ｈ ４ Ｎ ０ ６ ｇ代替酵母膏 ， 其他成分不 变 ， 另加琼脂 ， 即为分 离培养 碳源 ， 但是 Ｌ ０ ６在分离 培养 基上不能生长 ， 但在发酵 培养基 中能 基。 很好 的生长并 降解 Ｌ Ａ Ｓ ， 这可能是 因为共代 谢作用 ， 当Ｌ ０ ６在利用 １ ． ２ ． ３ 发酵培养基 ： 同富集培养基 。 酵母膏生长的同时能降解 Ｌ Ａ Ｓ 。 １ ． ３菌种 的驯化与富集 ２ ． ４ Ｌ Ａ Ｓ降解菌对配制废水 的降解效果 取 １ ５ ０ ｍ Ｌ生活污泥加入到 １ Ｌ三角瓶 中，加入 ３ ５ ０ ｍ Ｌ富集 把 Ｌ ０ ６ 、 Ｌ Ｎ ２和 我 们 的 菌 种 在 Ｌ Ｂ培 养 基 中 混 合 扩 培 后 培养 基 ；取邯钢好氧池 污泥 、邯 钢菌液各 １ ５ ｍＬ分别加 入到 ２ ５ ０ ２ ０ ０ ｍＬ ） ， 加入连续装置 的好氧池 中 ， 好 氧池 有效容积为 １ ． ２ Ｉ ， 闷曝 ｍＬ三角瓶 中 ， 加入 ７ ５ ｍ Ｌ富集培养基 ； 取 四种 菌粉各 １ ｇ ， 分别 加 （ 进水流 量为 ２ ０ ０ ｍ Ｌ ／ ｈ ， 中间 回流 。实 验过程 入到 １ Ｌ三角瓶 中， 加入 ４ ０ ０ ｍＬ富集培养基 。１ ４ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ ３ ０ ｏ Ｃ摇 两 天后进配制 的废水 ， Ｈ在 ７ ． ０ 左 右 ，好 氧池 ｐ Ｈ在 ７ ． ２ ～ ７ ． ８之间 ，出水 ｐ Ｈ在 床 振荡培养 ３ ｄ ， 当观察到瓶 中泡 沫较少时 ， 静置后 弃去上清 液 ， 倒 中 ，进水 ｐ
生物表面活性剂产生菌的筛选·鉴定及其目标产物结构分析
生物表面活性剂产生菌的筛选鉴定及其目标产物结构分析徐鑫;刘娅;杨丽【摘要】[目的]筛选并鉴定生物表面活性剂,同时分析其目标产物结构.[方法]运用油平板法、排油圈法等方法对从葡萄中筛选出的72株菌株进行初筛与复筛,初步筛选出产生物表面活性剂的最佳菌株,对其进行菌种鉴定,并通过薄层层析试验、红外光谱分析等鉴定生物表面活性剂类型.[结果]从72株葡萄内生菌中分离筛选得到9株产生物表面活性剂的菌株,其中菌株C2J6发酵液排油圈为最大,通过形态特征、生理生化试验及26S rDNA序列分析,初步鉴定该菌为黑曲霉(Aspergillus niger).通过薄层色谱和红外光谱分析表明,菌株C2J6在代谢过程中能产生脂肽类表面活性物质.[结论]试验可为研究脂肽类生物表面活性剂的产生与应用打下基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2015(000)012【总页数】3页(P203-204,244)【关键词】生物表面活性剂;表面张力;脂肽;条件优化【作者】徐鑫;刘娅;杨丽【作者单位】石河子大学食品学院,新疆石河子832003;石河子大学食品学院,新疆石河子832003;石河子大学食品学院,新疆石河子832003【正文语种】中文【中图分类】S509生物表面活性剂(Biosurfactants，简称BS)是微生物等通过生物发酵，产生的具有亲水基与憎水基的有机大分子化合物［1］。
生物表面活性剂的结构相对于化学表面活性剂的种类与结构更加复杂。
生物表面活性剂一般分为五大类，包括糖脂、脂肽、脂蛋白、磷脂以及中类脂衍生物等［2］。
由于生物表面活性剂具有很多功能特点，广泛应用于医药、农业、化妆品、食品工业、石油工业和生物环境修复等领域［3－4］。
相对于化学合成的表面活性剂，生物表面活性剂在食品行业中有着尤为突出的优势。
由于生物表面活性剂对于食品具有无毒或低毒、容易被生物降解、附着控制与阻止微生物大量滋生等优点［5－6］，近年来，在食品行业中对生物表面活性剂的研究日益增多。
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丁立孝：男，1965年生，博士，副教授。
E-mail:<lixiaoding65@>.收稿日期：2003-05-19接受日期：2003-10-15农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12(3):330~333·研究论文·脂肽生物表面活性剂产生菌的筛选丁立孝1何国庆1刘晔2李海军2林建强2（1.浙江大学食品科学与营养系，杭州310029；2.山东大学微生物技术国家重点实验室，济南250100）摘要:从220个采自大庆油田和胜利油田的油土样和油水样中，经富集培养，血平板和油平板分离，液滴坍塌法、排油法和表面张力法进一步复筛，筛选出了8株产生物表面活性剂的优良菌株。
经过薄层层析(TLC)和红外光谱分析(FT-IR)鉴定，有4株菌产脂肽表面活性剂，其中59号菌株最好，其表面活性剂可以把表面张力降到31mN/m 而且具有良好的乳化活性。
关键词:生物表面活性剂；微生物；筛选方法；脂肽Isolation and Screening of Microbe Producing Lipopeptide SurfactantDING Li-Xiao 1HE Guo-Qing 1LIU Ye 2LI Hai-Jun 2LIN Jian-Qiang 2（1.Department of Food Science and Nutrition,Zhejiang University,Hangzhou 310029,China;2.State Key Laboratory of Microbial Technology ,Shandong University,Jinan 250100,China）capable of producing biosurfactants could be isolated by a series of step including enrichment culture,hemolytic activity assay on blood agar plates,hydrolyzing oil activity assay on oil agar plates and oil displacement activity etc.Then the fermentation supernatant of first-isolated strains was secondly screened by a drop-collapsing method and surface tension method.Eight strain bacteria were isolated with higher surface activity from 220samples of oil-contaminated soil and water collected from Daqing Oil Field and Shengli Oil Field.The results of TLC and IR analysis showed that biosurfactant of four strain bacteria was lipo-peptide and strain 59was the best one amongthem.biosurfactant;microorganism;screening method ;lipopeptide微生物在一定条件下培养时，其代谢过程中分泌产生的一些具有一定表/界面活性，集亲水基和疏水基结构于一分子内部的两亲化合物，称为生物表面活性剂（biosurfactants ）[1]。
生物表面活性剂与化学合成表面活性剂性能相似，具有降低表面张力、稳定乳化液和发泡等功能，但相比之下，还有许多有利之处[2]：①可生物降解，不会造成再污染；②无毒或低毒；③一般不致敏和可消化，因此可用于化妆品、食品的添加剂；④可以从工业废物中生产，用于生物环境治理；⑤具有更好的环境相容性，更高的起泡性，在极端温度、pH 和盐浓度下的更好选择性和专一性；⑥结构多样，有可能适用于特殊领域。
随着现代生物技术的迅猛发展以及生物表面活性剂在环保、石油开采、医药、食品加工等方面的潜在应用价值的研究，已引起人们对在工业规模上用生物技术生产表面活性剂的强烈兴趣[3]。
生物表面活性剂是20世纪70年代后期国际生物工程领域中发展起来的一个新课题。
由于这些特点，生物表面活性剂的研究日益增多，并可能替代化学合成的表面活性剂。
许多种类表面活性剂可由微生物产生，生物表面活性剂可分为6大类[4]：糖脂类、脂肽/脂蛋白类、磷脂类、脂多糖-蛋白复合物、脂肪酸和中性脂等。
本研究主要介绍筛选产生脂肽生物表面活性剂菌株的各种方法，以及生物表面活性剂的测定分析，为生物表面活性剂的研究和生产奠定基础。
1材料和方法1.1筛选材料1.1.1筛选样品取自大庆油田和胜利油田被石油长期污染的油土样和油水样共220个样品。
1.1.2富集培养基（%）葡萄糖2，硫酸铵0.1，硝酸钠0.2，硫酸镁0.03，磷酸二氢钾1，磷酸氢二钠第3期丁立孝等:脂肽生物表面活性剂产生菌的筛选0.4，酵母粉0.05。
1.1.3血平板培养基（%）牛肉膏0.3，蛋白胨1，酵母粉0.01，氯化钠0.5，琼脂粉1.6，羊血8。
1.1.4斜面培养基，LB培养基[5]。
1.1.5摇瓶培养基，同富集培养基。
1.2菌株筛选和培养1.2.1富集培养将油水样和油土样按3%的接种量分别接种到富集培养基中，180r/min，37℃条件下振荡培养3d。
1.2.2血平板筛选利用生物表面活性剂能够溶血的特性[6]，将富集培养液用划线和涂布分离方法接种于血平板上，37℃培养24~48h，挑选溶血好的单菌落接种斜面上，作进一步研究。
1.2.3油平板筛选油平板制作方法是利用去掉碳源后的固体富集培养基倒平板，然后在其上加上一张已灭菌的并均匀浸有原油的粗滤纸，把富集的培养液划线接种于以原油为唯一碳源的油平板上，37℃保温保湿培养5~7d。
只有产生表面活性剂能够乳化碳氢化合物的菌株才能吸收利用石油形成噬油斑。
挑选出有噬油斑的菌落接种于斜面上作进一步研究。
1.2.4摇瓶培养将初筛的菌株接种于摇瓶培养基中，180r/min，37℃振荡培养3d，发酵液离心后进行复筛和表面活性的测定。
1.3表面活性测定1.3.1生物表面活性剂排油活性测定取一培养皿，加蒸馏水，水面上加上0.1mL正十六烷烃形成油膜。
在油膜中心加摇瓶发酵液，中心油膜被挤向四周形成一圆圈，圆圈直径与表面活性剂含量成正比。
圆圈直径大于9cm的菌株保留作进一步的研究。
1.3.2液滴坍塌法测定，利用96孔板的盖进行实验(每孔内径8mm，高约0.25mm，Biolog，Hayward，California)，具体操作见文献[7]。
1.3.3表面张力的测定采用环法测定表面张力，仪器为JzhY1-180型界面张力仪（河北省承德实验机厂）。
1.3.4生物表面活性剂乳化性能测定取一试管，加5mL煤油和5mL表面活性剂溶液（浓度与原发酵液相同），用XSC-200-1型超声波发生器（上海东亚仪器厂）于800W处理40s，在不同时间测量乳化液和油相体积。
1.4生物表面活性剂的化学结构分析1.4.1薄层层析（TLC）分析取1mL发酵液离心，上清液用氯仿/甲醇（2/1,V/V）抽提后进行薄层层析，展层剂为氯仿/甲醇/水（65/15/2,V/V/V）。
显色剂为：（1）苯酚-硫酸试剂：3g苯酚和5mL浓硫酸溶于95mL乙醇中，糖脂显棕色斑点。
（2）钼酸铵-高氯酸显色剂：磷脂显色剂，参见文献[8]。
（3）茚三酮显色剂：0.5%无水丙酮溶液。
脂肽显红色。
1.4.2红外光谱（FT-I R）分析把提取的纯品生物表面活性剂用KBr压片法测红外吸收光谱(仪器为NICOLET NEXUS470FT-IR SPECTROMETER)。
2结果和分析2.1菌株筛选结果从220个油水样品和油土样品中，经富集培养，血平板和油平板分离以及斜面培养获得约650株菌株。
通过3次摇瓶培养，对发酵液用液滴坍塌法、排油活性和表面张力测定法进行复筛，得到了表面活性稳定，排油直径大于9cm，表面张力较低菌株8株（表1）。
而且这些菌株都是细菌，经初步鉴定[9]，其中3株是芽孢杆菌属（sp.），4株是假单胞菌属(sp.)，1株是节杆菌属(sp.)。
从表1可以看出，59号菌株可以把培养基的表面张力从56mN/m降低到31mN/m，它在血平板和油平板上形成的溶血斑和噬油斑见图1和图2。
2.2生物表面活性剂TLC分析为了对经过初筛和复筛获得的菌株所产的表面活性剂进行初步鉴别，首先对8株菌的发酵液做TLC分析，结果见表2。
从表2中可以看出，其中3表1生物表面活性剂产生菌的筛选结果Table1The isolation of microorganisms producing biosurfactants株编号种类排油圈直径/cm表面张力/mN·m-1液滴坍塌时间/s Strain No.Type Diameter Surface tension Drop-collapsing time 22110.632.712.559＞1231.09.6 1099.836.615.2 11611.232.213.6 5269.534.214.8 42910.233.512.3 2179.634.816.0789.238.116.2331农业生物技术学报2004年株芽孢杆菌产脂肽表面活性剂，4株假单胞菌产糖脂表面活性剂，1株节杆菌也产糖脂表面活性剂。
图1.59号菌株在血平板上形成的溶血斑Fig.1.Hemolytic zone of biosurfactant from strain59on blood agar plate图2.59号菌株在油平板上形成的噬油斑Fig.2.Hydrolyzing oil spot of biosurfactant from strain 59onoil agar plate表2生物表面活性剂TLC 结果Table 2The TLC results of biosurfactants2.3生物表面活性剂FT -IR 分析从以上实验结果可以看出，59号菌株是一株理想的研究菌株，因此下面以该菌株为例进行了生物表面活性剂的提取纯化，对其发酵液中脂肽表面活性剂的提取和纯化见文献[10]。
用真空干燥的纯品进行FT-IR 分析（图3），在IR 谱图上，3311.00cm -1是由分子链间氢键引起的NH 伸缩振动，3070.83cm -1是NH 基团的分子内氢键引起的NH 伸缩谱带，1652.18cm -1及1538.98cm -1分别为酰胺谱带Ⅰ和Ⅱ。