银花平感颗粒体内抗甲型H1N1流感病毒作用

银花平感颗粒体内抗甲型H1N1流感病毒作用

为探讨银花平感颗粒（YHPG）体内抗甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）作用及其对流感病毒感染小鼠免疫功能的影响，采用滴鼻感染ICR小鼠建立流感病毒肺炎模型，感染后第3天和第7天测定各组动物肺指数并观察肺组织病理变化；采用实时荧光定量RTPCR和流式细胞技术，观察各组肺组织病毒载量以及外周血T细胞亚群（CD4+，CD8+，CD4+/CD8+）的变化。结果表明，YHPG（15，30 g·kg-1）剂量组在感染后第3天和第7天均能显著降低流感病毒感染小鼠肺指数和肺组织病毒载量，减轻肺组织病理变化，同时还可显著提高外周血CD4+ T 细胞水平和CD4+/CD8+比值，降低CD8+ T细胞水平。说明YHPG可抑制流感病毒复制、减轻流感病毒感染小鼠肺部损伤以及调节流感病毒小鼠免疫功能下降，对甲型H1N1流感病毒感染小鼠有一定的治疗作用。

标签：银花平感颗粒；甲型H1N1流感病毒；肺指数；肺部病理改变；病毒载量；免疫功能

[Abstract]To study the effect of Yinghua Pinggan granule （YHPG）against influenza A/H1N1 virus in vivo and on the immunologic function of infected mice The intranasal influenza virus infection was adopted in ICR mouse to establish the influenza virus pneumonia model At the 3rd and 7th day after the infection，the lung index and pathologic changes in lung tissues of mice were detected Realtime PCR and flow cytometry were employed to observe the virus load in lung tissues and the levels of CD4+，CD8+，and CD4+/CD8+ in peripheral blood The result showed that at the 3rd and 7th day after the infection，YHPG （15，30 g·kg-1）can significant decrease in the lung index and virus load in lung tissues of mice infected with influenza virus，alleviate the pathologic changes in lung tissues，significantly increase the levels of CD4+ and CD4+/CD8+ ratio and reduce the levels of CD8+ in whole blood This indicated that YHPG can inhibit the influenza virus replication，alleviate pulmonary damage and adjust the weak immunologic function of infected mice，with a certain therapeutic effect on mice infected by H1N1 virus in vivo [Key words]Yinghua Pinggan granule；influenza A/H1N1 virus；lung index；lung pathological changes；virus load；immunologic function

流感是一种由流感病毒引起的严重威胁着人类的呼吸道传染病，具有发病率高、流行广泛、传播迅速等特点[1]。流感病毒属于正粘科病毒，主要由甲型和乙型流感病毒引起，甲型流感病毒表面抗原HA和NA较易发生变异，甲型流感病毒又可分为15个HA亚型（H1～H15）和9个NA亚型（N1～N9），是引起流感流行最重要的病原体[2]。甲型流感病毒中H1N1型和H3N2型流感较为广泛，可造成大流行，由于流感病毒抗原性容易变异，新病毒株不断形成，现有的药物已很难满足临床需求。相比化学药，中药在防治流感方面表现出了独特的优势，具有副作用小和不易产生耐药性等优点，还能通过调节机体免疫功能而发挥抗病毒的作用[3]，筛选并开发抗流感病毒的中药研究工作有着广阔的前景。

银花平感颗粒（原名金平感颗粒）是由《伤寒论》麻黄汤等方药加减组成，主要由金银花、麻黄、杏仁、虎杖、甘草等组成，具有清热解毒，宣肺解表等功效，已获国家中药新药银花平感颗粒的国家发明专利（专利号ZL031511880）和中药新药证书（国药证字Z20120004）。前期研究表明银花平感颗粒具有抗炎、镇咳的作用[45]，而鸡胚实验显示银花平感颗粒对流感病毒有很好的抑制作用[6]。本研究基于前期研究成果，观察银花平感颗粒对流感病毒感染小鼠肺指数、肺部病理改变和肺组织病毒载量的影响，研究其体内抗甲型H1N1流感病毒作用；采用流式细胞仪检测外周血T细胞亚群（CD4+，CD8+，CD4+/CD8+）变化，探讨银花平感颗粒对流感病毒感染小鼠免疫功能的影响，为该药的临床应用提供理论和实践依据。

1材料

1.1药物与试剂银花平感颗粒（杭州华东医药集团康润制药有限公司，批号001106）；利巴韦林颗粒（四川百利药业有限责任公司，批号131165）；肝素钠（国药集团化学试剂有限公司，批号20131016）；RNeasy Mine Kit试剂盒（德国QIAGEN公司，批号74104）；PrimeScriptTM RT Master Mix（批号AK3101），SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒（批号AK5805）均购自TaKaRa公司；PE AntiMouse CD8a（批号3276860），FITC Hamster AntiMouse CD3e（批号3212522），PECyTM 5 Rat AntiMouse CD4（批号3228507）均购自美国BD公司。1.2动物ICR小鼠，SPF级，18～22 g，雄性，由浙江中医药大学动物实验研究中心提供，许可证号SCXK（沪）20080016。

1.3病毒甲型流感病毒小鼠肺适应株（A/PR 8/34，浙江省疾病预防与控制中心提供），鸡胚传代后，测定病毒效价1∶1 024。

1.4仪器BD FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）；MICROM HM340E 石蜡切片机（德国MICROM公司）；BX60型荧光显微镜摄像机（日本OLYMPUS 公司）；DHG9140A型电热恒温干燥箱（中国上海精宏医疗设备有限公司）；Leica HI120型摊片机（德国Leica公司）；ABI QuanStudio 12K Flex实时荧光定量RTPCR仪（美国Life Technologies）；NanoVue超微量分光光度计（美国GE Healthcare公司）；Forma ClassⅡ，A2生物安全柜（美国Thermo公司）。

2方法

2.1甲型流感病毒半数致死量（LD50）的测定将经鸡胚传代的甲型H1N1 A/PR/8/34流感病毒液稀释为原液，1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5的病毒液，每个稀释度10只小鼠。每只小鼠鼻孔内均匀滴入20 μL病毒液，感染小鼠。观察2周后，计算小鼠LD50。结果以ReedMuench法测定其半数致死量（LD50）为1×10-35。

2.2造模与给药ICR小鼠随机分为6组，分别为正常对照组，模型对照组，阳性对照组（利巴韦林，75 mg·kg-1），银花平感颗粒低、中、高剂量组（75，