脂肽生物表面活性剂产生菌的筛选

丁立孝：男，1965年生，博士，副教授。E-mail:.收稿日期：2003-05-19接受日期：2003-10-15

农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12(3):330~333

·研究论文

·脂肽生物表面活性剂产生菌的筛选

丁立孝1何国庆1刘晔2李海军2林建强2

（1.浙江大学食品科学与营养系，杭州310029；2.山东大学微生物技术国家重点实验室，济南250100）

摘要:从220个采自大庆油田和胜利油田的油土样和油水样中，经富集培养，血平板和油平板分离，液滴坍塌法、排油法和表面张力法进一步复筛，筛选出了8株产生物表面活性剂的优良菌株。经过薄层层析(TLC)和红外光谱分析(FT-IR)鉴定，有4株菌产脂肽表面活性剂，其中59号菌株最好，其表面活性剂可以把表面张力降到31mN/m 而且具有良好的乳化活性。

关键词:生物表面活性剂；微生物；筛选方法；脂肽

Isolation and Screening of Microbe Producing Lipopeptide Surfactant

DING Li-Xiao 1HE Guo-Qing 1LIU Ye 2LI Hai-Jun 2LIN Jian-Qiang 2

（1.Department of Food Science and Nutrition,Zhejiang University,Hangzhou 310029,China;2.State Key Laboratory of Microbial Technology ,Shandong University,Jinan 250100,China

）

capable of producing biosurfactants could be isolated by a series of step including enrichment culture,

hemolytic activity assay on blood agar plates,hydrolyzing oil activity assay on oil agar plates and oil displacement activity etc.Then the fermentation supernatant of first-isolated strains was secondly screened by a drop-collapsing method and surface tension method.Eight strain bacteria were isolated with higher surface activity from 220samples of oil-contaminated soil and water collected from Daqing Oil Field and Shengli Oil Field.The results of TLC and IR analysis showed that biosurfactant of four strain bacteria was lipo-peptide and strain 59was the best one among

them.

biosurfactant;microorganism;screening method ;lipopeptide

微生物在一定条件下培养时，其代谢过程中分

泌产生的一些具有一定表/界面活性，集亲水基和疏水基结构于一分子内部的两亲化合物，称为生物

表面活性剂（biosurfactants ）[1]

。生物表面活性剂与

化学合成表面活性剂性能相似，

具有降低表面张力、稳定乳化液和发泡等功能，但相比之下，还有许多有利之处[2]：①可生物降解，不会造成再污染；②无毒或低毒；③一般不致敏和可消化，因此可用于化妆

品、食品的添加剂；④可以从工业废物中生产，

用于生物环境治理；⑤具有更好的环境相容性，更高的起泡性，在极端温度、pH 和盐浓度下的更好选择性和专一性；⑥结构多样，有可能适用于特殊领域。随着现代生物技术的迅猛发展以及生物表面活性剂在环保、石油开采、医药、食品加工等方面的潜在应用价值的研究，已引起人们对在工业规模上用生物技术生产表面活性剂的强烈兴趣[3]。生物表面活性剂是

20世纪70年代后期国际生物工程领域中发展起来

的一个新课题。由于这些特点，生物表面活性剂的研究日益增多，并可能替代化学合成的表面活性剂。

许多种类表面活性剂可由微生物产生，生物表

面活性剂可分为6大类[4]：糖脂类、

脂肽/脂蛋白类、磷脂类、脂多糖-蛋白复合物、脂肪酸和中性脂等。本研究主要介绍筛选产生脂肽生物表面活性剂菌株的各种方法，以及生物表面活性剂的测定分析，为生物表面活性剂的研究和生产奠定基础。

1材料和方法

1.1筛选材料

1.1.1筛选样品取自大庆油田和胜利油田被石油长期污染的油土样和油水样共220个样品。

1.1.2富集培养基（%）葡萄糖2，硫酸铵0.1，硝

酸钠0.2，硫酸镁0.03，磷酸二氢钾1，磷酸氢二钠

第3期丁立孝等:脂肽生物表面活性剂产生菌的筛选

0.4，酵母粉0.05。

1.1.3血平板培养基（%）牛肉膏0.3，蛋白胨1，酵母粉0.01，氯化钠0.5，琼脂粉1.6，羊血8。

1.1.4斜面培养基，LB培养基[5]。

1.1.5摇瓶培养基，同富集培养基。

1.2菌株筛选和培养

1.2.1富集培养将油水样和油土样按3%的接种量分别接种到富集培养基中，180r/min，37℃条件下振荡培养3d。

1.2.2血平板筛选利用生物表面活性剂能够溶血的特性[6]，将富集培养液用划线和涂布分离方法接种于血平板上，37℃培养24~48h，挑选溶血好的单菌落接种斜面上，作进一步研究。

1.2.3油平板筛选油平板制作方法是利用去掉碳源后的固体富集培养基倒平板，然后在其上加上一张已灭菌的并均匀浸有原油的粗滤纸，把富集的培养液划线接种于以原油为唯一碳源的油平板上，37℃保温保湿培养5~7d。只有产生表面活性剂能够乳化碳氢化合物的菌株才能吸收利用石油形成噬油斑。挑选出有噬油斑的菌落接种于斜面上作进一步研究。

1.2.4摇瓶培养将初筛的菌株接种于摇瓶培养基中，180r/min，37℃振荡培养3d，发酵液离心后进行复筛和表面活性的测定。

1.3表面活性测定

1.3.1生物表面活性剂排油活性测定取一培养皿，加蒸馏水，水面上加上0.1mL正十六烷烃形成油膜。在油膜中心加摇瓶发酵液，中心油膜被挤向四周形成一圆圈，圆圈直径与表面活性剂含量成正比。圆圈直径大于9cm的菌株保留作进一步的研究。

1.3.2液滴坍塌法测定，利用96孔板的盖进行实验(每孔内径8mm，高约0.25mm，Biolog，Hayward，California)，具体操作见文

献[7]。

1.3.3表面张力的测定采用环法

测定表面张力，仪器为JzhY1-180型

界面张力仪（河北省承德实验机

厂）。

1.3.4生物表面活性剂乳化性能测

定取一试管，加5mL煤油和5mL

表面活性剂溶液（浓度与原发酵液相

同），用XSC-200-1型超声波发生器

（上海东亚仪器厂）于800W处理

40s，在不同时间测量乳化液和油相体积。

1.4生物表面活性剂的化学结构分析

1.4.1薄层层析（TLC）分析取1mL发酵液离心，上清液用氯仿/甲醇（2/1,V/V）抽提后进行薄层层析，展层剂为氯仿/甲醇/水（65/15/2,V/V/V）。显色剂为：（1）苯酚-硫酸试剂：3g苯酚和5mL浓硫酸溶于95mL乙醇中，糖脂显棕色斑点。（2）钼酸铵-高氯酸显色剂：磷脂显色剂，参见文献[8]。（3）茚三酮显色剂：0.5%无水丙酮溶液。脂肽显红色。

1.4.2红外光谱（FT-I R）分析把提取的纯品生物表面活性剂用KBr压片法测红外吸收光谱(仪器为NICOLET NEXUS470FT-IR SPECTROMETER)。

2结果和分析

2.1菌株筛选结果

从220个油水样品和油土样品中，经富集培养，血平板和油平板分离以及斜面培养获得约650株菌株。通过3次摇瓶培养，对发酵液用液滴坍塌法、排油活性和表面张力测定法进行复筛，得到了表面活性稳定，排油直径大于9cm，表面张力较低菌株8株（表1）。而且这些菌株都是细菌，经初步鉴定[9]，其中3株是芽孢杆菌属（sp.），4株是假单胞菌属(sp.)，1株是节杆菌属(sp.)。从表1可以看出，59号菌株可以把培养基的表面张力从56mN/m降低到31mN/m，它在血平板和油平板上形成的溶血斑和噬油斑见图1和图2。

2.2生物表面活性剂TLC分析

为了对经过初筛和复筛获得的菌株所产的表面活性剂进行初步鉴别，首先对8株菌的发酵液做TLC分析，结果见表2。从表2中可以看出，其中3

表1生物表面活性剂产生菌的筛选结果

Table1The isolation of microorganisms producing biosurfactants

株编号种类排油圈直径/cm表面张力/mN·m-1液滴坍塌时间/s Strain No.Type Diameter Surface tension Drop-collapsing time 22110.632.712.5

59＞1231.09.6 1099.836.615.2 11611.232.213.6 5269.534.214.8 42910.233.512.3 2179.634.816.0

789.238.116.2

331